梔子苷磷脂復合物的制備及評價

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(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

梔子苷(geniposide, GE)是茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)干燥成熟果實中提取精制而得的環(huán)烯醚萜苷類化合物，目前已證實梔子花根中也存在該物質[1].藥理研究表明：其具有降血糖[2]、抗炎鎮(zhèn)痛[3]、抗哮喘、防輻射及抗腫瘤[4-5]等功效.雖然梔子苷水溶性強，但是脂溶性弱，膜滲透性差，導致口服生物利用度低，限制了其藥效的發(fā)揮.磷脂復合物是從上世紀發(fā)展起來的一種新型制劑技術，是通過磷脂分子與活性成分在適宜的環(huán)境中發(fā)生相互作用，形成一種不同與原化合物的復合物.藥物形成復合物之后理化性質和生物學特性都會發(fā)生改變，脂溶性增強并顯著提高與生物膜的相容性，促進吸收，改善生物利用度[6].早前鄭琴等[7]雖然對梔子苷磷脂復合物也進行了研究，但僅僅著重于體外表征，體內并未作出評價.本實驗將梔子苷制備成磷脂復合物，優(yōu)化了制備工藝，并進行了鑒別、理化性質和大鼠模型口服生物利用度考察.

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

儀器：BS224S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；85-2型磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)；Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；17R型高速低溫離心機(美國Thermo公司).

試劑：梔子苷原料藥(質量分數為95%，寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司)；大豆磷脂(質量分數為60%，北京源華美磷脂科技有限公司，口服級)；梔子苷對照品(批號110749201115，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純.

1.2 實驗動物

SD大鼠，180～200g，雄性，購于浙江省醫(yī)學科學院，許可證SCXK(浙)2008-1033.

2 方法與結果

2.1 磷脂復合物的制備

稱取一定量的磷脂，用溶劑充分溶解后，加入梔子苷，磁力攪拌，反應一定時間后，減壓蒸發(fā)回收溶劑，真空干燥至呈淡黃色蠟狀固體即得.

將磷脂復合物加入適量氯仿，使其中的磷脂和磷脂復合物充分溶解，過濾，濾渣用少量氯仿潤洗后揮干，濾渣中殘留梔子苷即為未復合部分，測定未復合梔子苷質量濃度，復合率[8]計算公式為

式中：M0為初始投料量；Mt為未復合量.

2.2 磷脂復合物制備工藝條件優(yōu)化

2.2.1 磷脂復合物中梔子苷的質量濃度測定

色譜條件：色譜柱為Welchrom-C18(4.6×250 mm,5 μm)；流動相為20%乙腈水溶液；流速為1.0 mL/min；檢測波長為238 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL.

線性范圍：用甲醇配制質量濃度為5.75，11.5，23，46，92，184，368 μg/mL梔子苷對照品溶液，以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程Y=13.823X+9.681，R2=1，梔子苷在5.75～368 μg/mL范圍內線性關系好.

2.2.2 磷脂復合物工藝條件優(yōu)化

以復合率為評價指標，單因素考察確定梔子苷磷脂復合物制備工藝為：以無水乙醇為反應溶劑，m(梔子苷)∶m(磷脂)=1∶4，梔子苷質量濃度為16.7 mg/mL，40 ℃條件下反應1.5 h.三批驗證試驗平均復合率為99.19%，RSD為0.4%，表明按所優(yōu)化工藝制備的磷脂復合物復合率高，且工藝穩(wěn)定.

2.3 磷脂復合物的表征

2.3.1 紫外(UV)分析

將梔子苷、磷脂和梔子苷磷脂復合物分別溶于甲醇，進行紫外掃描，結果顯示，梔子苷與其復合物的紫外吸收曲線相同，均包含梔子苷和磷脂的特征吸收峰，表明梔子苷與磷脂形成復合物后發(fā)色團未發(fā)生變化，見圖1.

a—梔子苷磷脂復合物；b—梔子苷；c—磷脂圖1 各物質的的UV圖Fig.1 UV absorption spectra of different substances

2.3.2 紅外光譜(IR)特性

分別取梔子苷、磷脂、物理混合物、梔子苷磷脂復合物適量，采用KBr壓片法在400～4 000 cm-1的波長范圍內進行IR掃描分析，結果顯示，梔子苷的特征吸收峰為3 527.22 cm-1和3 437.98 cm-1(OH)，磷脂特征吸收峰為3 309.46 cm-1(OH)，2 925.9 cm-1和2 854.19 cm-1(CH)，1 736.27 cm-1(C=O)，1 220.55 cm-1(P=O)，磷脂與梔子苷混合物紅外吸收峰基本為磷脂和梔子苷的疊加，而磷脂復合物在3 341.46 cm-1處形成較寬大的OH吸收峰且與梔子苷相比向低場方向移動，推測梔子苷與磷脂分子間有氫鍵形成，見圖2.

圖2 各物質的紅外譜圖Fig.2 IR absorption spectra of different substances

2.3.3 差示掃描量熱法(DSC)

稱取適量梔子苷、磷脂和處方比例的物理混合物和復合物進行DSC掃描分析，掃描范圍為室溫至200 ℃，升溫速度為10 ℃/min，N2流速為100 mL/min，結果顯示梔子苷在162 ℃有特征吸熱峰，混合物中仍可見梔子苷以及磷脂的特征吸熱峰，復合物中梔子苷特征峰消失，但是在108 ℃下出現一明顯吸熱峰，推測梔子苷與磷脂形成了復合物過程中發(fā)生了相互作用，其熱力學性質發(fā)生了改變，見圖3.

A—梔子苷；B—磷脂；C—物理混合物；D—磷脂復合物圖3 各物質的DSC圖譜Fig.3 DSC spectra of different substances

2.3.4 脂溶性考察

取過量梔子苷、物理混合物及復合物，加入適量正辛醇，超聲30 min，得到梔子苷、混合物及復合物的正辛醇過飽和溶液，以3 000 r/min離心10 min，測定上清液中梔子苷含量并計算溶解度.各物質在正辛醇溶解度：梔子苷為4.5 mg/mL，磷脂復合物為66.38 mg/mL，物理混合物為25.61 mg/mL.結果表明梔子苷在形成復合物之后在正辛醇中溶解度明顯提高，物理混合物中磷脂有一定的增溶作用但效果不如復合物，可見梔子苷與磷脂形成復合物之后脂溶性有較大提升，約為梔子苷的15倍.

2.4 梔子苷大鼠口服生物利用度考察

2.4.1 藥動學樣品制備

雄性SD大鼠24只，隨機分為4組，每組6只，實驗前禁食12 h，分別按100 mg/kg(以梔子苷計)灌胃給予梔子苷、梔子苷磷脂復合物，于給藥后10，20，30 min，1，1.5，2.5，4，6，8，12 h經眼底靜脈取血0.5 mL于肝素化離心管中，5 000 r/min離心10 min，取血漿200 μL于1.5 mL離心管中，加入800 μL甲醇，渦旋3 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液，氮氣吹干，100 μL甲醇復溶，10 000 r/min離心10 min，取上清液測梔子苷的質量濃度.

2.4.2 大鼠血漿樣品中梔子苷質量濃度測定

色譜條件：色譜柱為Welchrom-C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為12%乙腈水溶液；流速1.0 mL/min；檢測波長238 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL.在選定色譜條件下，溶劑及空白血漿對測定無干擾，見圖4.

圖4 梔子苷在血漿中的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of GE in plasma

方法學考察[9]：用甲醇配制質量濃度分別為0.32，0.8，1.6，4，8，20，40，100，200 μg/mL的系列梔子苷對照品溶液.取口服給藥組空白血漿200 μL，分別加入0.32，0.8，1.6，4，8，20 μg/mL梔子苷對照品溶液各50 μL，以血漿中梔子苷對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得回歸方程Y=52.77X+4.177 6，R2=0.999 5，表明血漿藥物質量濃度在0.08～5 μg/mL范圍內線性關系良好.取4，40，200 μg/mL質量濃度的對照品溶液加入空白血漿中，于一日內連續(xù)測定5次，連續(xù)測定5日，計算得日內和日間RSD均小于8.2%.另分別精密量取高、中、低質量濃度的對照品溶液加入空白血漿中，每組3份，測定梔子苷的質量濃度，結果顯示平均回收率分別為98.78%，104.76%，106.73%；RSD分別為4.51%，7.05%，1.44%.結果表明：該方法專屬性強，適用于大鼠血漿樣品中梔子苷質量濃度測定.

2.4.3 藥動學結果

兩組血藥質量濃度—時間曲線經DAS2.0統(tǒng)計擬合后，其結果見圖5，藥動學參數見表2.結果表明了梔子苷及復合物在大鼠體內符合一室模型.通過比較藥動學參數可知梔子苷形成復合物之后口服吸收最大濃度明顯提高、達峰時間明顯縮短，說明梔子苷形成磷脂復合物之后由于其脂溶性提高，吸收速率顯著提高，生物利用度為梔子苷的1.63倍.

圖5 口服給藥后大鼠平均血藥質量濃度—時間曲線圖Fig.5 Concentration-time curves of GE after ig adiministration of GE and GE-PLC

Table2Mainpharmacokineticparametersafterigadministrationinrats

藥動學參數1)梔子苷梔子苷磷脂復合物2)Ka/min-10.038±0.0390.199±0.191t1/2/min69.32±8.8363.66±9.24MRT/min121.10±18.9594.53±16.07Cmax/(mg·L-1)0.822±0.1481.79±0.26**tmax/min67.5±18.7227.5±45*AUC/(mg·L-1·min-1)137.80±34.88225.28±94.26*

注：1)Ka為吸收速率常數；t1/2為末端消除半衰期；MRT為平均滯留時間；Cmax為藥峰質量濃度；tmax為達峰時間；AUC為曲線下面積；2) 與梔子苷比較：*為P<0.05，**為P<0.01.

3 結 論

筆者在前人研究的基礎上，對梔子苷磷脂復合物的制備進行了工藝優(yōu)化，還利用大鼠模型進行了體內藥動學研究.采用溶劑揮發(fā)法制備梔子苷磷脂復合物，UV和IR分析結果均顯示出復合過程中并沒有新物質形成，DSC顯示梔子苷在與磷脂形成復合物之后其特征吸收峰消失，這一現象在混合物中并未出現，說明梔子苷在復合物中以無定型狀態(tài)存在，熱力學性質發(fā)生改變.形成復合物后，梔子苷脂溶性提高了約15倍，這可能是由于藥物與磷脂發(fā)生相互作用，屏蔽了藥物的極性基團，表現出脂溶性[10].藥動學研究表明：形成磷脂復合物后梔子苷的口服吸收明顯得到改善，tmax縮短、Cmax提高，這與其本身脂溶性提高的同時磷脂促進了梔子苷與細胞膜的結合密切相關[11].由此可見，梔子苷磷脂復合物的研究可為梔子苷高效口服制劑的開發(fā)提供研究基礎，同時磷脂復合物也可為生物藥劑學第三類藥物(水溶性好、膜滲透差)提供一種新的技術手段.本試驗中梔子苷磷脂復合物的在體腸吸收情況還有待進一步探索.

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