燕麥?zhǔn)称返鞍踪|(zhì)含量檢測(cè)

□ 邱 純 佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心

1 前言

因質(zhì)譜儀分析大分子量蛋白質(zhì)的靈敏度較分析小分子量的勝肽低，故使用酵素對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行專一性的水解反應(yīng)，將大分子的蛋白質(zhì)切成小片段勝肽，消化為適當(dāng)?shù)拇笮〖伴L(zhǎng)度（以6～20個(gè)胺基酸組成的勝肽最適合），利于儀器作出精確的判斷。胰蛋白酶Trypsin是最常使用于蛋白質(zhì)分解的蛋白酶，易于純化、產(chǎn)量高且專一性強(qiáng)，Trypsin剪切賴氨酸Lysine和精胺酸Arginine的碳端（C端）位置，但若與C端連接的胺基酸為脯胺酸Proline，則不水解此鍵結(jié)。許多蛋白質(zhì)中富含Lysine及Arginine，則Trypsin水解后的胰蛋白勝肽片段（Trypticpeptide），便于送入后續(xù)的質(zhì)譜儀分析，這也是Trypsin被廣泛使用的原因。

2 藥品與儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)藥品

觸媒、氫氧化鈉、檸檬酸；指示劑、己烯；30%丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、催化劑、過(guò)硫酸銨等。

2.2 儀器

熱風(fēng)循環(huán)烘箱、蛋白質(zhì)分解爐、燃燒式氮測(cè)定儀、索氏萃取裝置、高溫灰化爐、電泳槽組、電泳電源供應(yīng)器、高速均質(zhì)機(jī)、回轉(zhuǎn)式振蕩器、微量高速低溫離心機(jī)、高速離心機(jī)、干浴器、微電腦酸堿度計(jì)、超聲波水浴槽、蛋白質(zhì)減壓濃縮系統(tǒng)、超高效液相層析儀（UPLC）與雙線性離子阱組合傅立葉變換軌道阱質(zhì)譜儀。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 粗蛋白質(zhì)

使用水分測(cè)定后干燥完成的樣品，秤取樣品約0.5 g于燃燒式氮測(cè)定儀專用的錫箔紙中，封口成形后置入燃燒式氮測(cè)定儀中高溫燃燒。燃燒過(guò)程中生成氮氧化物、二氧化碳、水及無(wú)機(jī)物，經(jīng)過(guò)一系列吸收劑去除二氧化碳、水及無(wú)機(jī)物，氮氧化物經(jīng)還原管被還原為分子氮，最后經(jīng)熱導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)出氮分子含量（N），乘以蛋白質(zhì)系數(shù)5.95，即可得粗蛋白質(zhì)含量。

粗蛋白質(zhì)含量（%）=N×5.95%

3.2 蛋白質(zhì)檢測(cè)

在微量離心管中加入80 μL清洗溶液清洗膠體碎片，振蕩1 min，再用微量吸管移除清洗溶液。重復(fù)加入清洗溶液和移除溶液2次，盡量移除微量離心管中的溶液。接著加入15 μL二硫蘇糖醇溶液，靜置10 min，讓膠片吸收溶液，將微量離心管放入干浴器中于55 ℃下反應(yīng)30 min。使用微量吸管移除溶液，再加入15 μL碘乙酰胺溶液，放置在黑暗環(huán)境中于室溫下反應(yīng)60 min。吸除微量離心管中的溶液，加入100 μL清洗溶液后振蕩，重復(fù)吸除溶液并加入清洗溶液直到微量離心管中的膠片碎片變成透明無(wú)色。使用蛋白質(zhì)減壓濃縮系統(tǒng)，將微量離心管中的溶液完全抽干后，加入15 μL胰蛋白酶溶液與10 μL的25mM緩沖溶液，放入37 ℃水浴槽中反應(yīng)6 h，使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生勝肽[1]。

3.3 液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀分析

流速為10 μL/min；使用二次水和乙腈作為移動(dòng)相，起始移動(dòng)相為98%二次水、2%乙腈，在50 min內(nèi)將移動(dòng)相內(nèi)乙腈濃度升高至95%。

游離源設(shè)定為正電模式、溫度為90 ℃、電壓則是2.8 kV；質(zhì)譜掃描范圍設(shè)定為350～2 000 Da，收集2+至6+離子訊號(hào)。

4 結(jié)果

燕麥脫脂粉末及其酸、堿蛋白質(zhì)分離物與上清液的電泳分析結(jié)果，于約50 kDa處對(duì)應(yīng)為11Sglobulin（Chenopodin），其由A、B兩個(gè)次單 元（Subunit） 所 組 成，A-subunit分子量為 30～ 40 kDa、B-subunit分子 量 為 20～ 25 kDa。A、B Subunit會(huì)于后續(xù)的合成步驟形成Chenopodin（約50 kDa）。其中堿萃取（BP）及酸萃?。ˋP）蛋白質(zhì)分離物的Lane，皆于28～35 kDa處有兩條明顯的Band、20～25kDa處有三條明顯的Band，推測(cè)其各對(duì)應(yīng)為11Sglobulin A、Bsubunit，于約50 kDa處也可發(fā)現(xiàn)Chenopodin的存在。

5 結(jié)論

以堿萃取方式所得的燕麥蛋白質(zhì)分離物，較酸萃取方式具較高的蛋白質(zhì)含量（94.25%）及產(chǎn)率（32.29%）。蛋白質(zhì)體學(xué)的質(zhì)譜技術(shù)用于檢測(cè)燕麥中的蛋白質(zhì)，液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀分析出的Trypticpeptide對(duì)應(yīng)于四種蛋白質(zhì)：11S種儲(chǔ)存球蛋白、GBSSIb蛋白、乙酰羥酸合成酶（AHAS）、甜菜堿醛去氫酶（BADH）。通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)得知蛋白質(zhì)序列搭配生物信息工具，可以分析序列中的活性勝肽，探討實(shí)驗(yàn)素材用于生產(chǎn)活性勝肽的潛力，可以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間和藥品、材料的浪費(fèi)，并有助于從蛋白質(zhì)中生產(chǎn)特定活性的功能性勝肽。

[1]李景梅.偶氮氯膦-Ⅲ分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2015(6).