液體活檢技術(shù)在肺癌分子診斷中的研究進展

潘紅燕

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310008）

肺癌是中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，由于缺乏可靠的早期診斷方法，約60%～80%的肺癌患者確診時已屬晚期，喪失了手術(shù)治療的機會，再加上肺癌容易發(fā)生耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致十年來肺癌的總體存活率并沒有得到顯著增加，是當今社會嚴重威脅人類健康的主要因素之一[1]。雖然腫瘤組織活檢仍然是肺癌診斷和獲取腫瘤細胞遺傳變異的首要途徑，但組織活檢存在著不少局限性，主要為：不少晚期肺癌患者無法進行組織活檢；腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致穿刺組織無法全面反映腫瘤的整體信息；穿刺活檢可能造成較大的醫(yī)療風(fēng)險等[2]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)系統(tǒng)中存在的腫瘤遺傳物質(zhì)可以為腫瘤的早期診斷、基因分型提供可靠的信息，可以有效地彌補腫瘤組織活檢的不足，這種從血液中獲取腫瘤細胞遺傳變異的途徑我們稱之為“液體活檢”。液體活檢的優(yōu)勢在于能夠通過非侵入性取樣降低活檢的不良反應(yīng)，因此可以進行重復(fù)檢測，動態(tài)地觀察患者疾病的進展，對治療反應(yīng)進行實時監(jiān)測[3]。

液體活檢技術(shù)中最常見的獲取腫瘤DNA的來源有三種：循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）[4]、循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells ，CTCs）[5]以及外泌體（Exosomes）[6]。ctDNA是游離于血液中的小片段核酸，而循環(huán)腫瘤細胞是游離于血液中的可被捕獲的完整腫瘤活細胞，外泌體是細胞外包含DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等物質(zhì)的小囊泡，也可被當做腫瘤的分子標記物，下文分別對ctDNA、CTCs和外泌體在肺癌分子診斷中的研究進展進行綜述。

1.ctDNA在肺癌分子診斷中的研究進展

ctDNA是指腫瘤細胞因壞死或凋亡而掉落的腫瘤DNA片段，由Mandel和Metais于1940年率先提出，ctDNA會隨著血液循環(huán)系統(tǒng)不斷地流動，可以反應(yīng)腫瘤基因突變、缺失、重排、甲基化等信息[7]。在腫瘤患者中，ctDNA的含量要比正常人更高[8]。由于在腫瘤形成早期血液中還沒有CTCs時就已經(jīng)能檢測到ctDNA，因此ctDNA液體活檢技術(shù)在腫瘤分子診斷中的價值大于CTCs，特別是可以通過檢測ctDNA而發(fā)現(xiàn)早期的腫瘤。研究表明，Ⅱ～Ⅳ期的非小細胞肺癌患者ctDNA的檢出率為100%，但是在Ⅰ期，僅有50%的患者被檢出[9]。目前，ctDNA液體活檢技術(shù)在肺癌分子診斷中已有較為廣泛的應(yīng)用，最常見的應(yīng)用是血液EGFR基因突變狀態(tài)的檢測，特別是非小細胞肺癌患者接受靶向治療過程中耐藥突變T790M的檢測，T790M突變同時也是第三代靶向EGFR的TKI抑制劑藥物檢測靶點[10]。目前，F(xiàn)DA與中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局已批準了多款針對ctDNA的肺癌靶向藥物伴隨診斷試劑盒，例如廈門艾德生物科技股份有限公司基于superARMS技術(shù)的血液EGFR基因突變檢測試劑盒、羅氏診斷開發(fā)的Cobas EGFR Mutation Test V2試劑盒等。

2.CTCs在肺癌分子診斷中的研究進展

循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）是原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶細胞脫落進入外周血循環(huán)系統(tǒng)的游離腫瘤細胞，具有較強的流動性與侵襲性，容易粘附至血管壁并穿越，是惡性腫瘤遠端轉(zhuǎn)移的主要途徑之一[11]。雖然有些CTCs在脫落過程中經(jīng)歷過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但包含了原發(fā)灶腫瘤主要的細胞表型和細胞遺傳變異，因此，CTCs可以成為液體活檢技術(shù)獲取腫瘤信息的有效途徑之一。CTCs的捕獲技術(shù)近年來發(fā)展較為迅速，主要捕獲策略有免疫磁珠捕獲技術(shù)、微流控技術(shù)、濾膜分離技術(shù)等[12]。CellSearch系統(tǒng)是全球第一個也是唯一經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準，用于惡性腫瘤疾病輔助診斷的檢測CTC的產(chǎn)品。但其應(yīng)用領(lǐng)域僅限于乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌，在肺癌中其檢測特異性和靈敏度均不理想，由于價格昂貴以及不能用于下游的細胞培養(yǎng)、基因檢測等限制，強生公司在2016年初已經(jīng)宣布停止銷售，Cell search作為腫瘤領(lǐng)域無創(chuàng)診斷的先行者，雖然還存在著不少缺陷，卻開辟了CTCs無創(chuàng)檢查的新方向。隨著未來CTCs捕獲技術(shù)的進步，相信未來CTCs領(lǐng)域會產(chǎn)生更大影響力的創(chuàng)新無創(chuàng)液體活檢產(chǎn)品。

3.外泌體在肺癌分子診斷中的研究進展

近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中的外泌體是一種新型的腫瘤生物標記物。外泌體是由細胞釋放至血液中的具有完整包膜包含著母體細胞多種核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的小囊泡，直徑大約為30～100nm[13]。外泌體是細胞與遠處細胞之間信息交流的介質(zhì)，因此可以在多種體液例如血液、尿液等中被檢測到。由于外泌體可以反應(yīng)母細胞中的遺傳變異、代謝狀態(tài)、生物標記物等，因此，目前以有針對外泌體而開發(fā)的液體活檢檢測技術(shù)，用于檢測肺癌細胞中EGFR基因突變、EML4-ALK基因融合等，由于外泌體具有完整的包膜并來源于活細胞，因此相比于ctDNA而言外泌體液體活檢展現(xiàn)出了較強的優(yōu)勢，特別是在腫瘤RNA的檢測中優(yōu)勢顯著[14]。然而幾乎所有類型細胞都會分泌外泌體，不僅僅是腫瘤細胞，因此，外泌體的分離和檢測技術(shù)還有待于進一步的完善。目前，美國Exosome Diagnostics公司針對外泌體RNA已經(jīng)開發(fā)了肺癌的血液檢測試劑盒。

4.總結(jié)與展望

隨著液體活檢技術(shù)的進步，早期肺癌的篩查已經(jīng)出現(xiàn)了曙光。相比于影像學(xué)和傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢技術(shù)在微創(chuàng)、經(jīng)濟、應(yīng)用性方面展現(xiàn)出了較強的優(yōu)勢，但目前為止各種技術(shù)都還存在著不少問題，未來液體活檢技術(shù)將在肺癌診斷、監(jiān)測領(lǐng)域起到更加重要的作用。

[1]Chen W, Zheng R, Baade PD, Zhang S, Zeng H, Bray F, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA: a cancer journal for clinicians. 2016;66:115-32.

[2]Lim C, Sung M, Shepherd FA, Nouriany N, Sawczak M, Paul T, et al. Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer:Are Research Biopsies a Barrier to Participation in Clinical Trials? Journal of thoracic oncology : official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2016;11:79-84.

[3]Sholl LM, Aisner DL, Allen TC, Beasley MB, Cagle PT,Capelozzi VL, et al. Liquid Biopsy in Lung Cancer: A Perspective From Members of the Pulmonary Pathology Society.Archives of pathology & laboratory medicine. 2016;140:825-9.

[4]Heitzer E. Clinical utility of circulating tumor DNA in human cancers. Memo-Mag Eur Med Onc. 2015;8:222-6.

[5]Hamilton G. Clinical relevance of circulating tumor cells in cancer patients. Memo-Mag Eur Med Onc. 2015;8:227-30.

[6]Senfter D, Mader RM. Exosomes as novel biomarkers in anticancer therapy. Memo-Mag Eur Med Onc. 2015;8:231-4.

[7]Diaz LA, Williams RT, Wu J, Kinde I, Hecht JR, Berlin J, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature.2012;486:537-40.

[8]Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.Cancer research. 1977;37:646-50.

[9]Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NCW,Modlin LA, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med.2014;20:552-8.

[10]Sacher AG, Paweletz C, Dahlberg SE, Alden RS, O'Connell A, Feeney N, et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. Jama Oncol. 2016;2:1014-22.

[11]Ning Y, Zhang W, Hanna DL, Yang D, Okazaki S, Berger MD, et al. Clinical relevance of EMT and stem-like gene expression in circulating tumor cells of metastatic colorectal cancer patients. The pharmacogenomics journal.2018;18:29-34.

[12]Sharma S, Zhuang R, Long M, Pavlovic M, Kang Y, Ilyas A, et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 2018.

[13]Zhang HG, Grizzle WE. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2011;17:959-64.

[14]Thakur BK, Zhang H, Becker A, Matei I, Huang Y, Costa-Silva B, et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell research. 2014;24:766-9.