黑果枸杞外整流鉀離子通道SKOR基因的克隆及表達(dá)分析

劉麗萍， 戴逢斌， 張 沖， 田 菊， 陳金煥

（1.北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京100083；2.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)和盛生態(tài)科技研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特011517）

植物中的Shaker家族是迄今為止研究最深入的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)家族之一，被認(rèn)為在植物鉀離子（K+）吸收以及轉(zhuǎn)運(yùn)方面起到至關(guān)重要的作用［1－2］。最早報(bào)道的擬南芥Arabidopsis thaliana內(nèi)向整流K+通道AKT1屬于Shaker家族，它具有雙親和鉀吸收特性，主要在擬南芥根部表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞中表達(dá)，在擬南芥吸收K+過程中起到關(guān)鍵作用。隨后已陸續(xù)從其他植物中克隆得到該基因，均表現(xiàn)出明顯的組織特異性表達(dá)，如OsAKTl主要在水稻Oryza sativa根中表皮和維管組織中表達(dá)［3］；ZMK1主要在玉米Zea mays胚芽鞘皮層中表達(dá)［4］；SeAKT1在鹽角草Salicornia europaea成苗的根和冠中均有表達(dá)， 但在根中表達(dá)量略高［5］；GkKT2在三葉期棉花Gossypium hirsutum根、莖、葉和頂芽等各部位均有表達(dá)，但在葉中表達(dá)量較大［6］等。Shaker通道家族也包括外整流K+通道，但目前針對(duì)它的研究較少。SKOR與AKT1在跨膜區(qū)具有很高的同源性，但C端比AKT1多約200個(gè)氨基酸及6個(gè)錨蛋白重復(fù)基序（ankyrin repeat motif，AR）［7－8］。據(jù)報(bào)道［9］：胞內(nèi)K+濃度可以調(diào)節(jié)SKOR活性，而對(duì)K+的感受性就是依賴C端結(jié)構(gòu)域部分感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外電壓差而實(shí)現(xiàn)的，AKT1對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的K+卻沒有響應(yīng)。GAYMARD等［10］首次從擬南芥中克隆到編碼外整流K+通道的基因SKOR，并發(fā)現(xiàn)它在根中柱組織特異表達(dá)，且能被脫落酸（ABA）抑制，其介導(dǎo)根細(xì)胞中的K+向木質(zhì)部外流的轉(zhuǎn)運(yùn)。在玉米根皮層及中柱細(xì)胞中也檢測(cè)到了外整流K+通道，并確定其介導(dǎo)K+從中柱細(xì)胞外排到木質(zhì)部汁液中，外整流K+通道基因的這一功能在大麥Hordeum vulgare中也得到了驗(yàn)證［11－12］。另外，Shaker鉀離子通道的孔結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)氨基酸序列上的組氨基酸殘基高度保守，這決定了其通道活性在很大程度上受細(xì)胞內(nèi)外酸堿度調(diào)節(jié)，比如，KAT1活性在細(xì)胞膜內(nèi)外低pH值的情況下被激活［13］， SKOR的活性受酸堿度影響較大［14－16］。 小白菜Brassica chinensis花粉質(zhì)膜外整流K+通道受細(xì)胞內(nèi)外pH值的影響，從而影響花粉萌發(fā)和花粉管的伸長［17］。黑果枸杞Lycium ruthenicum為茄科Solanaceae枸杞屬Lycium多年生野生鹽生類灌木，主要生長在中國西北青海、新疆、甘肅等地的荒漠地區(qū)，不但具有極強(qiáng)的耐旱、耐鹽堿性，還具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，在生態(tài)建設(shè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中有巨大的應(yīng)用前景，也是研究多年生植物抗逆機(jī)制的優(yōu)良植物材料。已有研究結(jié)果表明［18］：與寧夏枸杞Lycium barbarum相比，黑果枸杞具有更強(qiáng)的耐鹽能力。在鹽分脅迫下，黑果枸杞各器官中鈉離子（Na+）和氯離子（Cl－）相對(duì)含量均增加，葉片中積累最多，K+/Na+比均下降，在根中比值比地上部分高。但與寧夏枸杞相比，黑果枸杞各器官中的K+含量下降相對(duì)較少，積累的Na+和Cl-含量也相對(duì)較少，甚至在450 mmol·L-1氯化鈉高鹽脅迫下，各器官中K+/Na+比下降的幅度仍小于寧夏枸杞，其中葉片組織中K+/Na+比值顯著高于同濃度脅迫下的寧夏枸杞，但與擬南芥等傳統(tǒng)植物相比，黑果枸杞耐鹽堿基因尤其是鉀吸收相關(guān)基因的鑒定未見報(bào)道。為進(jìn)一步深入研究黑果枸杞的耐鹽機(jī)制，本研究采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）方法克隆了黑果枸杞SKOR基因并分析其序列特征，研究了不同pH值的高鹽環(huán)境對(duì)SKOR基因表達(dá)豐度的影響，為以后研究外整流K+通道SKOR在黑果枸杞體內(nèi)能否維系高K+/Na+比，進(jìn)而在提高植株耐鹽性中發(fā)揮重要作用而奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑果枸杞種子采自青海省大格勒鄉(xiāng)，在北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室溫室內(nèi)進(jìn)行播種培養(yǎng)。具體方法：挑選籽粒飽滿的黑果枸杞種子播種在以m（花卉土）∶m（蛭石）∶m（珍珠巖）=3∶2∶1混合后的穴盤中，每天定時(shí)噴施無菌水至發(fā)芽后，配制Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。溫室溫度為（23±2）℃,光照16 h·d－1，空氣相對(duì)濕度控制在70%左右。以生長4周的黑果枸杞幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 總RNA的提取

取4周齡黑果枸杞幼苗的根系，加入液氮研磨至粉末狀。根據(jù)改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法鑒定其完整性和質(zhì)量。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用擬南芥等其他植物的SKOR核苷酸序列在實(shí)驗(yàn)室前期建立的本地黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，得到1條長度為2 500 bp左右的擬SKOR基因。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的片段利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物 P1（5′-ATGCACATTAATAATGGAGGAG-3′）和 P2（5′-AGTTGATTCATTGTTCAAGTACAA-3′），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成引物后，用于該黑果枸杞擬SKOR基因序列全長的擴(kuò)增。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增

采用RT-PCR法進(jìn)行基因克隆，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，10℃保存。PCR產(chǎn)物用體積分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明書進(jìn)行目的片段的回收和純化。

1.5 陽性克隆的鑒定與序列分析

將回收的PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化Top10大腸埃希菌Escherichia coli感受態(tài)細(xì)胞，在含50 mg·L－1氨芐青霉素的LB固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑陽性克隆篩選，篩選出的陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。所測(cè)序列的比對(duì)分析在DNAMAN 6.0生物軟件上進(jìn)行，在美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）上進(jìn)行Blast搜索。利用NCBI ORFfinder工具確定基因的開放閱讀框。蛋白質(zhì)親/疏水性預(yù)測(cè)用ExPASy網(wǎng)站的在線軟件ProtScale分析，以Hphob.Kyte&Doolittle為默認(rèn)值。進(jìn)化樹分析先使用Clustal X 2.1軟件對(duì)來自番茄Solanum lycopersicum，馬鈴薯Solanum tuberosum，胡楊Populus euphratica等物種的SKOR成員進(jìn)行序列比對(duì)，然后使用MEGA 5.1 Beta 3軟件用鄰接法構(gòu)建。

1.6 基因表達(dá)分析

對(duì) 4 周齡的黑果枸杞苗分別用 300 mmol·L－1氯化鈉與 450 mmol·L－1碳酸氫鈉（pH 9.0）處理 6 h， 利用天根生化科技有限公司Real Master Mix（SYBR Green）PCR試劑盒，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法，檢測(cè)LrSKOR基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增目標(biāo)LrSKOR基因引物設(shè)計(jì)為LrSKOR-F:5′-ATGCACATTAATAATGGAGGAG-3′和 LrSKOR-R:5′-AGTTGATTCATTGTTCAAGTACAA-3′；以黑果枸杞延伸因子 1α基因 EF1α［19］作為內(nèi)參基因，其引物為 EF1αF:5′-GAAGGGTGTCCCTCA GATCA-3′和 EF1α R:5′-CCGTCC ATGTCGTCTCTTTT-3′， 對(duì)反轉(zhuǎn)錄所得的 cDNA 按照 1， 1/10， 1/100，1/1 000，1/10 000進(jìn)行稀釋，繪制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)熒光定量設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2 min，94℃20 s，55℃30 s，72℃ 30 s，設(shè)置36個(gè)循環(huán)，各輪循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集，最后 95℃變性 1 min，退火至55℃。根據(jù)熒光值，繪制熔點(diǎn)曲線。內(nèi)參基因的表達(dá)與LrSKOR基因按照同樣的反應(yīng)程序同時(shí)測(cè)試。獨(dú)立提取3次待測(cè)樣品的RNA作為生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置技術(shù)性重復(fù)3次·樣品－1。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取及LrSKOR基因的克隆及鑒定

取生長4周的黑果枸杞幼苗根部作為實(shí)驗(yàn)材料，提取總RNA，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示28 S RNA條帶亮度約為18 S RNA的2倍，表明所提取的黑果枸杞總RNA完整性較好。進(jìn)一步用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)得出D（260）/D（280）為2.1，說明所提取的RNA純度較好，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到第1鏈cDNA后，以該cDNA為模板，以擬SKOR基因的引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)亮帶，且上下無雜帶，與預(yù)期片段大小一致，推測(cè)可能是目的基因。將連接有純化目的片段的PMD18-T克隆載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Top10后，從轉(zhuǎn)化的平板上隨機(jī)挑取6個(gè)白色菌斑振搖過夜培養(yǎng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增條帶大小與RT-PCR結(jié)果一致，表明這些克隆為陽性克隆。

2.2 核酸序列及基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，Genebank登錄號(hào)為KY563342。測(cè)序所得到的SKOR基因序列全長為2 448 bp，包括1個(gè)完整的開放閱讀框，其編碼的SKOR蛋白包含815個(gè)氨基酸殘基。在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，該基因序列與擬南芥（NM_111153.3），葡萄Vitis vinifera（AJ490336），蓖麻Ricinus communis（XM_002533405）和胡楊（EU382997.1）等植物外整流K+通道基因的核苷酸序列的同源性均在65%以上，其中與葡萄推測(cè)的外整流K+通道基因的核苷酸序列的同源性達(dá)到70.36%；通過和茄科植物馬鈴薯（XM_006352418.2）， 番茄（XM_004250158.3）， 甜辣椒 Capsicum annuum（XM_016696732.1）等比對(duì)同源性很高，其中與馬鈴薯全長同源性最高，達(dá)到90.31%，表明本研究已克隆到外整流K+通道基因全長，將其命名為LrSKOR。用ExPASy網(wǎng)站分析該蛋白的理化性質(zhì)，得到其相對(duì)分子量約為9.33×104，理論等電點(diǎn)為6.32，其中數(shù)量最豐富的氨基酸依次是亮氨酸（Leu），異亮氨酸（Ile）和絲氨酸（Ser），分別占11.2%，8.6%和7.2%，色氨酸（Trp）含量最少，只占1.2%。

2.3 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和親/疏水性分析

利用NCBI網(wǎng)站Conserved Domain工具對(duì)LrSKOR氨基酸結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：LrSKOR蛋白序列在258～315位存在1個(gè)與離子通道Ion_trans_2相似的保守結(jié)構(gòu)域，Ion_trans_2是Ion_trans_2超家族的一個(gè)成員。在561～716和741～810氨基酸序列位點(diǎn)還分別存在1個(gè)與K+運(yùn)輸有關(guān)的離子通道的錨蛋白區(qū)（ANK）和KHA（鉀離子通道的四聚化結(jié)構(gòu)域），KHA在植物中一般位于C末端區(qū)。

運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站的在線分析軟件ProtScale，以Hphob.Kyte&Doolittle為默認(rèn)值對(duì)LrSKOR編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè)，得到LrSKOR的親／疏水信號(hào)圖。疏水性分析結(jié)果表明：LrSKOR編碼蛋白多肽鏈的第113號(hào)位點(diǎn)的纈氨酸（Val）疏水性最強(qiáng)，具有最高的分值3.167；第321號(hào)的精氨酸（Arg）親水性最強(qiáng)，具有最低的分值－2.956。從整個(gè)肽鏈上氨基酸分布來看，親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，且多于疏水性氨基酸，認(rèn)為該蛋白是親水性蛋白（圖1）。

圖1 LrSKOR蛋白親水／疏水性分析Figure 1 Hydrophobicity/phdrophilicity prediction of LrSKOR protein

用DNAMAN 6.0軟件對(duì)LrSKOR的氨基酸全長序列與多種植物SKOR的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果表明：黑果枸杞LrSKOR與茄科植物甜辣椒、馬鈴薯、番茄等的外整流K+通道的親緣關(guān)系非常近，氨基酸同源性高達(dá)90%以上，分別為90.05%，90.70%和90.47%；與擬南芥AtSKOR，苜蓿Medicago truncatula的MtSKOR，玉米的ZmZORK等的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，同源性為62.36%～69.12%（圖 2）。

為了分析黑果枸杞與其他植物中的SKOR系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 5.1 Beta 3軟件對(duì)黑果枸杞LrSKOR與茄科及其他物種的蛋白氨基酸序列構(gòu)建了進(jìn)化樹。由圖3進(jìn)化樹可知：黑果枸杞與茄科植物如番茄、馬鈴薯、甜辣椒等聚在一起，表明它們之間親緣關(guān)系較近，而與胡楊、蓖麻、玉米等分類在不同分支上，表示它們之間進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.4 鹽分脅迫下LrSKOR基因的表達(dá)分析

由于LrSKOR基因可能參與調(diào)節(jié)黑果枸杞根部的離子選擇性吸收，本研究提取黑果枸杞根部總RNA，用熒光定量PCR法研究了該基因在高鹽和鹽堿不同脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)情況，以EF1α在根中的表達(dá)量定為 “1”。按照相對(duì)定量公式 2-△△Ct作圖（圖4）?？梢钥闯?，LrSKOR基因在對(duì)照、高鹽脅迫以及鹽堿脅迫下均有表達(dá)。高鹽和鹽堿脅迫下的表達(dá)量明顯高于對(duì)照，在鹽堿脅迫下的表達(dá)豐度最高，是高鹽處理的6.81倍，是對(duì)照的23.79倍。這表明LrSKOR基因參與高鹽及鹽堿環(huán)境脅迫響應(yīng)，并且與環(huán)境pH值之間可能存在較為緊密的關(guān)系。

3 討論

圖2 LrSKOR與其他植物SKOR開放閱讀框氨基酸的多序列比對(duì)Figure 2 Amino sequence alignment of LrSKOR with other plants SKOR

植物體內(nèi)豐富的K+主要由植物根部從土壤中吸收而獲得。研究表明［19］：根部吸收K+后經(jīng)木質(zhì)部裝載，在蒸騰拉力作用下，隨木質(zhì)部流入地上部完成K+在地上部分的積累，外整流K+通道在此運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用。目前，有關(guān)模式植物擬南芥的外整流K+通道蛋白的研究最為集中，而其他植物的外整流K+通道蛋白的研究還較少。GAYMARD等［10］從擬南芥中分離得到K+外整流通道蛋白基因AtSKOR，通過非洲爪蟾Xenopus laevis卵母細(xì)胞異源表達(dá)和突變體atskor試驗(yàn)證明，AtSKOR介導(dǎo)K+從木質(zhì)部薄壁細(xì)胞向木質(zhì)部的裝載。沙冬青Ammopiptanthus mongolicus保衛(wèi)細(xì)胞外整流K+通道AmGORK也被克隆，其活性與擬南芥SKOR一樣對(duì)細(xì)胞外pH值很敏感，在2個(gè)pH單元的酸化程度下活性被降低了70%［20］。另有研究認(rèn)為，鹽分脅迫下的外整流K+通道蛋白SKOR可能是唯一對(duì)木質(zhì)部汁液中鉀分泌起作用的Shaker K+通道，它的活性可由木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中Na+不斷積累引起的薄壁細(xì)胞質(zhì)膜去極化而被激活，進(jìn)而將 K+裝載到木質(zhì)部運(yùn)往地上部芽［21－22］。 木本植物霸王Zygophyllum xanthoxylum的ZxSKOR研究表明［23］：ZxSKOR主要在根和莖中表達(dá)，且其表達(dá)水平隨葉片中K+的濃度增加而顯著提高，并認(rèn)為鹽分脅迫下，根和莖中的ZxSKOR相互協(xié)調(diào)很好地起到對(duì)K+的長距離運(yùn)輸?shù)淖饔?。因此，SKOR在植物地上部分K+積累方面的作用不容忽視，但關(guān)于它是如何參與K+向木質(zhì)部的運(yùn)輸還沒有明確的證據(jù)。WANG等［24］在小花堿茅Puccinellia tenuiflora中的研究證明，其地上部分K+的含量不受外界鹽分濃度及處理時(shí)間的影響，這是小花堿茅維持植株地上部高K+/Na+比的重要原因之一。目前，已克隆得到小花堿茅的外整流K+通道PtSKOR基因片段［25］，這將為進(jìn)一步研究小花堿茅耐鹽機(jī)理奠定基礎(chǔ)。關(guān)于黑果枸杞耐鹽生理生態(tài)機(jī)制的研究結(jié)果表明，Na+和K+主要分布在黑果枸杞地上部分，但根中K+/Na+比值比葉片中高，與其他積鹽鹽生植物鹽爪爪Kalidium foliatum和白刺N(yùn)itraria tangutorum相比，黑果枸杞的K+/Na+比值高于這兩者，從而表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的耐鹽能力［26］，由此看出，K+的積累和運(yùn)輸在表現(xiàn)黑果枸杞耐鹽性方面扮演及其重要的角色，但目前關(guān)于黑果枸杞K+積累與運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制尚不清楚。

圖3 LrSKOR與其他植物SKOR的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic analysis of LrSKOR with SKOR from different plant species

圖4 LrSKOR在不同pH值鹽分脅迫下的表達(dá)分析Figure 4 Expression level under salt treatment of different pH values

黑果枸杞作為沙漠中可以建群的多年生灌木，具有很強(qiáng)的抗鹽堿能力，加上繁殖力強(qiáng)的特點(diǎn)，有望成為耐鹽堿研究的模式植物。近年來，黑果枸杞耐鹽堿研究日益受到關(guān)注，本研究以前期測(cè)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從黑果枸杞根系中成功克隆得到SKOR基因。研究已知，SKOR屬于鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的Shaker家族，典型的植物Shaker通道蛋白從N末端至C末端包括一個(gè)大約由60個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)N末端區(qū)、由6個(gè)跨膜區(qū)構(gòu)成的疏水核和一個(gè)很長序列的細(xì)胞質(zhì)C末端區(qū)。其中，C末端區(qū)含有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)推測(cè)的環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)（CNBD）、一個(gè)存在于大部分Shaker通道中的錨蛋白區(qū)和一個(gè)靠近C末端的富含疏水酸性殘基區(qū)（KHA）［27］。本研究對(duì)該基因編碼的蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其分別存在一個(gè)錨蛋白區(qū)和KHA四聚化保守結(jié)構(gòu)域，說明該基因編碼的蛋白屬于與K+運(yùn)輸有關(guān)的Shaker家族蛋白。Shaker通道的一個(gè)重要特點(diǎn)是能形成異源四聚體結(jié)構(gòu)，KHA是鉀離子通道蛋白的四聚化結(jié)構(gòu)域，可能參與了這個(gè)過程，從而使該蛋白起到調(diào)節(jié)細(xì)胞中的K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性的功能；錨蛋白結(jié)合位點(diǎn)可使該蛋白質(zhì)特異地定位在質(zhì)膜上，并潛在地影響蛋白與蛋白之間的相互作用。通過對(duì)LrSKOR編碼氨基酸同源性序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，得出LrSKOR與擬南芥、胡楊、蓖麻等雙子葉植物的外整流K+通道相比同源性較低，但與茄科植物如馬鈴薯、番茄等同源性達(dá)90%以上，構(gòu)建進(jìn)化樹中聚在一起（圖2），這表明黑果枸杞與其他茄科植物SKOR蛋白進(jìn)化程度相似，LrSKOR同樣行使推測(cè)的參與K+向木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)墓δ埽舱f明了黑果枸杞與其他茄科植物存在較近的親緣關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，LrSKOR在鹽堿脅迫下的表達(dá)豐度最高，高鹽脅迫下次之，對(duì)照最低。這表明，黑果枸杞LrSKOR作為外整流K+通道，其基因表達(dá)除了受鹽分脅迫影響外，與土壤pH值還存在密切的聯(lián)系，這與很多前人研究的推論相一致。因此，LrSKOR很可能在黑果枸杞耐鹽性發(fā)揮方面具有重要作用。這也為進(jìn)一步闡明鹽生植物黑果枸杞K+和Na+選擇性運(yùn)輸機(jī)制提供分子層面的依據(jù)，具有重大的研究價(jià)值及應(yīng)用前景。

［1］XU Jiang， LI Haodong， CHEN Liqing， et al.A protein kinase， interacting with two calcineurin B-like proteins，regulates K+transporter AKT1 in Arabidopsis ［J］.Cell,2006,125（7）:1347 － 1360.

［2］LUAN Sheng.The CBL-CIPK network in plant calcium signaling ［J］.Trends Plant Sci， 2009， 14（1）： 37 － 42.

［3］龍雨.水稻鉀離子通道OsAKT1生理功能及其調(diào)控機(jī)制的電生理學(xué)研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.LONG Yu.Electrophsiological Analysis of Function Molecular Regulatory Mechanism for Rice Potassium Channel Os-AKT1 ［D］.Beijing:China Agricultural University,2014.

［4］閔水珠.植物鉀離子通道的分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，17（3）：163－169.MING Shuizhu.The progress on the molecular biology of the K+channels in plants ［J］.Acta Agric Zhejiang,2005,17（3）:163 － 169.doi:10.3969/j.issn.1004-1524.2005.03.014.

［5］商玲.鹽角草鉀離子通道蛋白基因SeAKT1的克隆與表達(dá)［D］.大連：大連理工大學(xué)，2013.SHANG Ling.Cloning and Expression of A K+Channel Gene SeAKT1 from Salicornia europaea ［D］.Dalian:Dalian University of Technology,2013.

［6］徐娟.棉花鉀離子通道基因GhAKT1和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因GhKT2的克隆及功能分析［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.XU Juan.Cloning and Functional Characterizition of Potassium Channel Gene GhAKT1 and Potassium Transporter Gene GhKT2 from Cotton （Gossypium hirsutum L.） ［D］.Beijing:China Agricultural University,2014.

［7］M?SER P， THOMINE S， SCHROEDER J I， et al.Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis ［J］.Plant Physiol， 2001， 126（4）： 1646 － 1667.

［8］ZIMMERMANN S， SENTENAC H.Plant ion channels： from molecular structures to physiological functions ［J］.Curr Opin Plant Biol， 1999， 2（6）： 477 － 482.

［9］LIU Kun， LI Legong， LUAN Sheng.Intracellular K+sensing of SKOR， a shaker-type K+channel from Arabidopsis［J］.Plant J Cell Mol Biol， 2006， 46（2）： 260 － 268.

［10］GAYMARD F， PILOT G， LACOMBE B， et al.Identification and disruption of a plant shaker-like outward channel involved in K+release into the xylem sap ［J］.Cell， 1998， 94（5）： 647 － 655.

［11］ROBERTS S K， TESTER M.Inward and outward K+-selective currents in the plasma membrane of protoplasts from maize root cortex and stele ［J］.Plant J， 1995， 8（6）： 811 － 825.

［12］ROBERTS S K， TESTER M.Permeation of Ca2+and monovalent cations through an outwardly rectifying channel in maize root stelar cells ［J］.J Exp Bot， 1997， 48（309）： 839 － 846.

［13］HOTH S， HEDRICH R.Distinct molecular bases for pH sensitivity of the guard cell K+channels KST1 and KAT1［J］.J Biol Chem， 1999， 274（17）： 11599 － 11603.

［14］LACOMBE B， PILOT G， GAYMARD F， et al.pH control of the plant outwardly-rectifying potassium channel SKOR ［J］.FEBS Lett， 2000， 466（2/3）： 351 － 354.

［15］GEIGER D， BECKER D， VOSLOH D， et al.Heteromeric AtKC1·AKT1 channels in Arabidopsis roots facilitate growth under K+-limiting conditions ［J］.J Biol Chem， 2009， 284（32）： 21288 － 21295.

［16］HOTH S， DREYER I， HEDRICH R.Mutational analysis of functional domains within plant K+uptake channels［J］.J Exp Bot， 1997， 48： 415 － 420.

［17］FAN Liumin， WANG Yongfei， WU Weihua.Outward K+channels in Brassica chinensis pollen protoplasts are regulated by external and internal pH ［J］.Protoplasma， 2003， 220（3/4）： 143 － 152.

［18］王龍強(qiáng)，米永偉，藺海明.鹽脅迫對(duì)枸杞屬兩種植物幼苗離子吸收和分配的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（4）： 129 － 136.WANG Longqiang,MI Yongwei,LIN Haiming.Effect of salt stress on ion absorption and distribution of two Lycium seedlings ［J］.Acta Pratac Sin,2011,20（4）:129 － 136.

［19］ZENG Shaohua， LIU Yongliang， WU Min， et al.Identification and validation of reference genes for quantitative real-time PCR normalization and its applications in Lycium ［J］.PLoS One,2014,9（5）:e97039.doi:10.1371/journal.pone.0097039.

［20］LI Junlin， ZHANG Huanhao， LEI Han， et al.Functional identification of a GORK potassium channel from the an-cient desert shrub Ammopiptanthus mongolicus （Maxim.） Cheng f.［J］.Plant Cell Rep， 2016， 35（4）： 803 － 815.

［21］ROBERTS S K， TESTER M.Permeation of Ca2+and monovalent cations through an outwardly rectifying channel in maize root stelar cells ［J］.J Exp Bot， 1997， 48（4）： 839 － 846.

［22］WEGNER L H， de BOER A H.Properties of two outward-rectifying channels in root xylem parenchyma cells suggest a role in K+homeostasis and long-distance signaling ［J］.Plant Physiol， 1997， 115（4）： 1707 － 1719.

［23］HU Jing， MA Qing， KUMAR T， et al.ZxSKOR is important for salinity and drought tolerance of Zygophyllum xanthoxylum by maintaining K+homeostasis ［J］.Plant Growth Regul， 2016， 80（2）： 195 － 205.

［24］WANG Chunmin， ZHANG Jinlin， LIU Xuesong,et al.Puccinellia tenuiflora maintains a low Na+level under salinity by limiting unidirectional Na+influx resulting in a high selectivity for K+over Na+［J］.Plant Cell Environ，2009， 32（5）： 486 － 496.

［25］王茜，王沛，王鎖民.鹽生植物小花堿茅外整流K+通道SKOR基因片段的克隆及序列分析［J］.草業(yè)科學(xué)，2012， 29（8）： 1218 － 1223.WANG Qian,WANG Pei,WANG Suomin.Cloning and sequence analysis of outward-rectifying potassium channel SKOR gene fragment from halophyte Puccinellia tenuiflora ［J］.Pratac Sci,2012,29（8）:1218 － 1223.

［26］王龍強(qiáng).鹽生藥用植物黑果枸杞耐鹽生理生態(tài)機(jī)制研究［D］.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.WANG Longqiang.The Physio-ecological Mechanism of Salt Tolerance of Medicinal Halophyte Lycium ruthenieum［D］.Lanzhou:Gansu Agricultural University,2011.

［27］劉貫山,王元英,孫玉合,等.高等植物鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［J］.生物技術(shù)通報(bào),2006（5）:13－18.LIU Guanshan,WANG Yuanying,SUN Yuhe,et al.Proteins for transport of potassium in higher plants ［J］.Biotechnol Bull,2006（5）:13 － 18.