梅毒疫苗發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)與機遇

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(1.南華大學病原生物學研究所，湖南 衡陽421001；2.常德市第一人民醫(yī)院檢驗科；3.南華大學衡陽醫(yī)學院2015級臨床醫(yī)學4班；4.湘南學院預防醫(yī)學與檢驗醫(yī)學系)

梅毒是由蒼白密螺旋體蒼白亞種(Treponema pallidum subspecies pallidum，Tp)感染引起的一種全球廣泛流行的性傳播疾病，主要發(fā)生在包括中國在內的中低收入國家，但在高收入國家中梅毒也再次出現(xiàn)并迅速回升，尤其在男-男性行為者(MSM)和孕婦中呈急劇上升態(tài)勢。先天性梅毒成為當前死產的主要原因[1-2]，梅毒患者感染和傳播AIDS的風險也大大增加，梅毒感染使全球經(jīng)濟蒙受巨大損失?？刂泼范静荒軆H靠現(xiàn)有的篩查和治療手段，必須尋求新的附加措施，而開發(fā)梅毒疫苗就是其中之一[3-4]。有效的梅毒疫苗將克服如今面臨的諸多困難[3]：預防Tp感染，進而預防各期梅毒發(fā)展及母嬰垂直傳播；預防不同Tp臨床株的交叉感染，相應地減少再感染的發(fā)生率；無需依賴復診和青霉素的充足供應即可有效控制梅毒。研發(fā)疫苗不但對消滅梅毒具有重要意義，而且能有效降低AIDS發(fā)生[4]。

1 梅毒疫苗前期研究狀況

與其它病原體的疫苗開發(fā)相比，有關梅毒疫苗的實驗研究非常有限，主要原因是：Tp的生物學性狀特殊[2]：外膜蛋白(OMP，為主要疫苗靶分子)稀少；外膜脆弱使OMP難以鑒定；不能體外培養(yǎng)，體內增殖緩慢；不能通過基因操控來研究基因功能；細胞壁缺乏革蘭陰性菌共有的脂多糖；不產生明顯毒力因子。此外，缺乏從事Tp基礎研究的科研人員、Tp研究領域相對于其他病原體較落后的方法學[5]也是重要影響因素。

早在上世紀六七十年代，Metzger 和Miller 分別用4 ℃短期儲存后致弱的Tp和γ射線致弱的Tp(Nichols株)免疫家兔后分別獲得了針對Nichols株攻擊的部分和完全保護，通過比較得出結論[3]：表面抗原是梅毒疫苗的關鍵成分，但對熱敏感；保護性免疫是逐步誘導形成的；不同Tp株的保護性抗原不同；在兔模型中可誘導出持久和無菌免疫保護。

早期應用全細胞免疫雖能獲得完全保護，但因免疫劑量大和免疫時間長，不適合應用于人體，卻為發(fā)展梅毒疫苗提供了可行性和實驗依據(jù)。隨著Tp基因組解析和基因工程技術的開展，國外以重組蛋白類型[3,5]，國內以核酸疫苗類型[6]，先后在動物模型中對單個抗原測試了免疫保護力，包括Tp92 (BamA) 、TprK、TprI、TprF 、Gpd、TmpB、TpN15、TpN47 、Tp0155、Tp0483、 Tp0956、4D、內鞭毛和Tp0751[7]。其中用Tp92 (BamA) 、4D、Gpd、TpF和內鞭毛免疫的家兔損害發(fā)展減弱，顯示出部分保護；用抗原可變的TprK獲得了很有希望的部分保護，該分子的保護性結構位于蛋白N末端區(qū)域[3]；最近，以重組Tp0751蛋白免疫兔，發(fā)現(xiàn)其器官的Tp負荷明顯減低，而以Tp攻擊Tp0751免疫兔后，將其淋巴結引入其他兔體內未出現(xiàn)感染，表現(xiàn)為無菌免疫，提示Tp0751是非常有希望的候選疫苗分子[7]。然而，TprK 、Gpd 和Tp92(BamA) 這幾種蛋白保護力的研究結果有分歧[3]。 以上研究表明：抗Tp感染保護不是由單一Tp抗原提供的，應發(fā)展多價疫苗；不同實驗室間結果不同，突顯了對實驗室間抗原制備和免疫方法實行標準化的重要性。

在梅毒臨床前開發(fā)疫苗方法學方面，一個重大進步是應用實時定量PCR(qPCR),該技術可以在家兔感染Tp的遠端部位對Tp-DNA進行靈敏的定量檢測[8]，但無法區(qū)分Tp死活，也很難從復雜組織中(如淋巴結)有效提取DNA。熒光原位雜交(FISH) 應用一個可識別Tp 16s rRNA的種特異性探針，能對人和兔組織樣本中的Tp進行定位分析[9]，提供更多信息。

2 梅毒疫苗成功接種需要的相關免疫保護因素

強烈的遲發(fā)型超敏反應(DTH)對有效清除損害部位的Tp至關重要[10]。通過CD4+Th1細胞、NK細胞、CD8+CTL等局部分泌的Th1型細胞因子(如IFN-γ)活化巨噬細胞，促進其吞噬被特異性抗體調理的Tp，被認為是清除Tp的主要機制。

除細胞免疫應答外，體液免疫應答也是必不可少的。然而抗體調理巨噬細胞吞噬進程緩慢，且某些Tp亞群可以逃避調理吞噬作用，這些持續(xù)存在的亞群可能對調理素(抗體)敏感性不同，這與表面抗原暴露的差異性或抗原變異有關[3]。Tp亞群的免疫逃避使目前的疫苗方案難以完全抵抗Tp感染，這對發(fā)展梅毒疫苗是一個巨大挑戰(zhàn)。

基于對Tp免疫清除機制的認識，臨床前疫苗研究應著重于促進Th1型細胞因子產生，因其能激活巨噬細胞和促進Tp的調理吞噬。此外，有效免疫還需針對那些能抗巨噬細胞清除而持續(xù)存在的Tp種群和血管內的Tp，以抑制Tp向感染遠端播散。

3 對HIV陽性者梅毒防護相關因素的再思考

HIV和Tp混合感染導致HIV載量增加，并增加HIV傳播風險。Tp感染時，主要依賴CD4+T細胞活化的DTH對清除病變部位Tp至關重要，但HIV可破壞感染者的CD4+Th細胞致其數(shù)量偏低。在HIV陽性者的硬下疳部位，CD8+T細胞替代耗竭的CD4+Th細胞而成為主要淋巴細胞，產生IFN-γ等細胞因子，活化硬下疳部位的巨噬細胞。此外，HIV陽性者的CD4+Th2細胞受損，B細胞缺乏其輔助使血清中特異性抗Tp抗體活性較低[11]，不利于病變部位Tp清除。了解HIV陽性者體內這一免疫應答變化特點和代償清除機制，對于開發(fā)梅毒疫苗去保護這一最重要的目標人群至關重要。此類疫苗接種應能促進包括CD8+T細胞和NK細胞等免疫細胞產生Th1型細胞因子。然而，在為HIV陽性者開發(fā)有效疫苗之前，還需更好理解HIV陽性者體內調理素應答的變化，以及CD8+T細胞和NK細胞在梅毒損傷中的作用。

4 梅毒疫苗設計應考慮的關鍵問題

成功的梅毒疫苗需要考慮四個方面[3]：在感染部位形成的高度傳染性的硬下疳；Tp的高度侵襲力；Tp的重復感染能力；Tp逃避強烈免疫應答清除的能力。因此，有效的梅毒疫苗應能防止梅毒硬下疳的發(fā)展、梅毒的傳播、梅毒的持續(xù)感染和再感染[3]，以消除感染者癥狀和疾病在總人口中的傳播。如上所述，Tpr蛋白家族中的某些蛋白免疫新西蘭兔后能減緩硬下疳的發(fā)展，預測這些蛋白亞家族成員暴露在Tp表面[3,12]，在預測的表面暴露環(huán)狀區(qū)域出現(xiàn)廣泛的序列變異[13]，表明其在Tp持續(xù)感染和再感染中也發(fā)揮作用。關于Tp高度侵襲力，已證明Tp0751是一種對細胞外基質(ECM)和細胞均具有黏附作用的黏附素，提示Tp通過其經(jīng)血液播散[14]。其他已發(fā)現(xiàn)的黏附素包括Tp0136[15]、Tp0155[16]、Tp0483[16]、Tp0750[17]和Tp0435[18]，可能在Tp播散中起相似作用。由于在Tp感染時發(fā)病機制復雜，很可能需要多種Tp抗原的混合物接種以獲得完全保護，因此上述致病因子可能是多價疫苗的候選分子。

梅毒臨床前疫苗開發(fā)過程中需要評估幾個關鍵問題，包括為獲得最大免疫力所需要接種次數(shù)，疫苗接種后誘導免疫持續(xù)時間，對不同菌株的交叉保護，合適的多價疫苗的制備，佐劑的選擇與優(yōu)化等等，以獲得免疫應答有效保護機體抗Tp感染。

5 未來發(fā)展梅毒疫苗的策略與措施

首先需得到政府有關部門的重視和資金投入，吸引大量的研究人員從事梅毒基礎研究，以提供新的思路和跨學科的研究方法，尤其在宿主-病原體相互作用、Tp基礎生物學和動物模型的研究領域。其次，應用反向疫苗學和現(xiàn)代研究手段(包括先進的結構方法學與蛋白質組方法學)開展Tp基礎生物學研究，鑒定與病原體-宿主間相互作用和致病有關的重要抗原[19]，進而篩選新的疫苗候選分子；同時應用其他病原體研究先進的疫苗方法學，從維持抗原分子天然構象(如采用核酸疫苗形式)、疫苗分子間協(xié)同效應、佐劑(如菌影[20])、免疫策略(初免-加免)、免疫途徑(改變免疫應答類型)等方面進行選擇和優(yōu)化[5]，進而發(fā)展多價疫苗，誘導系統(tǒng)和局部黏膜產生持久的細胞免疫和體液免疫應答以有效保護機體抗Tp感染。此外，還需發(fā)展檢測家兔種屬特異性的免疫試劑，如各類細胞因子檢測試劑；建立Tp抗原制備和接種與攻擊感染標準化操作程序以減少或消除實驗室間的誤差[3]。

梅毒疫苗的發(fā)展需要專用資金來評估當前和未來的候選疫苗。為確保成功，政府和監(jiān)管機構應優(yōu)先考慮發(fā)展梅毒疫苗，同時資助機構、非營利和慈善組織及行業(yè)合作伙伴給予支持，特別是行業(yè)合作伙伴需要獲得擔保以生產和銷售梅毒疫苗。有理由相信，在持續(xù)資助和研究人員共同努力下，預期在10年時間內可望獲得用于臨床的梅毒候選疫苗。