大力加強結(jié)核感染與發(fā)病機理及其實驗室診斷技術(shù)的研究

賀文從 趙雁林

近年，隨著耐藥結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)生、MTB與HIV雙重感染的增加以及流動人口的增多，全球結(jié)核病疫情呈現(xiàn)明顯的上升趨勢[1]。2016年，我國結(jié)核病的患者發(fā)病例數(shù)居全球當年總發(fā)病例數(shù)的第三位，僅次于印度和印度尼西亞，占全球總患者例數(shù)的10%[2]，防治形勢依舊嚴峻。而深入了解結(jié)核感染發(fā)生的條件及其演變規(guī)律對結(jié)核的有效防控至關(guān)重要?；诖?，筆者從宏觀和微觀角度分別闡述了結(jié)核病的發(fā)病歷程和發(fā)病機理，以期揭示結(jié)核感染的發(fā)生、發(fā)展、傳播、轉(zhuǎn)歸，及其演變過程，為相關(guān)政策的制定和研究的開展提供依據(jù)。

著力加強結(jié)核感染與發(fā)病研究

結(jié)核病是由MTB引起的慢性呼吸道傳染病，可累及全身多個器官，以肺部受累形成肺結(jié)核最為常見。人主要通過吸入帶菌的飛沫核而引起感染，其他感染途徑如消化道、皮膚、泌尿生殖系統(tǒng)等均較少見[3]。易感者吸入帶菌的飛沫核后，一般宿主會通過細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來限制MTB的增殖和擴散。少量、毒力弱的MTB多能被人體免疫防御機制所殺滅而清除，僅當受大量毒力強的MTB侵襲而機體免疫力不足時，感染后才會發(fā)病，即為原發(fā)性肺結(jié)核[4]。原發(fā)性肺結(jié)核多見于兒童，成人少見，包括原發(fā)綜合征和胸內(nèi)淋巴結(jié)結(jié)核。原發(fā)綜合征的肺部原發(fā)灶好發(fā)于上葉下部和下葉上部。初次感染MTB時，由于早期特異性免疫力尚未形成，MTB沿引流淋巴管侵入肺門淋巴結(jié)，甚至有早期菌血癥，形成播散病灶在其他臟器潛伏下來，成為日后肺外結(jié)核病的來源[5]。大多數(shù)肺部原發(fā)病灶、淋巴管炎和淋巴結(jié)炎癥狀較輕并可自愈，少數(shù)由于機體免疫力明顯低下或MTB毒力強、數(shù)量大及機體劇烈變態(tài)反應(yīng)，發(fā)展為原發(fā)性肺結(jié)核。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、盜汗、咳嗽、食欲不振、體質(zhì)量減輕等慢性消耗性疾病特征[5]。

結(jié)核病的許多癥狀是宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致的，而非MTB的直接毒性作用。從臨床癥狀可以得到如下結(jié)論，MTB成功感染需要3個階段[6]：(1)在巨噬細胞中成功繁殖；(2)MTB能夠修飾宿主的免疫反應(yīng)，使宿主能夠控制但不能根除細菌；(3)能夠在宿主中相對不活躍的持續(xù)存在而保留被激活的潛力。過去研究普遍認為，MTB一旦進入下呼吸道被肺泡巨噬細胞吞噬后，就會不可避免地形成“一旦感染，終生攜帶”的慢性感染結(jié)局[7]。而Ewer等[8]研究表明，在早期感染階段，少部分人群可清除MTB，只有不到10%的感染者在初次感染后會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，而大多數(shù)人都可以通過細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)形成肉芽腫將感染局限化。MTB侵入人體后 4～8 周，身體組織對MTB及其代謝產(chǎn)物發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，局部出現(xiàn)炎性滲出，甚至干酪樣壞死，常伴有發(fā)熱、乏力及食欲減退等全身癥狀，此時結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)可呈陽性反應(yīng)[6]。在該生理狀態(tài)下殘留的少量MTB就形成了潛伏結(jié)核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)狀態(tài)。潛伏感染者無明顯結(jié)核病的臨床癥狀體征，亦不會引起結(jié)核病的傳播流行，但流行病學(xué)研究表明，潛伏感染者是活動性結(jié)核病發(fā)生的主要來源[9]。其高危人群主要包括HIV感染者、接受免疫抑制治療的患者以及患有慢性系統(tǒng)性疾病患者，包括終末期腎病、風(fēng)濕性疾病、糖尿病等[10]。

目前研究表明結(jié)核病的發(fā)生可大致分為兩個階段[10]，第一階段是LTBI，即MTB感染人體，不產(chǎn)生臨床癥狀和體征，一般通過TST和(或)γ-干擾素釋放試驗(IGRA)進行診斷；第二階段是大約 10% 的LTBI患者會發(fā)展成活動性結(jié)核病，在HIV感染者中該比率可高達10%～15%[11]，具體表現(xiàn)為MTB的痰培養(yǎng)或抗酸桿菌(AFB) 涂片陽性，胸片特征性表現(xiàn)和結(jié)核病癥狀如持續(xù)咳痰、發(fā)熱、體質(zhì)量下降等?；顒有越Y(jié)核病臨床癥狀和影像學(xué)特征明顯，且具有較強的傳播能力，健康者可吸入其咳嗽或噴嚏的飛沫而引發(fā)新一輪的結(jié)核感染和流行。

作為以飛沫核傳播為主的肺結(jié)核，MTB以氣溶膠的形式進入肺泡后，巨噬細胞和樹突狀細胞可以分別通過固有吞噬受體和模式識別受體 (PRRs) 來識別MTB，進而刺激宿主的免疫應(yīng)答[12]。經(jīng)處理的結(jié)核抗原由主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ處理呈遞給CD4+T細胞，由MHCⅠ呈遞給CD8+T細胞, 以啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答[7]。活化 CD4+T 細胞是根據(jù)細胞因子分泌的不同被分成不同的功能亞群， 如 輔助性(Th)1、Th17、Th2 和調(diào)節(jié)性T 細胞 (Treg)。 活化 CD8+T 細胞成為細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTLs) 通過顆粒胞吐作用和凋亡殺死感染細胞。免疫高峰期過后，大多數(shù)活化效應(yīng) T細胞凋亡, 只有少數(shù)發(fā)展成記憶 T 細胞 (Tm)[7]。以兔為模型的研究表明，MTB感染的嚴重性與帶菌的顆粒大小呈現(xiàn)負相關(guān)[13]，小的顆粒可以深入肺下部；在肺上部，一些共生菌已經(jīng)表達的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)通過Toll樣受體信號(Toll-like receptor, TLR)通路招募巨噬細胞等固有免疫細胞，可以清除MTB。而在肺下部，PAMPs會被MTB表面的巰基乙酸二甲酯(phthiocerol dimycocerosates，PDIM)封鎖而不能發(fā)揮機體的清除作用，使MTB更易感染人體而致病[12]。感染期間，MTB首先感染抗原提呈細胞，包括巨噬細胞和樹突狀細胞。MTB可以表達酚糖脂，誘導(dǎo)其表面產(chǎn)生CCL2，因此可以招募和感染更多的依賴細胞表面趨化因子受體2(CCR2)的巨噬細胞和淋巴細胞，進一步形成結(jié)核感染的標志性病理結(jié)構(gòu)——結(jié)核肉芽腫[12]。肉芽腫中心聚集有大量的中性粒細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)和大量的CD4+T細胞以及少量的CD8+T細胞，大量成纖維細胞聚集在外圍[14]。大多數(shù)感染的人都存在肉芽腫的潛伏狀態(tài), 而一些可能發(fā)展成活動性肺結(jié)核與播散性肉芽腫。近期以斑馬魚為感染模型的研究發(fā)現(xiàn)，肉芽腫可以為MTB提供更多的氧氣和營養(yǎng)來源，有利于其生長復(fù)制。在以鼠為模型的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核肉芽腫起始于樹突狀細胞，然后招募巨噬細胞和中性粒細胞，該過程發(fā)生于適應(yīng)性免疫啟動之前。在有些動物模型中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核肉芽腫內(nèi)部嚴重缺氧，該現(xiàn)象與人體肉芽腫情況相一致，常因營養(yǎng)或氧缺乏而形成中心干酪樣壞死[15]。

在人體內(nèi)，MTB 差異區(qū)域(region of diffe-rence-1, RD-1)編碼Ⅶ型分泌系統(tǒng)(type Ⅶ secretion system，T7SS；或稱ESX分泌系統(tǒng))-1刺激宿主表達基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)以吸引巨噬細胞到感染部位形成肉芽腫[16]。招募的巨噬細胞吞噬入侵的MTB，并分泌促炎細胞因子和趨化因子，然后中性粒細胞聚集到該部位，通過還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶依賴機制殺滅MTB[17]。當中性粒細胞清理失敗時，巨噬細胞會將MTB內(nèi)化處理，進一步激活T細胞、NK細胞等。淋巴結(jié)引流區(qū)的樹突狀細胞也會激活CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞是被招募最快的主要細胞類型，它們圍繞在由巨噬細胞和抗原提呈細胞聚集形成的結(jié)核性肉芽腫中心。部分CD8+T細胞也被招募到肉芽腫的周圍，最外面是由成纖維細胞和其他的細胞外基質(zhì)成分組成[18]。

結(jié)核性肉芽腫通常被認為是對宿主的一種保護機制，因其將MTB局限化，使其不能感染鄰近組織，當宿主可以成功控制感染時，肉芽腫會脫水鈣化[19]。在大多數(shù)患者中，MTB會在與宿主的抗爭過程中達到一種平衡狀態(tài)，即為潛伏感染。這種潛伏感染狀態(tài)是不穩(wěn)定的，可以被HIV感染、寄生蟲感染等外源性感染或者營養(yǎng)不良等免疫功能不足激活。在這種情況下，MTB會迅速繁殖，引起肉芽腫崩裂，使病原菌得以在體內(nèi)播散。有研究表明，肉芽腫實際上由MTB誘導(dǎo)形成，并有利于病原體的擴散[20]，因為肉芽腫誘導(dǎo)形成的血管可以為MTB提供生長復(fù)制的氧氣和營養(yǎng)。肉芽腫的形成是病原體和宿主相互作用的動態(tài)過程，肉芽腫在結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中扮演了雙重角色。從一定程度上講，肉芽腫的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸決定著結(jié)核病的病程和感染的最終結(jié)果[20]。

結(jié)核病是由MTB感染后引發(fā)的宿主慢性肉芽腫及其延續(xù)的免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的。MTB的感染可能導(dǎo)致不同的感染結(jié)果，但究竟何種因素決定了MTB感染結(jié)果還不得而知。在恒河猴感染模型中，多個基因型的MTB混合后感染同一宿主，不同的結(jié)核病灶常常由不同基因型的細菌誘導(dǎo)形成。即使是同一個菌株感染同一個宿主，在肺臟的不同部位的感染結(jié)果也不盡相同。目前的研究結(jié)果認為，感染結(jié)果與感染部位的微環(huán)境尤其是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的殺傷速度相關(guān)[21]，MTB成功感染機體，形成的肉芽腫內(nèi)部也具有各自不同的微環(huán)境和免疫平衡，從而最終決定了感染狀態(tài)和疾病走向。據(jù)此可知，基于免疫微環(huán)境的研究，勢必利于更好地了解MTB感染的最終結(jié)局和免疫機制的相關(guān)性，為靶向化療藥物的開發(fā)研制奠定理論基礎(chǔ)。

努力提高結(jié)核病診斷與預(yù)后判斷的研究

結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)方式主要分為被動發(fā)現(xiàn)和主動發(fā)現(xiàn)。被動發(fā)現(xiàn)是指患者出現(xiàn)結(jié)核可疑癥狀后主動到相關(guān)醫(yī)療機構(gòu)就診，此為一項經(jīng)常性的患者發(fā)現(xiàn)手段。主動發(fā)現(xiàn)主要是指衛(wèi)生主管部門醫(yī)療保健單位組織針對人群開展的與肺結(jié)核有關(guān)的醫(yī)學(xué)檢查，包括普查和重點人群檢查。由于普查的成本-效益較低，一般多采用重點人群篩查。重點人群主要包括肺結(jié)核患者的密切接觸者、糖尿病患者、既往結(jié)核病患者、腫瘤患者、HIV感染者以及疑似肺結(jié)核癥狀者等。在結(jié)核潛伏感染階段，患者無明顯臨床癥狀和體征，臨床多通過TST和(或)IGRA進行診斷，當發(fā)展為活動性結(jié)核病時，可表現(xiàn)為痰A(chǔ)FB涂片和培養(yǎng)陽性，胸片特征樣改變，以及諸如咳嗽、咳痰、低熱、盜汗、體質(zhì)量下降等臨床表現(xiàn)。

結(jié)核病的實驗室診斷方法主要包括細菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)檢查。傳統(tǒng)的細菌學(xué)診斷主要通過痰涂片染色鏡檢和培養(yǎng)，但涂片鏡檢的敏感度低，導(dǎo)致該方法的臨床漏診率較高。李強等[22]研究發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌自動熒光染色和顯微鏡掃描技術(shù)在檢測MTB的敏感度和特異度較高，可作為傳統(tǒng)的涂片鏡檢檢測的替代工具。在診斷中一貫作為金標準的痰培養(yǎng)也因前處理繁瑣、培養(yǎng)耗時長、易污染等因素常延誤結(jié)核病的診斷和治療。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以核酸擴增為基礎(chǔ)的檢測方法相繼建立，如：美國Cepheid公司開發(fā)的集痰標本處理、DNA提取、核酸擴增、利福平耐藥rpoB基因突變檢測為一體的全自動分子診斷方法，GeneXpert MTB/RIF具有較高的敏感度和特異度[23]。金法祥等[24]研究以MGIT 960 液體培養(yǎng)作為診斷的金標準證實了GeneXpert MTB/RIF臨床應(yīng)用及推廣價值。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)使用多個特異引物和一個鏈置換酶實現(xiàn)PCR反應(yīng)在恒溫條件下快速進行，大大提高試驗效率和降低實驗室成本[25-26]；實時熒光恒溫擴增(simultaneous amplification and testing，SAT)將新一代恒溫擴增與實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合，可準確鑒定MTB與非結(jié)核分枝桿菌，聶曉平等[27]評估了該技術(shù)對肺外結(jié)核病的臨床診斷價值，發(fā)現(xiàn)SAT具有操作方便快速、檢出率高、敏感度和特異度均較高的優(yōu)勢。但該技術(shù)也存在微量污染、假陽性等問題，因此，應(yīng)嚴格操作規(guī)范、減少假陽性產(chǎn)生[28]。免疫學(xué)檢測方法主要有結(jié)核菌素試驗(PPD)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)等。由于受接種卡介苗的影響，PPD試驗的特異度較低；ELISA主要用于檢測血清中的特異性抗體，由于分枝桿菌種屬間存在共同抗原決定簇以及抗原性較弱等原因，該方法的敏感度和特異度偏低[29]，但有研究發(fā)現(xiàn)基于MTB特異性分泌蛋白MPB64建立的ELISA方法具有高敏感度[30]；T-SPOT.TB 是由酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)發(fā)展而來，通過檢測γ-干擾素水平，判斷是否具有針對MTB特異性的T細胞反應(yīng)，其敏感度和特異度較高，但存在結(jié)果易受到干擾、操作復(fù)雜、耗材相對昂貴等缺陷[31]。劉浩然等[32]研究發(fā)現(xiàn)通過檢測胸腔積液中巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)水平對肺結(jié)核和肺癌有一定的鑒別診斷作用。目前，實驗室檢查可采用多種檢測方法聯(lián)合應(yīng)用，以期達到優(yōu)勢互補、提高檢出率的目的。

注重循證決策，不斷深入開展對結(jié)核病防治重點及難點問題的研究

近年耐多藥結(jié)核(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的出現(xiàn)以及HIV與MTB雙重感染給結(jié)核病的預(yù)防與控制工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)[23, 33]。其中，治療方案不合理、患者依從性差以及宿主免疫損害增多等因素是導(dǎo)致耐藥結(jié)核病產(chǎn)生的主要原因[34]，當然，原發(fā)性耐藥MTB菌株的傳播也是不容忽視的重要原因[35]。耐藥結(jié)核病病程長、死亡危險大、傳染期長，增加了耐藥結(jié)核病傳播的機會，并使總體人群暴露于耐藥MTB的危險之中。同時，HIV與MTB雙重感染是艾滋病及結(jié)核病防治工作的重點，結(jié)核病是HIV感染者最常見的機會性感染和主要死因之一，兩者感染的發(fā)生密切相關(guān)[33]。HIV的感染一方面加快了MTB感染者發(fā)展為活動性肺結(jié)核患者的進程，另一方面，HIV感染破壞了患者機體的免疫系統(tǒng)，致使機體對MTB的抗原應(yīng)答能力嚴重受限，增加了機體對MTB的易感性，也加大了結(jié)核病內(nèi)源性復(fù)燃或外源性再感染的風(fēng)險。此外，一旦結(jié)核病患者感染了HIV，也會使結(jié)核病病情迅速發(fā)展，兩者互相促進，加速病情惡化[11]。

MTB與宿主的相互作用是一個動態(tài)的演化過程，結(jié)核感染的進程和最終結(jié)局與宿主和病原體的因素均密切相關(guān)。此外，結(jié)核病是一種古老的疾病，在長期的與人類抗結(jié)核感染的斗爭中，也不斷發(fā)生著基因的演變和進化，進而出現(xiàn)了MDR-TB和XDR-TB ，給結(jié)核病的防控工作帶來巨大挑戰(zhàn)。目前，結(jié)核病完全防治的實現(xiàn)仍是一個世界性的醫(yī)療難題。其防控工作不僅要注重對結(jié)核病診斷和治療，更要加強對結(jié)核病防治的科學(xué)研究。將宿主、病原菌以及環(huán)境3個要素有機結(jié)合起來，充分融合當代先進分子生物學(xué)技術(shù)，加強國內(nèi)外戰(zhàn)略資源共享，同時注重對結(jié)核病疫苗、診斷和治療藥物的研究，從三級預(yù)防策略著手，以期達到科學(xué)、高效防控結(jié)核病，為實現(xiàn)2035年終止結(jié)核病流行的戰(zhàn)略目標做貢獻。