數(shù)字PCR技術(shù)在臨床中的應(yīng)用

蔣惠莉

（青海省西寧市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 青海 西寧 810000）

基因擴(kuò)增技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中非常重要的實(shí)驗(yàn)方法。近年來發(fā)展迅速，從最初采用凝膠電泳法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性或半定量分析[1]，到目前廣泛使用的根據(jù)熒光探針信號(hào)實(shí)時(shí)觀察和已知標(biāo)準(zhǔn)品來推算未知樣本拷貝量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qPCR)[2]，現(xiàn)在已發(fā)展到可以對(duì)核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量的數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)。數(shù)字PCR不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值（CT）和標(biāo)準(zhǔn)曲線等參數(shù)，與常規(guī)定量PCR技術(shù)相比，具有更高的重復(fù)性、靈敏性及準(zhǔn)確性[3-5]。本文主要從dPCR方法的原理，優(yōu)勢及其在醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面進(jìn)行了闡述。

1.數(shù)字PCR基本原理

1999年，美國學(xué)者Kenneth Kinzler與Bert Vogelstein首次提出了“數(shù)字 PCR”的概念[6]。dPCR的基本原理大致分為三個(gè)步驟，第一步將PCR反應(yīng)體系分配到大量微小的反應(yīng)單元中，使每個(gè)微反應(yīng)單元中不包含或包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，其目的是為了實(shí)行單分子模板擴(kuò)增。第二步，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)束后檢測每個(gè)反應(yīng)單元熒光信號(hào)的有無。第三步，最終根據(jù)泊松分布原理，通過統(tǒng)計(jì)分析陽性反應(yīng)單元的個(gè)數(shù)與比例，計(jì)算出目的核酸序列的拷貝數(shù)[7]。根據(jù)對(duì)反應(yīng)體系的分配方式不同，數(shù)字PCR主要分為微流體芯片式數(shù)字PCR(cdPCR )和微滴式數(shù)字PCR(ddPCR )兩大類[7]。

2.數(shù)字PCR的優(yōu)勢

2.1 絕對(duì)定量

dPCR采用終點(diǎn)熒光檢測和陽性反應(yīng)單元比例進(jìn)行定量分析，與qPCR相比較不需要標(biāo)準(zhǔn)品，也不需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量[1]。

2.2 抑制劑耐受性強(qiáng)

dPCR在反應(yīng)體系分配的過程中，不僅使目的序列分配到每個(gè)反應(yīng)單元，同時(shí)其反應(yīng)抑制物也被被均勻分配到每個(gè)反應(yīng)單元，從而降低了抑制劑對(duì)反應(yīng)的干擾。所以，dPCR較適合檢測復(fù)雜樣品中核酸的絕對(duì)定量。

2.3 高靈敏度和高精準(zhǔn)度

dPCR是將PCR反應(yīng)分割在數(shù)萬個(gè)獨(dú)立單元中進(jìn)行降低了抑制物影響，從而提高了檢測的靈敏度，可以精確地檢測出變化很小的目的序列。并且分割的獨(dú)立反應(yīng)單元數(shù)目越多，其靈敏度與準(zhǔn)確度也越高[2]。

3.數(shù)字PCR在臨床中的應(yīng)用

3.1 癌癥早期發(fā)現(xiàn)與診斷

隨著對(duì)癌癥的不斷認(rèn)識(shí)，大量研究表明癌癥是由于癌基因及抑癌基因的突變、插入或缺失等的一種基因（染色體）異常變化引起的疾病[8]。篩查患者外周血中游離的循環(huán)腫瘤DNA（cell-free circulating tumor DNA，ctDNA），對(duì)發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，及腫瘤的發(fā)展及復(fù)發(fā)進(jìn)行觀測有著重要的意義[9]。不過，循環(huán)腫瘤DNA含量低，通常與大量正常細(xì)胞同時(shí)存在，對(duì)檢測手段的靈敏度及抗干擾有著更高的要求。數(shù)字PCR的檢測靈敏度可達(dá)到0.0001%～0.001%[10]，特別適合在復(fù)雜樣本中檢測稀有突變。Kinugasa H等學(xué)者利用dPCR技術(shù)對(duì)75例胰腺癌患者血清K-ras基因突變進(jìn)行分析，并將其結(jié)果與生存率進(jìn)行比較，ctDNA分析可作為檢測胰腺癌患者基因突變的一種非侵入性檢測方法，也可作為診斷胰腺癌和預(yù)測生存的新策略[11]。

3.2 產(chǎn)前診斷

產(chǎn)前診斷是優(yōu)生和預(yù)防缺陷兒的出生的非常重要的手段,通過羊水及母血清篩檢胎兒遺傳物質(zhì)是否有異常是目前產(chǎn)前篩查較長用的方法，尤其是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷能夠更早、更快、更安全的進(jìn)行產(chǎn)前診斷。然而,胎兒游離DNA在母體血漿DNA占10%～20%[12]，極低含量的胎兒游離 DNA混雜于大量母體DNA中[7]，選擇合適的方法學(xué)尤為重要。dPCR可從高背景母體DNA中識(shí)別少量胎兒DNA分子，在介入性產(chǎn)前診斷及無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷胎兒非整倍體疾病、單基因病等方面都具有重要作用[13]，而且能夠檢測到存在的嵌合體或污染母體DNA的信號(hào)[14]。Tsui NB等利用dPCR技術(shù)研究胎兒血友病突變基因，在12例樣本中準(zhǔn)確識(shí)別出7個(gè)具有突變基因的胎兒[15]。

3.3 病原微生物分子診斷

目前，對(duì)病原微生物核酸的檢測，應(yīng)用于臨床多為實(shí)時(shí)熒光定量PCR，定量檢測需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，不同廠家及不同批次的標(biāo)準(zhǔn)品均有可能影響定量結(jié)果。數(shù)字PCR結(jié)果分析不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果重復(fù)性較好，并且其高靈敏的特點(diǎn)更加適用于對(duì)低拷貝的目的基因檢測。Sedlak RH等進(jìn)行了人類巨細(xì)胞病毒對(duì)造血細(xì)胞或器官移植患者的發(fā)病和死亡的研究，發(fā)現(xiàn)dPCR技術(shù)能夠更早的檢測到患者外周血中的巨細(xì)胞病毒，從而能盡早治療，減低移植失敗率[16]。

3.4 器官移植

患者接受器官移植后自身免疫系統(tǒng)可能把移植器官當(dāng)做異物，引起排異反應(yīng)。傳統(tǒng)監(jiān)測指標(biāo)多數(shù)為檢測患者血液中各類蛋白、酶類、代謝物等濃度水平，其不能及時(shí)的評(píng)估早期器官移植的損傷[17]。由于器官移植也是基因組移植，對(duì)移植器官的游離DNA(graft-derived circulating cell-free DNA，GcfDNA)進(jìn)行監(jiān)測，可早期發(fā)現(xiàn)移植物損傷，從而早期干預(yù)，改善移植患者的預(yù)后[17][18]。數(shù)字PCR可以快速地量化GcfDNA的百分比和絕對(duì)數(shù)量，這個(gè)過程不需要供體DNA，因此可以應(yīng)用于任何器官捐贈(zèng)者/受體對(duì)[17]。Schutz E等學(xué)者，使用液滴數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)對(duì)115名肝移植患者血漿GcfDNA進(jìn)行監(jiān)測，研究結(jié)果表明GcfDNA的診斷敏感性和特異性分別為90.3%和92.9%，與傳統(tǒng)的常規(guī)肝功能檢查相比，在肝移植患者中對(duì)急性排斥反應(yīng)更為敏感[19]。Beck等研究者使用dPCR檢測GcfDNA，檢測出穩(wěn)定肝移植患者體內(nèi)GcfDNA的含量小于6.8%，穩(wěn)定腎移植患者小于2.5%,心移植小于3.4%[7][20]。

4.結(jié)語

數(shù)字PCR的出現(xiàn)為分子生物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域提供了新的實(shí)驗(yàn)方法，其應(yīng)用也越來越廣泛。但是，目前數(shù)字PCR由于每塊芯片的數(shù)萬個(gè)反應(yīng)單元都是對(duì)單一樣本分析，通量較低，故實(shí)驗(yàn)成本高[2]。另外，dPCR對(duì)較高濃度樣本檢測時(shí)，當(dāng)數(shù)萬個(gè)檢測單元達(dá)到飽和，其絕對(duì)定量結(jié)果就不十分精準(zhǔn)。隨著對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的不斷研究，dPCR技術(shù)會(huì)進(jìn)一步發(fā)展與完善，將有著更加廣闊的應(yīng)用前景。

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