梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

陳靄延

（廣西梧州市皮膚病防治院 廣西 梧州 543000）

梅毒是人類獨(dú)有的疾病，梅毒螺旋體(T.pallidum，TP)是梅毒的病原體，患者是梅毒唯一傳染源。梅毒有先天性和獲得性兩種，前者TP通過胎盤由母體傳染胎兒；后者主要經(jīng)性接觸傳播，也可經(jīng)輸血引起輸血后梅毒。本病病程長(zhǎng)，在發(fā)展過程中可侵犯任何器官和組織，引起多種多樣的癥狀和體征，甚至危及生命。另外，梅毒作為一個(gè)極其容易潛伏的疾病，往往患者患病多年都無非常明顯的癥狀凸顯[1]。梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢查和梅毒的核酸檢查三大類。近年來，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得快速、敏感、特異的梅毒診斷方法不斷更新完善，有利于廣泛開展流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防控制以及指導(dǎo)臨床及時(shí)治療，以控制梅毒的傳播流行。

1.病原學(xué)檢查方法

病原學(xué)檢測(cè)及梅毒螺旋體檢查，適用于I、Ⅱ期梅毒有病損者的患者。主要有三種方式，暗視野顯微鏡檢查、鍍銀染色檢查以及直接免疫熒光試驗(yàn)（DFA）檢查，是診斷早期梅毒首選的方法，孕婦的羊水作暗視野顯微鏡檢查TP，對(duì)先天梅毒具有診斷價(jià)值[2]。病原學(xué)檢測(cè)有利于早期患者早日確診，不耽誤治療的有效時(shí)間，減輕了患者的痛苦，降低了疾病的惡化率，為后期預(yù)防和進(jìn)一步傳播有著十分重要的意義。

1.1 暗視野顯微鏡檢查法

臨床醫(yī)學(xué)中暗視野顯微鏡檢查法是早期梅毒患者最主要的病原學(xué)的檢測(cè)方法。其原理是顯微鏡聚光鏡中央有擋光片，利用光的散射現(xiàn)象，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。通過硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下檢查，見到運(yùn)動(dòng)活潑，沿其長(zhǎng)軸滾動(dòng)、屈伸、旋轉(zhuǎn)、前后移行等的螺旋體，可作為梅毒的確診依據(jù)。假若是陰性，需要在3周不同的3日內(nèi)進(jìn)行再次采樣檢測(cè)，最終若依舊是陰性才能進(jìn)行確診[3]。該檢測(cè)方法受取材及特殊顯微鏡限制，準(zhǔn)確性受操作者的經(jīng)驗(yàn)、病灶中活螺旋體的數(shù)量以及口腔、肛門破損處存在的非致病性螺旋體等因素的影響。

1.2 鍍銀染色法

從臨床意義來看與暗視野顯微鏡檢查法一致。因螺旋體具有親銀性，高倍顯微鏡螺旋體呈現(xiàn)棕黑色的顯像，背景為黃色。

1.3 直接免疫熒光法（DFA）

特異性和敏感性均優(yōu)于暗視野顯微鏡檢查法和鍍銀染色法，國(guó)外臨床醫(yī)學(xué)采用較多，直接免疫熒光法，通過異硫氰酸熒光素標(biāo)記TP單克隆抗體，使得其與TP進(jìn)行結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)蘋果綠色進(jìn)行確診，此法普遍用于區(qū)分TP和其他非致病性或條件致病性螺旋體[4]。

2.血清學(xué)檢查方法

血清學(xué)檢查法有梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)和非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)兩類。

2.1 非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)

非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)的以類脂質(zhì)作為抗原，測(cè)定病人血清中反應(yīng)素（抗脂質(zhì)抗體）。從臨床醫(yī)學(xué)劃分此試驗(yàn)主要有四種，原理基本相同[5]，（1）性病研究實(shí)驗(yàn)室玻片試驗(yàn)（VDRL）：其原理以膽固醇為載體，包被上心脂質(zhì)構(gòu)成VDRL顆粒，與血清中的反應(yīng)素結(jié)合后出現(xiàn)現(xiàn)凝集反應(yīng)，結(jié)果需要低倍顯微鏡觀察。腦脊液VDRL試驗(yàn)是神經(jīng)梅毒可靠性診斷依據(jù)。此方法待檢樣品需經(jīng)56℃滅活，試劑需要現(xiàn)場(chǎng)配制，即配即用，存在相應(yīng)的局限性，此類方法國(guó)內(nèi)的采用的較少。（2）不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)（USR）：是VDRL抗原的改良，即將VDRL抗原用稀釋液稀釋后離心沉淀，于沉淀中加入EDTA、氯化膽堿和防腐劑，敏感性及特異性與VDRL相似。EDTA可使抗原在半年內(nèi)不變性，氯化膽堿可滅活補(bǔ)體等，使用血清可不必加熱滅活?？乖槐孛刻炫渲疲?～8℃冰箱中可保存半年。此種試驗(yàn)雖然沒有較高的要求，但是現(xiàn)今較少使用。（3）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）：也是是改良的VDRL實(shí)驗(yàn)，其原理使用未經(jīng)處理的活性炭顆粒（直徑3～5um）吸附VDRL抗原。此顆粒如與待檢血清中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的黑色凝集塊。（4）甲苯胺紅不加熱試驗(yàn)（TRUST）：以更易觀察的紅色甲苯胺紅作為輔料進(jìn)行試驗(yàn)，最終結(jié)果更易辨識(shí)。

2.2 非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)的缺陷

（1）特異性：某些疾病例如麻風(fēng)、結(jié)核、傳紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的患者，皆會(huì)出現(xiàn)與梅毒類似的反應(yīng)素，在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，對(duì)最終確診帶來干擾[6]，特異性較差。（2）敏感性：當(dāng)感染梅毒螺旋體后機(jī)體特異性梅毒螺旋體抗體要早于反應(yīng)素出現(xiàn)，使得一期梅毒的漏檢率較高，增加了患者病情惡化的系數(shù)[7]。另外晚期梅毒患者的反應(yīng)素轉(zhuǎn)陰率較高，再加上這類試驗(yàn)不利于隱性梅毒的確診，對(duì)于梅毒進(jìn)行篩選排查的漏檢率高。

2.3 非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)

若已確診為陽性患者，對(duì)于臨床開展工作有較好的時(shí)效治療性；非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)可以有效的作為療效觀察的指標(biāo)，來觀察患者梅毒病癥的發(fā)展；此類方法所用費(fèi)用較低，減輕了患者的醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān)[8-9]。

2.4 梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)

用活的或死梅毒螺旋體作為抗原測(cè)定血清中抗螺旋體IgM和/或IgG抗體，其敏感性和特異性優(yōu)于非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，但不能用于療效觀察。梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)一般采用以下幾種方法[10-11]：（1）熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTAABS）；（2）梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）；（3）梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）；（4）梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）；（5）梅毒螺旋體化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（TPCLIA）；（6）梅毒螺旋體快速診斷試驗(yàn)（TP-RT）；（7）梅毒螺旋體免疫印跡法（WB）。

2.5 熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）

FTA-ABS是一種間接熒光抗體法。試驗(yàn)前先用Reiter密螺旋體超聲波裂解物處理待檢血清，以去除非特異性類屬抗原，再與TP作用，然后加用熒光素標(biāo)記的羊抗人丙種球蛋白，在熒光顯微鏡下觀察，是否有熒光的TP，從而檢測(cè)有無特異性抗體。FTA-ABS譽(yù)為檢測(cè)梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”，敏感性和特異性在所有螺旋體試驗(yàn)中尤為突出[12]。但是，此試驗(yàn)操作相對(duì)較難，對(duì)于操作人員的職業(yè)技能要求較高，一般用于篩選實(shí)驗(yàn)陽性標(biāo)本的確診實(shí)驗(yàn)。

2.6 血球凝集試驗(yàn)、明膠凝集試驗(yàn)

梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）以超聲裂解的TP為抗原，由此致敏紅細(xì)胞與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。若進(jìn)行大樣本批量檢測(cè)時(shí)，TPHA優(yōu)于FTA-ABS[13-14]。缺點(diǎn)：需主觀判斷結(jié)果，主觀性較高。梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）在TPHA基礎(chǔ)上進(jìn)行升級(jí)，將梅毒螺旋體Nichols株的精細(xì)菌體成分包被在人工合成的惰性明膠顆粒取代TPHA中的紅細(xì)胞作為進(jìn)行試驗(yàn)的載體。TPPA包含了梅毒螺旋體的所有片段，敏感性更高，結(jié)果更易觀察。TPHA試劑保存時(shí)間短，批間差大，TPPA試劑穩(wěn)定性、特異性、敏感性和批間差均優(yōu)于TPHA。

2.7 梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）

2.7.1 TP-ELIS通過TP抗原包被聚丙乙烯板，再加入待檢血清以及酶標(biāo)記抗原，形成雙抗原夾心，同時(shí)檢測(cè)1gG和IgM抗體[15]。敏感性和特異性就較高，影響因素少，可采用自動(dòng)化操作，費(fèi)用較低廉，因此臨床上常用于大量樣品的篩查和臨床診斷。

2.7.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)梅毒螺旋體IgM抗體，該試驗(yàn)采用間接法或捕獲法。以捕獲法的敏感性和特異性為佳。由于血液中IgG的量高于IgM，為避免交叉反應(yīng)所引起的假陽性，需對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，除去其中的IgG再進(jìn)行IgM測(cè)定。分離去除1gG的常用方法為以抗人IgG等為沉淀劑的柱層析法或免疫沉淀法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)梅毒螺旋體IgM抗體一般用于先天性梅毒的診斷，活動(dòng)性梅毒（新近感染）的診斷及療效觀察，梅毒再感染的診斷[16]。

2.8 梅毒螺旋體化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（TP-CLIA）

TP-CLIA是新近發(fā)展的一種體外快速診斷技術(shù)，其原理與ELISA方法基本相同，只是以化學(xué)發(fā)光底物取代了發(fā)色底物，檢測(cè)的信號(hào)則由光密度（A值）變?yōu)楣庾訑?shù)，較之 ELISA方法，其分析敏感性更低，可報(bào)告范圍更寬[17]。

2.9 梅毒螺旋體快速檢測(cè)試驗(yàn)（TP-RT）

TP-RT多數(shù)用于緊急和實(shí)驗(yàn)條件欠佳的場(chǎng)合，在臨床應(yīng)用中多采用膠體金進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)檢測(cè)IgG、IgM抗體或單測(cè)IgG抗體。無需高精端儀器，試驗(yàn)過程簡(jiǎn)單快速，但測(cè)定結(jié)果受溫度和時(shí)間影響較大。

2.10 梅毒螺旋體免疫印跡法（WB）

WB將TP-Nichols株菌體細(xì)胞破碎，使用凝膠電泳將梅毒螺旋體各種抗原成分轉(zhuǎn)印到膜條上作為固相，膜條與待測(cè)血清和酶標(biāo)抗體孵育，底物顯色后，當(dāng)血清中存在梅毒特異性抗體時(shí)，則在印跡膜上相應(yīng)的特異性多肽抗原位置出現(xiàn)顯色條帶。該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，很少出現(xiàn)假陽性和可疑反應(yīng)是理想的梅毒確認(rèn)實(shí)驗(yàn)[18]。但試劑價(jià)格昂貴，該方法在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)還未廣泛推廣應(yīng)用。

3.其他方法

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：梅毒PCR檢測(cè)方法分為常規(guī)PCR，巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR，多重PCR和實(shí)時(shí)PCR。能對(duì)生殖器潰瘍進(jìn)行早期鑒別診斷。PCR是直接檢測(cè)TP-DNA，PCR檢測(cè)尤其適用于微量TP的檢測(cè)，其檢測(cè)的敏感性和特異性均高于血清學(xué)試驗(yàn)，缺點(diǎn)是假陽性較高。此外，有將PCR用于孕婦產(chǎn)前診斷和神經(jīng)梅毒診斷的報(bào)道[19-20]。PCR的設(shè)計(jì)主要針對(duì)編碼梅毒螺旋特異性抗原和TpN47的DNA開放編碼區(qū)，由于PCR的非特異性、TpN47的保守性，這種設(shè)計(jì)的PCR雖然不能區(qū)分梅毒和雅司；但可區(qū)分梅毒螺旋體和引博氏疏螺旋體。逆轉(zhuǎn)錄PCR是針對(duì)梅毒螺旋體的16srRNA366bp片段的設(shè)計(jì)，其污染少，特異性和敏感性高，但是檢驗(yàn)費(fèi)用稍高。

4.小結(jié)

結(jié)合上述相關(guān)資料顯示可知，在梅毒試驗(yàn)中由于受到方法學(xué)自身的局限性、患者自身狀況的特殊性、實(shí)驗(yàn)器材以及相關(guān)因素的影響，無論何種梅毒檢測(cè)方法，在進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)時(shí)，都具有相應(yīng)的誤差，此種誤差暫時(shí)無法避免，另外在結(jié)果判讀時(shí)，假陰性或假陽性情況的出現(xiàn)亦有存在。綜合分析血清學(xué)檢測(cè)檢測(cè)方法仍是臨床上梅毒實(shí)驗(yàn)診斷的主要方法。多年來通過大量的研究工作，建立了許多檢測(cè)TP的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡技術(shù)為梅毒的診斷提供了新的檢測(cè)手段。未來針對(duì)梅毒的檢測(cè)技術(shù)，必將朝著快速、簡(jiǎn)便、低成本、高檢測(cè)率的方向推進(jìn)。