小PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白印跡及其凝膠電泳玻璃板的改進

馬冠英，趙起超，王 犇，陳麗潔，陳功星

蛋白印跡(western blot)是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù),也是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究最普通的基因表達研究工具。它結(jié)合了電泳分析容量大、分辨率高和免疫分析敏感性高、特異性強的優(yōu)點,此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1]。自從該技術(shù)建立以來,數(shù)十年一直在生物學(xué)研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用[2]。據(jù)相關(guān)報道,通過對抗體進行改進,降低傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免疫印跡法的檢測靈敏度增高,重復(fù)性好,可用于生物樣本中痕量被檢測物的測定[3]。該技術(shù)的主要步驟是電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、顯影,操作過程比較繁瑣,時間和資金有一定的耗費,且存在著進一步提升改進的空間。本文通過減少PVDF膜大小,優(yōu)化了蛋白印跡技術(shù),同時對凝膠電泳玻璃板進行了創(chuàng)造性的改進,使該技術(shù)更加精簡實用[4]。

1 小膜轉(zhuǎn)移蛋白印跡實驗

1.1 實驗材料

蛋白提取、預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)物(marker)、電泳膠及相關(guān)試劑等均購于試劑公司(碧云天生物技術(shù)有限公司),PVDF膜(Immuno-Blot PVDF Membrane),考馬斯亮藍染色液為實驗室參照文獻[5]自配,電泳和轉(zhuǎn)膜設(shè)備(bio-rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白電泳

1.2.2 切膠剪膜

把整個電泳長短兩塊玻璃及其內(nèi)部凝膠,置于裝有一定量的轉(zhuǎn)膜緩沖液中,小心撬開長短玻璃,使凝膠一直貼于長玻璃板上,滑動短玻璃板,根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參的分子量,參照預(yù)染marker位置,以短玻璃板為界尺,用手術(shù)刀片切出含目的蛋白和內(nèi)參的凝膠帶,然后在轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡30 min。

1.2.3 轉(zhuǎn)膜

剪取比轉(zhuǎn)膜凝膠周邊大約2 mm的PVDF膜,用甲醇浸透后約30 s,在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min；再剪2張濾紙(其大小和PVDF膜一致,亦可略大),用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕后,備用。安裝轉(zhuǎn)膜夾 (膜在正極,膠在負極),在低溫恒流250 mA條件下,轉(zhuǎn)膜2 h。

1.2.4 染色與攝像

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,PVDF膜浸在染色液中染色1 min,然后將膜浸在脫色液置于搖床上,每1 h換一次液體,反復(fù)脫色,直到蛋白條帶清晰可見。然后在膜旁放置標(biāo)尺,進行數(shù)碼相機攝像,結(jié)果通過圖形組合顯示。

2 實驗結(jié)果與分析

本實驗中使用了兩塊膠和膜,分別對應(yīng)于完整的膠和沿著49 KD分子切割的膠,完整的膠從大分子到小分子全部轉(zhuǎn)移到大的膜上(如圖1(a)所示),在最大分子標(biāo)記117 KD以下,蛋白質(zhì)條帶明顯,全長在7 cm范圍內(nèi),而小膜轉(zhuǎn)移蛋白在49 KD～19 KD之間,蛋白條帶也明顯,整個膜范圍在近3 cm內(nèi)(如圖1(b)所示),兩張膜的寬度接近,按照電泳玻璃槽的寬度,小膜的面積只有大膜的一半。蛋白印跡分析的轉(zhuǎn)膜實驗,一直有相關(guān)的研究,分子雜交是可以在凝膠上直接進行的,相關(guān)的DNA分子凝膠生物素顯色和增色表明了凝膠上的便利[6],曾經(jīng)有商品化的專用凝膠供應(yīng),但是對于免疫結(jié)合分子的蛋白印跡實驗,存在兩個經(jīng)濟上的缺點。首先,該種凝膠價格昂貴,接近SDS-聚丙烯酰胺凝膠的10倍；其次,雜交過程中的抗體濃度達到了膜上雜交濃度的10倍左右,此外凝膠容易破碎,因此,轉(zhuǎn)膜仍然是目前不可缺少的技術(shù)手段。當(dāng)然,印跡膜除了PVDF膜外,還有醋酸纖維膜、尼龍膜,但后兩種膜在韌性、吸收蛋白、抗化學(xué)處理、保存等綜合性能方面不如前者,PVDF膜機械強度高,與蛋白具有較強的界面相互作用[7],無疑在多數(shù)實驗中是最好的,但也是最昂貴的。所以,PVDF膜使用需要謹慎。轉(zhuǎn)膜常規(guī)做法是電泳結(jié)束后,根據(jù)凝膠的大小,剪裁同樣或者略大于凝膠周邊的膜。本方法先參照預(yù)染Marker分子量,根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白分子量范圍,以短玻璃片為界尺,用手術(shù)刀片切割。當(dāng)然塑料小鏟也能做到,只是沒有手術(shù)刀片切割整齊?？s小凝膠大小,然后剪裁PVDF膜,由于縮小了凝膠,所使用的小PVDF膜不到全膠膜的一半 (如圖1(b)所示),染色的結(jié)果相近。實際上,不管大膜、小膜,最后的結(jié)果都顯示在膜的很小范圍內(nèi),因為目的蛋白分子在膠上分布的范圍很小。對于目的蛋白與內(nèi)參分子量相差較大的轉(zhuǎn)膜,可以參照本方法分別切出兩條小凝膠及相應(yīng)大小的PVDF膜。小PVDF膜除了節(jié)約膜的使用,在抗體雜交使用量上也要經(jīng)濟。PVDF膜適用于所有的蛋白質(zhì)、酶的N末端氨基酸序列分析及總氨基酸組成分析,效果十分理想[8]。本方法僅比常規(guī)方法多了一個裁膠步驟,對于需大量使用PVDF膜進行蛋白印跡分析的生物醫(yī)學(xué)研究及缺乏western blot使用經(jīng)驗的初始研究工作者和高校實驗教學(xué),本方法值得借鑒。

圖1 蛋白轉(zhuǎn)移膜考馬斯亮藍染色

3 凝膠電泳刻度玻璃板設(shè)計

從上述實驗可以看出,凝膠和膜大小參數(shù)模糊,是因為現(xiàn)有的凝膠電泳玻璃板上,沒有任何標(biāo)示,配制膠和電泳過程中,電泳相關(guān)技術(shù)參數(shù)(如分離膠的高度、電泳標(biāo)志物位置和決定凝膠大小等)、凝膠大小和PVDF膜的剪裁難以具體表述,而這些參數(shù)對電泳技術(shù)及后續(xù)的轉(zhuǎn)膜實驗操作產(chǎn)生一定的影響,通常是模糊地口口相傳,沒有具體的大小度量表示和記錄,也就限制了研究經(jīng)驗和技術(shù)的廣泛傳播,研究人員溝通方面缺乏客觀指標(biāo),教學(xué)過程不能明確表示,給研究、教學(xué)工作帶來不便。本文利用AutoCAD軟件進行畫圖,對凝膠玻璃厚板進行創(chuàng)造性的改進,并用photoshop處理完善,生成圖片資料 (如圖2所示)。在垂直凝膠電泳的長玻璃板外面,設(shè)計了縱向刻度標(biāo)尺和橫向刻度標(biāo)尺?？v向刻度標(biāo)尺和橫向刻度標(biāo)尺正交,正交中心位于玻璃板的中心,縱向刻度標(biāo)尺3,位于玻璃板2非凝膠電泳的表面,從下到上蝕刻66個等距離的短線表示 (單位：mm),8個中線和表示單位 (cm) (由1～8阿拉伯?dāng)?shù)字表示,其中1后面標(biāo)示cm)的8個長線,構(gòu)成總長8.3 cm的標(biāo)尺,其中4 cm處未標(biāo)示,并位于玻璃板中心位置,上下兩邊分別標(biāo)出0.15 cm中的1條短線,刻度和數(shù)字均陰文反寫于右邊?？潭葮?biāo)尺4與刻度標(biāo)尺3位于同一表面,從右到左依次標(biāo)示兩塊墊條玻璃之間的距離8.3 cm,其余情況與刻度標(biāo)尺3相同?？v向刻度標(biāo)尺和橫向刻度標(biāo)尺的刻度和符號均為反寫,以方便實際操作讀數(shù)。此設(shè)計讓使用者可以清楚地觀察和交流凝膠電泳過程中,電泳膠配制、電泳標(biāo)志物位置和后續(xù)實驗涉及轉(zhuǎn)移膜等大小參數(shù),簡單實用,此設(shè)計類似于電泳梳的改進[9],都是完善電泳技術(shù)而值得發(fā)展。該技術(shù)有待于進一步地研發(fā),存在一定的社會經(jīng)濟效益。

圖2 刻度玻璃板外側(cè)面

4 結(jié)束語

科學(xué)研究在社會經(jīng)濟發(fā)展中體現(xiàn)了重要的作用,但多數(shù)的科研直接效應(yīng)并不明顯,因此建設(shè)和投入不受重視,而科研直接關(guān)系著個人和部門的發(fā)展,因此實驗室成了稀缺資源,條件越好越稀少,實驗室資源非常有限[10]。實驗室建設(shè)除了貴重儀器設(shè)備外,在很大程度上依賴于實驗技術(shù)的改進和提高,尚可在現(xiàn)有條件下,進行一定程度的改進,解決傳統(tǒng)實驗室面臨的設(shè)備老化及資源緊缺等問題[11-12]。本文闡述了蛋白印跡分析技術(shù)中凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜交流表述方面的參數(shù)與改進,技術(shù)上難度不大,但在此之前,操作過程中存在一定的困難,在高校教學(xué)和科研工作中受到了影響,經(jīng)過查閱資料和實驗研究,反復(fù)比較,總結(jié)成文以饗讀者,尤其是在原來基礎(chǔ)上對凝膠電泳玻璃板進行創(chuàng)造性的改造,進一步完善了蛋白印跡技術(shù),具有一定的知識產(chǎn)權(quán)研發(fā)和推廣價值。此外,本文對于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗的技術(shù)革新和設(shè)備建設(shè),也具有一定的參考意義。

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