新鮮組織短時(shí)固定對(duì)冷凍切片質(zhì)量的影響

方捷迪，王曉星，李爭(zhēng)艷，張夢(mèng)玲，周 琴，易慕華

冷凍切片是在低溫環(huán)境下將術(shù)中取下的新鮮組織快速冷凍至一定硬度再制作切片，常用于臨床病理快速診斷和部分形態(tài)學(xué)研究工作。用于臨床的冷凍切片能夠讓外科醫(yī)師在手術(shù)過(guò)程中盡快了解病變性質(zhì)并及時(shí)決定手術(shù)方式[1-2]。精準(zhǔn)的術(shù)中快速病理診斷結(jié)果，需高品質(zhì)的冷凍切片作為保障。多種因素影響冷凍切片的效果，如冷凍時(shí)間與溫度、取材、切片技術(shù)和染色等[3-4]，而冰晶的形成是影響病理診斷的重要因素之一。因此在冷凍切片中防水是必須注意事項(xiàng)：取材刀具、面板必須擦干，組織不能遇水固定，若組織濕潤(rùn)應(yīng)取紗布擦拭。因受時(shí)間及制片技術(shù)的限制，快速診斷具有更多的局限性和誤診的可能，在工作中我們遇到1例，冷凍報(bào)告發(fā)出20 min后上級(jí)醫(yī)師復(fù)檢切片發(fā)現(xiàn)微小異型，懷疑取材不規(guī)范，此時(shí)組織固定已十多分鐘，用蔗糖處理已不現(xiàn)實(shí)，只有迅速撈出組織重新取材，冷凍切片染色，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)與新鮮組織切片無(wú)差異，打破了冷凍切片組織不能固定遇水的提法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料隨機(jī)選取三峽大學(xué)仁和醫(yī)院手術(shù)室送檢的術(shù)中切除標(biāo)本20例，每例標(biāo)本均確保規(guī)范化操作。

1.2試劑OCT膠水購(gòu)自Leica公司，蘇木精、伊紅、中性樹(shù)膠均購(gòu)自Baso公司，二甲苯、甲醛購(gòu)自武漢市中天公司，無(wú)水乙醇購(gòu)自廣東汕頭西隴公司。10%中性福爾馬林配制：蒸餾水1 000 mL，甲醛溶液(37%)100 mL，磷酸二氫鈉4 g，磷酸氫二鈉6.5 g，用1N氫氧化鈉調(diào)整pH7.2～7.4。

1.3儀器冷凍切片機(jī)(Leica CM1950，德國(guó))。

1.4制片首檢手術(shù)室大體新鮮活體組織并取材，根據(jù)組織類(lèi)型選擇最佳的冷凍溫度直接速凍，實(shí)驗(yàn)中所有切片5 μm厚，切片立即放入95%乙醇中固定10～20 s[5]。采用Gill改良蘇木精染液[6-7]，染色時(shí)間2～3 min，分化返藍(lán)，伊紅30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。醫(yī)師鏡檢，病理報(bào)告發(fā)出后立即用10%中性福爾馬林固定組織，分別固定10、20、30 min，取材、切片、染色等步驟同上。

2 結(jié)果

在取材部位、冷凍時(shí)間與溫度、切片固定方法與時(shí)間、染色過(guò)程相對(duì)一致的前提下，組織處理最佳固定時(shí)間是以在鏡下得到最佳的組織清晰度和最大強(qiáng)度核質(zhì)比的冷凍切片為標(biāo)準(zhǔn)[7]。本實(shí)驗(yàn)選取的術(shù)中切除標(biāo)本20例，快速冷凍切片所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

術(shù)中切除標(biāo)本即時(shí)冷凍切片與組織處理后的冷凍切片行HE染色，與新鮮組織冷凍切片對(duì)比后發(fā)現(xiàn)利用10%中性福爾馬林固定液處理的組織仍適用于快速冷凍切片，因10%中性福爾馬林為甲醛和水的混合溶液，推翻了以往做冷凍切片的組織不能遇水的說(shuō)法。結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，冷凍切片質(zhì)量有所下降，其中以處理時(shí)間10 min組織冷凍切片效果最理想，即組織離體后利用10%中性福爾馬林對(duì)組織進(jìn)行固定，固定時(shí)長(zhǎng)10 min，固定液的量為組織總體積的5～10倍，冷凍切片組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色均勻且對(duì)比度佳，冰晶數(shù)量可控，鏡下觀察與新鮮組織冷凍切片相一致；而當(dāng)處理時(shí)間為30 min組時(shí)，冷凍切片組織結(jié)構(gòu)清晰度下降，組織間隙增寬，間質(zhì)及細(xì)胞中出現(xiàn)冰晶，組織黏附性下降，染色沖洗易掉片，不能完全達(dá)到冷凍切片的診斷要求。經(jīng)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)得出利用10%中性福爾馬林處理10 min后的組織仍可用于快速冷凍切片，其完全能達(dá)到冷凍切片的質(zhì)量要求(圖1)。

3 討論

現(xiàn)階段冷凍切片技術(shù)的地位日益增加，在指導(dǎo)臨床醫(yī)師明確病變性質(zhì)并制訂合理的手術(shù)方案具有重要的意義。冷凍切片要求準(zhǔn)確及時(shí)發(fā)放病理報(bào)告，避免出現(xiàn)漏診和誤診現(xiàn)象，質(zhì)控要求切片組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核質(zhì)分明且對(duì)比度好，其質(zhì)控直接影響病理診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性，間接影響患者的治療和預(yù)后情況[8]。

冷凍切片多用于術(shù)中急會(huì)診，是病理醫(yī)師實(shí)踐中最重要、最困難而又壓力最大的一項(xiàng)工作，它要求病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)豐富，掌握臨床醫(yī)學(xué)知識(shí)，能在壓力之下迅速作出決斷，有良好的判斷力，保持適度保守的態(tài)度，并且了解該方法的局限性[9]。受時(shí)間、標(biāo)本、經(jīng)驗(yàn)及制片技術(shù)的限制，快速診斷具有更多的局限性和誤診的可能性。因此，高年資醫(yī)師復(fù)診切片就顯得尤為重要，對(duì)探討組織固定后的制片質(zhì)量也有益處。

ABCD

圖1新鮮甲狀腺切除標(biāo)本與組織處理后的標(biāo)本冷凍切片HE染色：A.新鮮標(biāo)本；B.處理10 min；C.處理20 min；D.處理30 min

新鮮組織經(jīng)甲醛短時(shí)固定后，不影響切片質(zhì)量。甲醛固定組織是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括滲透、結(jié)合、交聯(lián)三位一體模式，10%中性福爾馬林是國(guó)際上提倡使用的最佳組織標(biāo)本固定劑，優(yōu)點(diǎn)是滲透力強(qiáng)、穿透性好、固定均勻、組織收縮小、HE染色對(duì)比鮮明，且對(duì)大多數(shù)抗原及腫瘤基因的保存良好，一直被推崇為首選固定液。術(shù)中標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林短時(shí)處理，甲醛滲入使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)產(chǎn)生固定作用，妨礙水分大量滲入組織，間接減少冰晶形成，保證冷凍切片的質(zhì)量。隨著組織處理時(shí)間的增加(30 min)，標(biāo)本含水量加大，冷凍時(shí)間延長(zhǎng)，緩慢冷凍導(dǎo)致冰晶出現(xiàn)，且組織黏附性降低容易掉片，即使調(diào)低機(jī)廂溫度，使用防脫玻片亦不能改善切片質(zhì)量。因?yàn)榫徛鋬鍪辜?xì)胞內(nèi)的水分子向細(xì)胞間質(zhì)疏松區(qū)域游離、聚集，然后凝結(jié)成冰，冰晶會(huì)把組織或細(xì)胞間隙擴(kuò)大，等切片快速放入固定液后，冰融化成水，周?chē)M織收縮，引起組織結(jié)構(gòu)變形并留下大量空洞，切片診斷困難，導(dǎo)致誤、漏診。

本實(shí)驗(yàn)選取的術(shù)中切除標(biāo)本20例，所有冷凍切片所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：即利用10%中性福爾馬林固定液處理10 min，固定液的量為組織總體積的5～10倍，且組織不經(jīng)蔗糖等高滲溶液處理，冷凍切片組織結(jié)構(gòu)仍然清晰，冰晶形成在可控范圍內(nèi)，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色均勻且對(duì)比度佳，完全可以用于術(shù)中病理診斷，提示冰晶形成與速凍速度有關(guān)，與組織短時(shí)遇水關(guān)系有限。

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