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    沉默CD98hc表達對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、侵襲的影響

    2018-01-15 06:58:48吳正升
    臨床與實驗病理學(xué)雜志 2017年11期
    關(guān)鍵詞:小室氨基酸培養(yǎng)基

    牟 浪,吳正升,吳 強

    乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,占中國女性癌癥的15%,同時也是全球女性癌癥死亡的首要原因[1]。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌患者致死的主要原因[2],因此探索腫瘤轉(zhuǎn)移的機制,改善乳腺癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。CD98hc(也稱為4F2hc/SLC3A2)是溶質(zhì)載體家族的一員,相對分子質(zhì)量為8.5×104的單跨膜糖蛋白[3]。CD98hc可通過激活I(lǐng)ntegrin信號通路,促進腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)之間的黏附能力減弱,從而使腫瘤細胞易發(fā)生遷徙、轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致惡性程度增高,預(yù)后不良[4]。本實驗通過RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細胞MDA-MB-231中CD98hc分子的表達,分析其對MDA-MB-231細胞增殖侵襲力的影響,為進一步闡明乳腺癌侵襲遷移機制提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑兔抗人CD98單克隆抗體購自Abcam公司;小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Calbiochem公司;TRIzol購自Invitrogen公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、實時熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司;MTT試劑盒購自Promega公司;Transwell小室購自Corning公司;Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;MDA-MB-231細胞購自美國ATCC細胞庫。

    1.2方法

    1.2.1CD98hc-shRNA真核表達載體構(gòu)建 根據(jù)shRNA設(shè)計原則,靶向設(shè)計CD98hc的shRNA,上游:5′-CCGGTGCTGAGGTTACAGTAGAAACGGATCC GTTTCTACTGTAACCTCAGCATTTTTG-3′,下游:5′-A ATTCAAAAATGCTGAGGTTACAGTAGAAACGGATCC GTTTCTACTGTAACCTCAGCA-3′。退火處理:95 ℃ 5 min,85 ℃ 5 min,75 ℃ 5 min,70 ℃ 5 min,4 ℃保存。用SolutionⅠ連接酶將準(zhǔn)備好的插入片段連接到載體Plko.1,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞。挑取菌落,抽取質(zhì)粒,酶切并鑒定。

    1.2.2細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含10%FBS、2%L-谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱,適時更換培養(yǎng)基和傳代。實驗時選取處于對數(shù)生長期的細胞。

    1.2.3MDA-MB-231穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞2×105個接種于6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng),待融合度達60%按質(zhì)粒 ∶脂質(zhì)體=1 ∶2的比例轉(zhuǎn)染實驗組CD98hc表達質(zhì)粒(CD98hc-shRNA)、對照組空載質(zhì)粒(Vector),具體操作步驟按Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行,培養(yǎng)48 h后按4 μL/mL添加Puromycin, 適時更換培養(yǎng)基。分別獲得下調(diào)CD98hc的MDA-MB-231細胞株和對照MDA-MB-231細胞株。收集細胞進行Western blot和qRT-PCR技術(shù)鑒定,鑒定成功后用于后續(xù)的實驗。

    1.2.4Western blot檢測 收集待檢測細胞,細胞裂解液提取蛋白后進行10%SDS-PAGE凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)至NC膜后,應(yīng)用5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,PBST洗膜3次加入二抗,室溫孵育1 h,洗膜3次,化學(xué)發(fā)光,采集圖像。

    1.2.5qRT-PCR檢測 采用qRT-PCR法檢測CD98hc的mRNA表達。收集待檢測細胞,利用TRIzol提取細胞總RNA,按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄。CD98hc定量PCR引物上游:5′-TCCGACTCTACCAGCTGATGC-3′,下游:5′-AAGCTG GACTCATCCCACAGC-3′。GAPDH引物序列上游:5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游:5′-GGCA TGGACTGTGGTCATGAG-3′。引物序列合成由上海生工公司完成。反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 30 s,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,退火溫度后采集熒光信號,合計40個循環(huán),實驗重復(fù)3次。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)出,繪制柱狀圖。

    1.2.6MTT實驗檢測MDA-MB-231細胞活力 常規(guī)洗滌并用胰酶消化待檢測的細胞,制成單細胞懸液,每孔1×103個細胞接種于96孔板中,每個處理組重復(fù)6孔,合計培養(yǎng)5個96孔板。于24 h后檢測細胞活力,棄培養(yǎng)液,每孔加入100 μL MTT液,置培養(yǎng)箱孵育2 h。棄上清,每孔加入DMSO 100 μL。震蕩10 min,在570 nm處測定各孔吸光度OD值,結(jié)果取平均值。

    1.2.7Transwell實驗檢測MDA-MB-231細胞侵襲遷移能力 用胰酶消化各組細胞,PBS洗1~2次,用含10 g/L的BSA無血清培養(yǎng)基重懸,每組取1×105個細胞加入預(yù)先用Matrigel包被基膜的Transwell小室的上室中,下室加入含血清的完全培養(yǎng)基600 μL,培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后,取出小室,PBS清洗,用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層的細胞,90%乙醇固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,倒置顯微鏡下觀察,每個樣本隨機計數(shù)5個視野,取平均值,繪制柱狀圖。檢測細胞遷移時,小室上室中不需要Matrigel包被基膜,其他步驟與之相同。

    2 結(jié)果

    2.1細胞中CD98hc的表達應(yīng)用qRT-PCR檢測CD98hc的mRNA水平表達,發(fā)現(xiàn)與空白組(1.040±0.056)、對照組(1.293±0.006)相比,實驗組(0.527±0.045)在mRNA水平表達明顯下調(diào)(P<0.05),空白組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1A)。Western blot檢測結(jié)果顯示:CD98hc-shRNA組CD98hc蛋白表達明顯下調(diào),蛋白表達的抑制作用明顯(圖1B)。

    圖1 A.qRT-PCR檢測MDA-MB-231細胞CD98hc干涉情況;B.Western blot檢測MDA-MB-231細胞CD98干涉情況

    2.2下調(diào)表達CD98hc分子抑制MDA-MB-231細胞增殖應(yīng)用MTT實驗檢測CD98hc分子對MDA-MB-231細胞增殖的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)48 h后CD98hc-shRNA組(0.580±0.035)細胞的增殖與空白組(0.706±0.013)、對照組(0.724±0.018)相比受抑制,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖2)。

    圖2 MTT檢測CD98hc分子對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用

    ③A③B③C④A④B④C

    圖3下調(diào)CD98hc顯著抑制MDA-MB-231細胞侵襲能力:A. 空白組;B. 對照組; C. CD98hc-shRNA組圖4下調(diào)CD98hc顯著抑制MDA-MB-231細胞遷移能力:A. 空白組;B. 對照組; C. CD98hc-shRNA組

    2.3下調(diào)表達CD98hc分子抑制MDA-MB-231細胞侵襲及遷移應(yīng)用Transwell實驗檢測細胞侵襲及遷移的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD98hc-shRNA組(108±4.5)穿過Matrigel包被的細胞數(shù)與空白組(377±20.9)、對照組(394.6±9.8)相比明顯減少(P<0.05)。穿過未包被的微孔膜的細胞數(shù)CD98hc-shRNA組(118.4±13.1)也明顯少于空白組(385.2±27.3)和對照組(405.2±13.8),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白組與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖3、4)。

    3 討論

    CD98hc首次被發(fā)現(xiàn)是作為T淋巴細胞的表面抗原[5],隨后發(fā)現(xiàn)CD98hc在多種細胞中廣泛表達。大量研究發(fā)現(xiàn),CD98hc具有雙重功能,其中胞膜外區(qū)可通過二硫鍵與6種L型氨基酸轉(zhuǎn)運體(LAT1、LAT2、xCT、y+LAT1、y+LAT2和asc1)共價結(jié)合,構(gòu)成的氨基酸轉(zhuǎn)運體是其運輸氨基酸的必需組分[6-7],保證腫瘤細胞對氨基酸的大量需求,維持腫瘤細胞的快速增殖能力[8]。CD98hc的胞質(zhì)區(qū)可通過調(diào)節(jié)Integrin樣信號通路來改變細胞的存活、遷徙甚至是轉(zhuǎn)移[9]。

    CD98hc在多種腫瘤細胞表面高表達,與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[10]。Fei等[11]報道,CD98hc在非小細胞肺癌組織中高表達,且與CD98hc陰性的肺癌患者相比,CD98hc陽性患者總體生存率減低、復(fù)發(fā)率增高。Shin等[12]發(fā)現(xiàn)SLC3A2基因能與神經(jīng)調(diào)節(jié)素1(neuregulin 1, NRG1)融合,該基因融合能夠促進肺癌細胞的增殖、侵襲遷移。CD98hc可通過增強Rho激酶(ROCK)的活性以及YAP/TPZ 的轉(zhuǎn)錄,介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中細胞外基質(zhì)重塑,促進胃腸道的轉(zhuǎn)移[13]。CD98hc還可與左旋氨基酸轉(zhuǎn)移蛋白1(L-type amino acid transporter 1, LAT1)結(jié)合,參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲[14]。Poettler等[15]實驗得出在腎透明細胞癌中沉默CD98hc的表達能夠一定程度抑制細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等腫瘤特性。該現(xiàn)象在膠質(zhì)瘤中也有發(fā)生[16],但在乳腺癌中還未見相關(guān)報道。本組實驗結(jié)果顯示:沉默CD98hc在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達可以明顯抑制細胞增殖及侵襲遷移能力,與其他腫瘤的研究結(jié)果一致。提示CD98hc可能參與乳腺癌細胞生物學(xué)行為的調(diào)控,但關(guān)于其調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)行為的作用機制還有待于進一步分析。

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