結(jié)核抗體蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA對(duì)結(jié)核病活動(dòng)度及療效的監(jiān)測價(jià)值*

馮英凱，王 勇，黃正谷，趙小莉，劉 英

(1.重慶市中醫(yī)院道門口院部呼吸內(nèi)科 400011；2.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心普內(nèi)科 400036；3.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科 400036；4.重慶市結(jié)核病防治所 400050)

結(jié)核病防控形勢依然嚴(yán)峻[1]。由于抗結(jié)核療程較長，結(jié)核化療藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重，部分患者服藥依從性較差，特別是西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)，經(jīng)濟(jì)及文化落后，患者往往一旦自覺癥狀改善即自行停藥，導(dǎo)致治療失敗或產(chǎn)生耐藥。同時(shí)，活動(dòng)性結(jié)核不使用或非正規(guī)使用抗結(jié)核藥物，容易導(dǎo)致結(jié)核播散、病情惡化，產(chǎn)生呼吸衰竭等一系列并發(fā)癥，而無指征盲目使用抗結(jié)核藥物或?qū)δ退幗Y(jié)核使用常規(guī)抗結(jié)核治療，可造成藥物資源浪費(fèi)，加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，更嚴(yán)重的是，抗結(jié)核藥長期大劑量使用所致的肝、腎損害等不良反應(yīng)嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體，甚至摧毀機(jī)體免疫系統(tǒng)，危及生命。探尋與結(jié)核活動(dòng)度及療效相適應(yīng)的預(yù)警指標(biāo)，實(shí)時(shí)監(jiān)測結(jié)核病情變化與治療效果，對(duì)提高結(jié)核治愈率、減少復(fù)發(fā)率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究前期對(duì)蛋白芯片技術(shù)、γ-干擾素釋放試驗(yàn)(TB-IGRA)、TB DNA的聚合酶鏈反應(yīng)檢測法(TB-PCR)、集菌涂片法、結(jié)核菌培養(yǎng)法等幾種常用的結(jié)核監(jiān)測指標(biāo)進(jìn)行平行對(duì)比分析，以篩選理想的結(jié)核病活動(dòng)度及療效的監(jiān)測指標(biāo)。結(jié)果提示，蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA作為診斷結(jié)核靈敏度及特異度均較高的檢測技術(shù)，二者取長補(bǔ)短，優(yōu)勢互補(bǔ)，可用于抗結(jié)核療效監(jiān)測的備選方法(另文發(fā)表)。本研究將應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)、TB-IGRA比較抗結(jié)核療程中不同時(shí)相點(diǎn)檢測陽性率的動(dòng)態(tài)變化，并與集菌涂片法結(jié)果進(jìn)行同步比較分析，以明確上述兩項(xiàng)檢測技術(shù)對(duì)結(jié)核病活動(dòng)度和療效的監(jiān)測價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年7月至2016年7月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心門診及住院的結(jié)核病患者655例，其中男372例、女283例，平均年齡(40.29±12.47)歲。所有病例均依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)、病理檢查或抗結(jié)核治療有效而明確診斷。其中肺結(jié)核患者432例，作為肺結(jié)核組；肺外結(jié)核患者146例，含結(jié)核性胸膜炎94例、結(jié)核性腹膜炎21例、結(jié)核性心包炎4例、結(jié)核性腦膜炎3例、淋巴結(jié)核9例、骨關(guān)節(jié)結(jié)核9例、腎結(jié)核6例，作為肺外結(jié)核組；肺結(jié)核并肺外結(jié)核77例，含結(jié)核性胸膜炎35例、結(jié)核性腹膜炎3例、淋巴結(jié)結(jié)核25例、骨關(guān)節(jié)結(jié)核14例。選擇同期非結(jié)核病患者248例作為非結(jié)核對(duì)照組，其中男125例，女123例；平均年齡(42.20±12.20)歲；急性扁桃體炎21例，急性支氣管炎65例，肺炎35例，泌尿系感染40例，慢性支氣管炎13例，慢性阻塞性肺疾病56例，支氣管擴(kuò)張18例。所有研究對(duì)象均無HIV感染、妊娠、使用免疫抑制劑或增強(qiáng)劑。結(jié)核組與非結(jié)核對(duì)照組間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 PBT-X2蛋白芯片閱讀儀及結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(蛋白芯片)(南京大淵生物技術(shù)工程有限公司)；人結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素(TB-IGRA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(QuantiFERON-TB Gold，德國凱杰公司)。

1.3方法

1.3.1治療方法 初治行2HRZE/4H3R3方案，即強(qiáng)化期：異煙肼(H)、利福平(R)、吡嗪酰胺(Z)和乙胺丁醇(E)，頓服，2個(gè)月；鞏固期：異煙肼(H)、利福平(R)，每周3次，4個(gè)月；觀察期間復(fù)發(fā)者用2SHRZE/6H3R3E3方案，即強(qiáng)化期：鏈霉素(S)、異煙肼(H)、利福平(R)、吡嗪酰胺(Z)和乙胺丁醇(E)，2個(gè)月；鞏固期：異煙肼(H)、利福平(R)和乙胺丁醇(E)，每周3次，6個(gè)月。治療前及初治滿1～6個(gè)月每月、復(fù)治滿2～8個(gè)月每2個(gè)月、治療結(jié)束后6個(gè)月、12個(gè)月留取肺結(jié)核、肺外結(jié)核相應(yīng)標(biāo)本(靜脈血、痰液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液等)。治療前、治療過程中及治療結(jié)束后6個(gè)月、12個(gè)月標(biāo)本行蛋白芯片技術(shù)、TB-IGRA、集菌涂片法平行檢測。

1.3.2標(biāo)本采集 根據(jù)不同的結(jié)核類型，采集不同標(biāo)本，如血清、痰液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、骨髓液、淋巴結(jié)、膿液、尿液、胸腔積液等。血標(biāo)本采集：以真空采血管抽取清晨空腹靜脈血4 mL，于3 000 r/min下離心3 min，分離血清，新鮮血清標(biāo)本在2～8 ℃環(huán)境下存放不超過48 h，長期保存的標(biāo)本在-20 ℃以下凍存，避免反復(fù)凍融。每例患者收集3份痰標(biāo)本(當(dāng)日即時(shí)痰、夜間痰、次日晨痰)。采集的胸腔積液、腹水、關(guān)節(jié)液，經(jīng)離心(13 000 r/min，5 min)，使纖維蛋白原等干擾成分分離，取上清液檢測或保存于-40 ℃冰箱內(nèi)，1周內(nèi)檢測。

1.3.3結(jié)核蛋白芯片技術(shù) 遵照結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(蛋白芯片)說明書提供的標(biāo)本要求和試驗(yàn)方法進(jìn)行操作。

1.3.4TB-IGRA檢測 遵照人結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素(TB-IGRA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書進(jìn)行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：設(shè)定待測樣品孔(T)水平值=a，空白孔(N)水平值=b，標(biāo)準(zhǔn)孔(P)水平值=c。若b≤400，試驗(yàn)有意義；當(dāng)a-b≥14，并且≥25%b，不管c-b為任何值，均為陽性；當(dāng)a-b≥14，但<25%b，或<14時(shí)，此時(shí)c-b≥20均為陰性；若a-b<14，c-b<20或a-b≥14，但<25%b，且c-b<20時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果為不確定。最后結(jié)果以陽性、陰性及不確定3種定性方式表達(dá)。

1.3.5集菌涂片法檢測 按文獻(xiàn)[2]應(yīng)用萋-尼法進(jìn)行抗酸染色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以百分率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種檢測方法在抗結(jié)核治療中陽性率的動(dòng)態(tài)變化比較 結(jié)果如表1和圖1、圖2所示。研究結(jié)果表明，隨著抗結(jié)核治療的進(jìn)行，蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA檢出陽性率均呈下降趨勢。蛋白芯片技術(shù)陽性率在初治滿3個(gè)月前均低于TB-IGRA，在初治滿4個(gè)月時(shí)開始下降，但下降幅度低于TB-IGRA，此后下降幅度逐漸增大，在治療結(jié)束后6個(gè)月時(shí)陽性率仍高達(dá)18.78%，治療結(jié)束后12個(gè)月時(shí)陽性率仍為15.27%。TB-IGRA陽性率在初治滿2個(gè)月時(shí)即有明顯下降，下降幅度高于蛋白芯片技術(shù)，在復(fù)治滿8個(gè)月時(shí)陽性率降至8.85%，治療結(jié)束后6個(gè)月時(shí)陽性率降至6.26%，治療結(jié)束后12個(gè)月時(shí)陽性率降至3.82%，明顯低于同時(shí)相點(diǎn)蛋白芯片技術(shù)。

2.2蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA 兩種檢測方法與涂片結(jié)果的符合情況比較 蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA 兩種檢測方法與涂片陽性結(jié)果的符合情況見表2、圖3所示。在初治滿4個(gè)月之前，蛋白芯片技術(shù)與涂片結(jié)果的診斷符合率明顯高于TB-IGRA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在初治滿5個(gè)月時(shí)略下降，之后，隨著療程的進(jìn)展，蛋白芯片技術(shù)與涂片結(jié)果的診斷符合率逐漸增高，但幅度均低于TB-IGRA。TB-IGRA與涂片結(jié)果的診斷符合率在初治滿3個(gè)月前較低，此后隨著療程的進(jìn)展，診斷符合率逐漸增高。

表1 兩種檢測方法在抗結(jié)核治療中陽性率的動(dòng)態(tài)變化比較[n(%)]

表2 蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA檢測結(jié)果與涂片結(jié)果的符合情況比較

續(xù)表2 蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA檢測結(jié)果與涂片結(jié)果的符合情況比較

圖1 兩種檢測方法在抗結(jié)核治療中陽性率的動(dòng)態(tài)變化

圖2 兩種檢測方法在抗結(jié)核治療中陽性率的變化趨勢

圖3 兩種檢測方法與涂片結(jié)果的診斷符合率比較

3 討 論

目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)結(jié)核病療效監(jiān)測技術(shù)和指標(biāo)做了大量的研究[2]。最經(jīng)典的肺結(jié)核療效判定方法為痰或呼吸道分泌物涂片抗酸桿菌檢查、傳統(tǒng)改良羅氏培養(yǎng)法、紅細(xì)胞沉降率、結(jié)核菌素試驗(yàn)及胸部X線片檢查。但這些方法有其不足之處，如體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的測定時(shí)間耗費(fèi)太長，紅細(xì)胞沉降率特異性差，結(jié)核菌素試驗(yàn)無法區(qū)別既往及現(xiàn)患結(jié)核，X線片檢查缺乏明確的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等。除了上述傳統(tǒng)的痰菌法、胸部X線片檢查、結(jié)核菌素試驗(yàn)等，近年來，如核酸檢測技術(shù)、生物蛋白芯片技術(shù)、基因芯片技術(shù)、RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)[3-4]等新興的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)已逐步應(yīng)用于結(jié)核病的臨床診斷領(lǐng)域，其中蛋白芯片技術(shù)及干擾素釋放試驗(yàn)[5-6]值得關(guān)注。

脂阿拉伯甘露糖(LAM)抗原是一種與分枝桿菌細(xì)胞壁有關(guān)的復(fù)合糖脂類，正在生長的結(jié)核分枝桿菌能大量產(chǎn)生。約有75%的人群感染結(jié)核菌后會(huì)產(chǎn)生針對(duì)LAM的特異性抗體。結(jié)核分枝桿菌38 000抗原與16 000抗原是結(jié)核分枝桿菌所特有的抗原，它與其他分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌不存在交叉反應(yīng)，其診斷的特異性度較高。蛋白芯片技術(shù)即是采用上述3種抗原通過檢測血清中相應(yīng)抗體(結(jié)核菌蛋白LAM、16 000和38 000特異性抗體)，對(duì)結(jié)核病患者作出早期診斷。

結(jié)核分枝桿菌感染引起的細(xì)胞免疫屬于帶菌免疫，當(dāng)人或動(dòng)物感染了結(jié)核分枝桿菌后，具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞(效應(yīng)記憶T淋巴細(xì)胞)識(shí)別ESAT-6及CFP-10，并產(chǎn)生高水平的γ-干擾素，γ-干擾素能特異性地反映機(jī)體結(jié)核分枝桿菌的感染情況。該效應(yīng)記憶T淋巴細(xì)胞只在人體內(nèi)存在結(jié)核分枝桿菌時(shí)產(chǎn)生，當(dāng)結(jié)核病治愈后即消失，故抗原特異性IFN-γ體外釋放測定只與體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷量即結(jié)核活動(dòng)性呈正相關(guān)，而不受既往結(jié)核感染的影響，從而成為評(píng)估抗結(jié)核治療療效的理想指標(biāo)[7-9]。

本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)比分析了蛋白芯片技術(shù)、TB-IGRA在抗結(jié)核療程中不同時(shí)相點(diǎn)檢測陽性率的動(dòng)態(tài)變化，并與集菌涂片法結(jié)果進(jìn)行同步比較。本研究采用的蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA選用不同類型的結(jié)核菌抗原(蛋白芯片技術(shù)選用結(jié)核菌蛋白LAM、重組16 000和38 000抗原；TB-IGRA選用ESAT-6及CFP-10)，針對(duì)機(jī)體不同的免疫狀態(tài)，采用不同的測定原理，對(duì)抗結(jié)核療程中不同時(shí)相點(diǎn)的療效進(jìn)行評(píng)估，推測二者有良好的互補(bǔ)作用。

結(jié)果顯示，隨著抗結(jié)核治療的進(jìn)行，蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA檢出陽性率均呈下降趨勢。蛋白芯片技術(shù)陽性率在初治滿3個(gè)月前均低于TB-IGRA，在初治滿4個(gè)月時(shí)開始下降，但下降幅度低于TB-IGRA，此后下降幅度逐漸增大，在治療結(jié)束后6個(gè)月時(shí)陽性率仍高達(dá)18.78%，治療結(jié)束后12個(gè)月時(shí)陽性率仍為15.27%。TB-IGRA陽性率在初治滿2個(gè)月時(shí)即有明顯下降，下降幅度高于蛋白芯片技術(shù)，在復(fù)治滿8個(gè)月時(shí)陽性率降至8.85%，治療結(jié)束后6個(gè)月時(shí)陽性率降至6.26%，治療結(jié)束后12個(gè)月時(shí)陽性率降至3.82%，明顯低于同時(shí)相點(diǎn)蛋白芯片技術(shù)。在初治滿4個(gè)月之前，蛋白芯片技術(shù)與涂片結(jié)果的診斷符合率高于TB-IGRA，在初治滿5個(gè)月時(shí)略下降，之后隨著療程的進(jìn)展，蛋白芯片技術(shù)與涂片結(jié)果的診斷符合率逐漸增高，但幅度均低于TB-IGRA。TB-IGRA與涂片結(jié)果的診斷符合率在初治滿3個(gè)月前較低，此后隨著療程的進(jìn)展，診斷符合率逐漸增高。提示蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA對(duì)結(jié)核療效均有監(jiān)測價(jià)值，初治滿4個(gè)月之前，蛋白芯片技術(shù)監(jiān)測價(jià)值高于TB-IGRA；初治滿4個(gè)月之后，蛋白芯片技術(shù)監(jiān)測價(jià)值低于TB-IGRA。經(jīng)結(jié)果分析，蛋白芯片技術(shù)監(jiān)測療效，其陽性率下降有一定的滯后性，但在結(jié)核病早期與集菌涂片法的診斷符合率較高，表明蛋白芯片技術(shù)在抗結(jié)核早期監(jiān)測價(jià)值較高，TB-IGRA的高靈敏度彌補(bǔ)了蛋白芯片技術(shù)陽性率低的不足；而在抗結(jié)核治療中、后期，TB-IGRA與集菌涂片法的診斷符合率較高，其監(jiān)測價(jià)值更高。

總體而言，雖然蛋白芯片技術(shù)陽性率隨治療的進(jìn)行、療程的推進(jìn)有逐漸下降趨勢，但對(duì)結(jié)核病早期療效判定存在滯后性；另一方面，結(jié)核菌蛋白LAM、16 000和38 000特異度抗體在血中持續(xù)時(shí)間較長(9～12個(gè)月)，即使結(jié)核病已然治愈(陰轉(zhuǎn)治愈或滿療程)，蛋白芯片技術(shù)仍部分為陽性，即不能同步反映恢復(fù)期療效，所以其對(duì)抗結(jié)核治療療效的監(jiān)測有參考作用，但價(jià)值有限。TB-IGRA靈敏度和特異度高，陰性基本排除結(jié)核，陽性提示患者目前處于結(jié)核感染的狀態(tài)，但是不可區(qū)分潛伏和活動(dòng)，診斷潛伏性結(jié)核有一定局限性，陽性結(jié)果需要結(jié)合臨床，單一指標(biāo)陽性不足以診斷結(jié)核病或判定抗結(jié)核療效。且IGRAs對(duì)試驗(yàn)技術(shù)和試驗(yàn)條件要求較高，價(jià)格昂貴，操作程序復(fù)雜，標(biāo)本檢測時(shí)限短，難以實(shí)現(xiàn)高通量，因而限制了其在中低收入國家的應(yīng)用[10]。

綜上所述，蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA各有優(yōu)缺點(diǎn)，二者結(jié)合有良好的互補(bǔ)效應(yīng)，蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA聯(lián)合檢測對(duì)結(jié)核病活動(dòng)度評(píng)估和抗結(jié)核療效監(jiān)測有較高的臨床價(jià)值。

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