MSCs共培養(yǎng)抗ARPE-19細胞氧化應激的作用研究

柴 勇 焦守峰*

（1 江西省兒童醫(yī)院，江西 南昌330000；2 南昌大學第三附屬醫(yī)院，江西 南昌330000）

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是近年來中國老年人群中視力損傷的主要原因[1]。盡管其具體發(fā)病機制尚未完全明確，大量研究表明氧化應激在其發(fā)生發(fā)展中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加RPE細胞對氧化應激變得更加敏感，因此減輕視網(wǎng)膜上皮細胞氧化應激損傷可能是預防AMD的新思路[2]。

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，其調(diào)節(jié)作用效果在多種自身免疫性疾病、糖尿病以及角膜燒傷、干燥癥等疾病中已被證實[3]，而AMD發(fā)病機制恰是免疫紊亂、過氧化損傷等密切相關(guān)。因此，我們推測MSCs共培養(yǎng)可抗ARPE-19細胞氧化應激從而減輕AMD病變，可能成為AMD細胞治療的新思路，且關(guān)于該方面的研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 主要材料：ARPE-19 cells購自美國ATCC公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組：常規(guī)培養(yǎng)ARPE-19細胞與MSCs細胞，隨機分為正常組、H2O2組和共培養(yǎng)組：正常組常規(guī)培養(yǎng)；H2O2組利用200 μmol/L濃度的H2O2刺激干預構(gòu)建氧化應激模型，共培養(yǎng)組在MSCs與ARPE-19細胞于Transwell共培養(yǎng)的基礎上給予H2O2氧化應激干預。

1.2.2 細胞共培養(yǎng)：培養(yǎng)第3代MSCs與ARPE-19至對數(shù)期，用胰酶消化重懸計數(shù)后接種MSCs于Transwell下室，上室內(nèi)接種ARPE-19，使上下室的培養(yǎng)液相互通融，從而建立起共培養(yǎng)體系，72 h終止培養(yǎng)并行相應分析。

1.2.3 比色法測定細胞SOD活性和GSH-Px、MDA水平：ARPE-19細胞分組處理后胰酶消化收集細胞，接種六孔板常規(guī)培養(yǎng)至70%，根據(jù)試劑盒對細胞氧化應激指標水平進行測試。

1.3 數(shù)據(jù)處理：利用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs共培養(yǎng)對ARPE-19細胞SOD活性的影響：H2O2預處理可明顯降低ARPE-19細胞內(nèi)SOD活性，與對照組比差異具有顯著性差異（P＜0.05）；而MSCs共培養(yǎng)可顯著提高H2O2預處理后ARPE-19細胞內(nèi)SOD活性，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 MSCs共培養(yǎng)對ARPE-19細胞GSH-Px水平的影響：H2O2預處理可明顯降低ARPE-19細胞內(nèi)GSH-Px水平，與對照組比差異具有顯著性差異（P＜0.05）；而MSCs共培養(yǎng)可顯著提高H2O2預處理后ARPE-19細胞內(nèi)GSH-Px水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 MSCs共培養(yǎng)對ARPE-19細胞MDA水平的影響：H2O2預處理可顯著提高ARPE-19細胞內(nèi)MDA水平，與對照組比差異具有顯著性差異（P＜0.05）；而MSCs共培養(yǎng)可逆轉(zhuǎn)H2O2預處理ARPE-19細胞內(nèi)MDA水平變化，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

以上結(jié)果提示H2O2刺激能誘導ARPE-19細胞內(nèi)氧化應激損傷，而MSCs共培養(yǎng)能通過抗氧化應激發(fā)揮保護作用。見表1和圖1。

3 討 論

年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）是引發(fā)老年人視力缺損的常見原因，其發(fā)病機制尚無定論。研究表明，氧化應激在AMD發(fā)生發(fā)展機制中有重要作用；且抗氧化物能顯著減緩AMD的發(fā)病進程。因此，有效的改善RPE細胞抗氧化應激可能是防治AMD進展的新策略。

大量研究表示，AMD與補體系統(tǒng)突變、慢性炎癥及氧化應激等因素密切相關(guān)[4]。生理條件下體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡中；當機體處在病理條件時平衡被破壞，體內(nèi)自由基能導致脈絡膜微血管及RPE細胞的損傷，進而加劇視網(wǎng)膜發(fā)生黃斑變性[5]。

表1 各組ARPE-19細胞內(nèi)氧化應激水平比較（±s）

表1 各組ARPE-19細胞內(nèi)氧化應激水平比較（±s）

注：與CON比，*P＜0.05；與H2O2組比，#P＜0.05

組別 SOD(U/mL)GSH-Px(mg/gport)MDA(nmol/mL)對照組(CON) 16.61±0.32 29.76±0.74 1.38±0.27 H2O2模型組(H2O2) 9.83±0.71* 20.19±0.83* 3.24±0.41*共培養(yǎng)組(MSCs) 14.49±1.29# 26.52±0.91# 2.16±0.62#

圖1 各組ARPE-19細胞內(nèi)氧化應激水平比較（與CON比，*P＜0.05；與H2O2組比，#P＜0.05）

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，在刺激后對免疫系統(tǒng)表現(xiàn)出很強的調(diào)節(jié)作用，在多種自身免疫性疾病、角膜燒傷等疾病中已被證實；而AMD發(fā)病機制則與免疫紊亂、過氧化損傷等密切相關(guān)，這些使MSC極有可能成為細胞治療的良好選擇之一[6]。SOD與GSH-Px有清除ROS作用，在ARPE-19細胞抗氧化應激損傷過程中有重要作用；MDA 是細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，能反應細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。本研究顯示：利用H2O2干預刺激后，細胞內(nèi)SOD活性和GSH-Px顯著降低，MDA水平顯著增高，提示ARPE-19細胞發(fā)生顯著的氧化應激反應；而利用MSCs共培養(yǎng)能顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘發(fā)的氧化應激，有明顯的抗氧化應激作用。綜上所述，MSCs共培養(yǎng)能顯著提高ARPE-19細胞抗H2O2誘導的氧化應激作用，但其具體作用機制有待我們深入研究。

[1] 劉曉靜,鄒海東,吳星偉.年齡相關(guān)性黃斑變性患者視覺相關(guān)生存質(zhì)量變化及相關(guān)因素分析[J].上海交通大學學報(醫(yī)學版),2012,32(2):197-201.

[2] 潘俊如,余其林,張述,等.老年性黃斑變性病因研究新進展[J].國際眼科雜志,2013,13(5):905-908.

[3] 荻屋道雄,今川究,細田勇喜,等.含有間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基的角膜內(nèi)皮細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基[P].2015-05-27.

[4] Ayaz L,Dinc E.Evaluation of microRNA responses in ARPE-19 cells against the oxidative stress[J].Cutan Ocul Toxicol,2017:1-6.

[5] 俞永珍,鄒秀蘭,鄒玉平.氧化應激及抗氧化物在年齡相關(guān)性黃斑變性中的作用[J].眼科新進展,2015,35(5):489-492.

[6] 鄧君,陳曉,晏穎,等.誘導多功能干細胞在視網(wǎng)膜疾病中的應用[J].中國組織工程研究,2013,17(36):6533-6540.