循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其在乳腺癌診療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

，

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450008)

近年來，中國女性乳腺癌發(fā)病率和死亡人數(shù)逐年增高，北京等城市乳腺癌的增長率達(dá)到了5%，已然發(fā)展成為威脅我國女性健康的最常見腫瘤之一[1]。導(dǎo)致乳腺癌難以治愈的主要因素是腫瘤的轉(zhuǎn)移，提高對腫瘤轉(zhuǎn)移的監(jiān)控甚至尋找一種能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法成為近年來研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已證實，腫瘤細(xì)胞能夠從原發(fā)腫瘤上脫離出來或由于其他一些醫(yī)療操作的原因進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，雖然在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中，大部分腫瘤細(xì)胞被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所攔截并消滅，但是還是會有一部分腫瘤細(xì)胞能夠生存下來[2]，并且形成轉(zhuǎn)移灶，此類腫瘤細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)[3]。CTCs與乳腺癌患者的預(yù)后、臨床分期、總生存期以及腫瘤的轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)[4]。本文將從CTCs的生物學(xué)特征、篩選和檢測技術(shù)以及臨床研究現(xiàn)狀方面綜述乳腺癌CTCs的相關(guān)研究。

1 CTCs生物學(xué)特征

1.1CTCs基因研究研究[5-6]表明，對單個CTCs進(jìn)行全基因組測序并對特定的基因突變進(jìn)行分析，有利于進(jìn)行針對性治療，改善治療方案，減少對患者不必要的化療。Heitzer等[7]對37例結(jié)腸癌患者CTCs的基因突變進(jìn)行分析研究后發(fā)現(xiàn)，CTCs的某些染色體組與原發(fā)灶存在不一致性，這表明了我們可以通過CTCs監(jiān)測腫瘤基因的動態(tài)變化。此外，Schneck等[8]在對44例乳腺癌患者的研究中也證實了這一現(xiàn)象。

1.2CTCsRNA研究CTCs RNA分析有3種常用途徑[3]：1)將捕獲的CTCs破碎后提取RNA，然后將其應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步分析與腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組；2)應(yīng)用RT-qPCR或RNA測序獲取CTCs生物信息；3)將原位雜交技術(shù)和生物探針相結(jié)合對CTCs進(jìn)行分析，從而評估CTCs間異質(zhì)性以及得到其他生物信息。

1.3CTCs蛋白研究抗體免疫染色法是對CTCs的蛋白進(jìn)行研究的主要方法，對CTCs蛋白研究的局限性在于CTCs富集率低，許多針對蛋白組學(xué)的研究方法并沒有應(yīng)用到對CTCs蛋白的研究中來。

隨著近年來對CTCs的基因、RNA、蛋白等研究的深入，CTCs的分子生物學(xué)特征及其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的功能研究逐漸被科研人員所關(guān)注。

1.4CTCs功能研究功能分析目前主要針對異種移植和試管內(nèi)培養(yǎng)所產(chǎn)生的CTCs[3]。2015年，Cayrefourcq等[9]發(fā)現(xiàn)新培育出的結(jié)腸癌CTCs能夠加速去免疫小鼠活體瘤的形成，并且能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞在試管內(nèi)生長。Yu等[10]建立CTCs與異種移植相結(jié)合的方式培育出了新生腫瘤，并對其進(jìn)行研究，隨后發(fā)現(xiàn)了潛在的治療靶點(diǎn)。

2 CTCs的篩選和檢測技術(shù)

近年來，隨著對CTCs的研究越來越深入，許多CTCs篩選檢測技術(shù)相繼出現(xiàn)，目前最常用的CTCs分離方法可以分為2大類，即物理分離法和生物分離法[11]。

物理分離法是利用CTCs與其他外周血細(xì)胞的大小、形狀、密度、等電點(diǎn)等物理條件的不同加以分離。傳統(tǒng)的方法包括密度梯度離心法和膜濾過分離法[12]，主要包括OncoQuick分離法、聚蔗糖密度梯度離心法、ScreenCell分離法等。近年來研發(fā)的物理分離法主要包括介電電泳技術(shù)、多孔流分離技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等。有研究[13]利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CTCs檢測，實驗結(jié)果表明，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌患者外周血中CTCs具有較高的敏感性和特異性。

生物分離法是根據(jù)CTCs的表面抗原與其他外周血細(xì)胞表面抗原不同，利用免疫學(xué)方法對其加以分離的。生物分離法的代表就是常用的CellSearch系統(tǒng)，也是目前惟一被美國FDA批準(zhǔn)用于前列腺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌和結(jié)腸癌預(yù)后判斷的CTCs分離系統(tǒng)[14-16]。另外，還包括RT-PCR技術(shù)和體內(nèi)CTCs檢測技術(shù)等。

CTCs被分離富集后，再借助免疫細(xì)胞熒光染色技術(shù)和高分辨率成像技術(shù)鑒別富集后的細(xì)胞[17]?？傮w來說，物理分離法較生物分離法操作更為簡便，能夠保護(hù)CTCs的生物活性，不影響對其生物活性的檢測，價格方面也比較低廉，但是物理分離法不具備特異性，可能會漏檢一部分直徑較小的腫瘤細(xì)胞；生物分離法具有較高的敏感性和特異性，有很好的可重復(fù)性，但是有些方法可能會對CTCs造成破壞，例如RT-PCR法需要對CTCs進(jìn)行破碎，檢測其mRNA，因此，無法對CTCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和計數(shù)[17]。

3 乳腺癌CTCs臨床研究進(jìn)展

隨著對乳腺癌CTCs研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在外周血中檢測到CTCs預(yù)示著可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，血液中CTCs的計數(shù)可以作為乳腺癌、結(jié)腸癌等的獨(dú)立預(yù)后因素[13]。Bidard等[18]對20個研究中1 944例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的臨床合并數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這是CTCs數(shù)量變化對患者預(yù)后情況影響的有力支撐。研究結(jié)果表明，患者在接受新一輪的治療前，CTCs計數(shù)≤5個/7.5 mL的患者相比CTCs計數(shù)≥5個/7.5 mL的患者的總體生存期和無進(jìn)展生存期要長。CTCs在外周血中的數(shù)量在一定程度上影響著腫瘤患者的預(yù)后情況，同時根據(jù)治療前后CTCs的水平也能反映出治療方案在腫瘤治療上的效果。單海琳等[19]對100例中晚期乳腺癌患者外周血中CTCs數(shù)目與化療療效和預(yù)后相關(guān)性試驗中發(fā)現(xiàn)，外周血CTCs檢測可用于中晚期乳腺癌的化療療效評價和轉(zhuǎn)移檢測，具有對預(yù)后狀況預(yù)測的價值?，F(xiàn)已證實，早期乳腺癌CTCs檢出率與組織學(xué)分級、腫塊大小、激素受體等無關(guān)，與患者人體表皮生長因子受體2(HER2)的表達(dá)明顯相關(guān)，CTCs檢測可作為預(yù)測乳腺癌患者治療反應(yīng)的一個重要指標(biāo)[20]。

乳腺癌患者外周血CTCs陽性率與HER2、Ki-67表達(dá)與否有關(guān)，還與TNM分期有關(guān)，而與月經(jīng)狀態(tài)、雌激素受體、孕激素受體表達(dá)與否無關(guān)[21]。但是也有與TNM分期等無關(guān)的報道[22]。已有研究[23]證明，在早期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，外周血CTCs數(shù)量≤5個/7.5 mL的患者中，免疫熒光技術(shù)檢測的HER2水平的評估并不可靠。

4 展望

隨著近年來對乳腺癌CTCs研究的深入，CTCs已經(jīng)被證實可以作為一個有力的預(yù)后因素，此外，其在療效評價和指導(dǎo)臨床治療中也有一定的臨床價值。由于缺乏臨床實用性，所以要將CTCs檢測作為常規(guī)檢查應(yīng)用于臨床還為時尚早，有許多問題還未解決，例如不同的CTCs檢測儀器檢測結(jié)果間存在差異，我們應(yīng)該以哪一種儀器檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)等。待檢測CTCs細(xì)胞表達(dá)的上皮生物標(biāo)志物還非常有限，現(xiàn)有的CTCs檢測技術(shù)還不能高效特異檢測出外周血中CTCs的數(shù)量，這也是CTCs檢測不能作為臨床常規(guī)檢查的原因之一。但其具有的臨床價值是不可否認(rèn)的，相信隨著科研工作者們的不懈努力，CTCs相關(guān)技術(shù)會得到極大的進(jìn)步，也將會為腫瘤研究事業(yè)的進(jìn)步提供更有力的支持。