不同濃度檸檬酸對(duì)2株綠藻生長及總脂含量影響?

梁 英, 王 玥， 石偉杰, 2， 田傳遠(yuǎn)， 賴秋璇， 王 帥

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2. 國家海洋局秦皇島海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，河北 秦皇島 066002；3. 海洋活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(國家海洋局第一海洋研究所)，山東 青島 266061)

在所有生物能源中，微藻已經(jīng)獲得了相當(dāng)大的關(guān)注[1]。與其他生物燃料原料相比，微藻能夠生長在不同水質(zhì)中[2]，解決了對(duì)可耕土地的競爭問題。微藻生命周期短并具高生長率[3-4]、高生物量和高光合效率[5]，除油脂外，能產(chǎn)生一些有價(jià)值的副產(chǎn)物，被認(rèn)為是維生素、礦物質(zhì)、抗氧化劑和其他藥物化合物的豐富來源[6]。微藻也可作為動(dòng)物飼料或厭氧發(fā)酵產(chǎn)生甲烷。但是目前微藻高培養(yǎng)成本和低脂含量限制了微藻生物柴油工業(yè)化的發(fā)展，若解決了生產(chǎn)成本及生產(chǎn)環(huán)節(jié)的瓶頸，微藻生物柴油必能廣泛代替陸生植物生物柴油，成為更可持續(xù)生物柴油的主要原料來源[7-9]。

檸檬酸是脂肪酸合成的原料，可在細(xì)胞溶質(zhì)中合成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A含量增加有利于脂肪酸的合成[10-11]。檸檬酸亦能促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶的活性，后者催化乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸合成過程從而促進(jìn)脂肪酸合成[12]。此外，檸檬酸參與三大物質(zhì)氧化分解過程，是構(gòu)成呼吸鏈的重要物質(zhì)之一，能夠?yàn)闄C(jī)體提供大量能量[13-14]，從而促進(jìn)細(xì)胞生長。近年來，已有學(xué)者進(jìn)行了檸檬酸對(duì)微藻生長及總脂含量影響方面的研究[15-17]，但研究結(jié)果有所差異。丁彥聰?shù)萚15]對(duì)小球藻(Chlorellasp.)的研究結(jié)果表明，添加檸檬酸能夠促進(jìn)小球藻生長，但對(duì)小球藻總脂含量無顯著影響。Li等[16]的研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的檸檬酸可促進(jìn)小球藻(Chlorellavulgaris)的生長和總脂合成。楊凱[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加適量的外源檸檬酸能促進(jìn)克里藻(Klebsormidiumsp.)、枝鞘藻(Oedocladiumsp.)和真枝藻(Stigonemasp.)生長并提高它們的總脂含量。

綠藻生長快，易培養(yǎng)，生物量和總脂含量高，有成為生物柴油優(yōu)質(zhì)原料的潛力。海綠球藻(Halochloro-coccumsarcotum)屬綠藻門(Chlorophyta)綠球藻目(Chlorococcales)海綠球藻屬(Halochlorococcum)[18]，微綠球藻(Nannochlorisoculata)屬綠藻門(Chlorophyta)四胞藻目(Tetrasporales)微綠球藻屬(Nannochloris)[19]。研究表明，海綠球藻和微綠球藻的總脂含量能分別達(dá)到干重的35.80%和33.56%[20]。目前，僅見石偉杰有關(guān)檸檬酸對(duì)海綠球藻和微綠球藻總脂含量及脂肪酸組成影響的報(bào)道[20]。本文以海綠球藻和微綠球藻為實(shí)驗(yàn)材料，研究了不同濃度檸檬酸對(duì)2株綠藻的生長、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、總脂含量和脂肪酸組成的影響，以期為2株綠藻的開發(fā)利用提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

實(shí)驗(yàn)所用藻種取自中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫，分別為海綠球藻(Halochlorococcumsarcotum)和微綠球藻(Nannochlorisoculata)。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)所用容器為1 000 mL的三角燒瓶，所用培養(yǎng)基為f培養(yǎng)基，即f/2培養(yǎng)基[21]營養(yǎng)鹽濃度的2倍。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)基中檸檬酸濃度分別設(shè)為0(對(duì)照組)、0.05、0.1、0.2和0.4 g/L，每個(gè)檸檬酸濃度設(shè)3個(gè)平行。將處于指數(shù)生長末期的實(shí)驗(yàn)藻種(400 mL)接種到含不同檸檬酸濃度的培養(yǎng)液(400 mL)中。培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度5 000 lx，鹽度31，連續(xù)充氣培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為4 d，每天定時(shí)定量取樣，測定細(xì)胞密度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，培養(yǎng)結(jié)束后測定葉綠素含量、干重、總脂含量以及脂肪酸組成。

1.3 各項(xiàng)參數(shù)測定

用血球計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞密度，按梁英等[22]的方法測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)(PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、光化學(xué)淬滅qP、非光化學(xué)淬滅NPQ、最大光合作用效率Pm、快速光曲線的初始斜率α、最小飽和光照強(qiáng)度Ik)，按戴榮繼等[23]的方法測定葉綠素含量，按李植峰等[24]的方法測定總脂含量?？傊a(chǎn)率=總脂含量×干重/培養(yǎng)天數(shù)，單位為g/(L·d)。按照改進(jìn)的Lepage和Roy[25]方法對(duì)干燥的微藻樣品進(jìn)行甲酯化，按照梁英等[26]的方法采用美國Agilent 6890N型氣相色譜儀、5973型質(zhì)譜儀測定脂肪酸組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析、多重比較及相關(guān)性分析(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻和微綠球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖1a～f顯示了海綠球藻在不同濃度檸檬酸培養(yǎng)條件下其熒光參數(shù)的變化情況。從圖1可以看出，在整個(gè)培養(yǎng)周期中，對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的Fv/Fm值均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高，且顯著高于高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)。0.2 g/L處理組的Fv/Fm值隨培養(yǎng)時(shí)間變化不顯著，0.4 g/L處理組的該參數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐步下降。第1～4天，對(duì)照及各處理組的qP值都先升高后降低，第1～3天，0.4 g/L處理組的qP值最低，其次是0.2 g/L處理組，對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)間無顯著差異(P>0.05)。Pm和Ik值隨培養(yǎng)時(shí)間和不同濃度檸檬酸的變化規(guī)律相似：對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的Pm和Ik值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高，均在第2天達(dá)到最大值，之后隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而下降，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的Pm和Ik值均顯著高于高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)。對(duì)照及各處理組的NPQ值都隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高，在第4天，0.4 g/L處理組的NPQ值顯著高于對(duì)照及其他處理組。對(duì)照及各處理組的α值隨培養(yǎng)時(shí)間增加總體呈下降趨勢(shì)，在第4天，0.2 g/L處理組的α值最大，0.05 g/L處理組最小。

圖1 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)(Fv/Fm、qP、NPQ、Pm、α、Ik)的影響Fig.1 Effects of different citric acid concentrations on the chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, qP, NPQ, Pm, α, Ik) of Halochlorococcum sarcotum

圖2 不同濃度檸檬酸對(duì)微綠球藻葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)(Fv/Fm、qP、NPQ、Pm、α、Ik)的影響Fig.2 Effects of different citric acid concentrations on the chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, qP, NPQ, Pm, α, Ik) of Nannochloris oculata

圖2a～f表示的是不同濃度檸檬酸對(duì)微綠球藻葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊憽D2顯示，第2～4天，對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的Fv/Fm值顯著高于高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)。實(shí)驗(yàn)前期(1～2 d)對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的qP值顯著高于高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的qP值顯著低于高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)。在整個(gè)培養(yǎng)周期中，對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的Pm和Ik值均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加先升高后降低且組間差異不顯著(P>0.05)，而高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的上述參數(shù)則隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低，均顯著低于對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)。第1～4天，對(duì)照及各處理組的NPQ值均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，0.4 g/L處理組的NPQ值最大，顯著高于對(duì)照及其他處理組。第1～4天，對(duì)照及各處理組的α值與NPQ的變化趨勢(shì)相反，均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，0.4 g/L處理組的α值最低。

2.2 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻和微綠球藻細(xì)胞密度、干重和葉綠素含量的影響

不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻細(xì)胞密度、干重和葉綠素含量的影響見圖3a～c。實(shí)驗(yàn)前期(0～2 d)對(duì)照及各處理組細(xì)胞密度呈上升趨勢(shì)，2 d后趨于穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞密度由大到小為0.1 g/L處理組>0.05 g/L處理組>對(duì)照組>0.2 g/L處理組>0.4 g/L處理組，0.1 g/L處理組的細(xì)胞密度最大，比對(duì)照組增加了21.26%，顯著高于對(duì)照及其他處理組，而高濃度檸檬酸(0.2～0.4 g/L)顯著抑制細(xì)胞密度的增加。檸檬酸濃度對(duì)海綠球藻的細(xì)胞干重和葉綠素含量也有顯著影響，與對(duì)照組相比，低濃度檸檬酸(0.05～0.1 g/L)對(duì)細(xì)胞干重有顯著的促進(jìn)作用，檸檬酸濃度為0.1 g/L時(shí)細(xì)胞干重最大，但與0.05 g/L處理組差異不顯著。高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的細(xì)胞干重和葉綠素含量均顯著小于對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)，說明檸檬酸濃度為0.2～0.4 g/L時(shí)抑制海綠球藻干重的增加和葉綠素的合成。

圖3 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻細(xì)胞密度、干重和葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of different citric acid concentrations on the cell density, dry weight and chlorophyll content of Halochlorococcum sarcotum

圖4a～c反映了不同濃度檸檬酸下，微綠球藻生長及葉綠素含量的變化情況。從圖4可以看出，第2天到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低濃度處理組(0.05～0.1 g/L)的細(xì)胞密度顯著高于對(duì)照組，而高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照組，說明低濃度檸檬酸可促進(jìn)該藻的生長，而高濃度則抑制其生長。其中0.1 g/L的檸檬酸濃度對(duì)該藻生長的促進(jìn)作用最顯著，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)0.1 g/L處理組的細(xì)胞密度比對(duì)照組增加了15.34%。檸檬酸濃度對(duì)細(xì)胞干重和葉綠素含量也有顯著影響且兩者趨勢(shì)相同，高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的干重和葉綠素含量顯著低于對(duì)照組及低濃度處理組(0～0.1 g/L)，0.05 g/L處理組的干重最大，但與對(duì)照組及0.1 g/L處理組之間差異不顯著(P>0.05)。0～0.1 g/L處理組的葉綠素含量之間也沒有顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同濃度檸檬酸對(duì)微綠球藻細(xì)胞密度、干重和葉綠素含量的影響Fig.4 Effects of different citric acid concentrations on the cell density, dry weight and chlorophyll content of Nannochloris oculata

2.3 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻和微綠球藻總脂含量和總脂產(chǎn)率的影響

圖5a～b給出了不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻總脂含量和總脂產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，0.05～0.2 g/L的檸檬酸濃度對(duì)該藻的總脂含量無顯著影響，0.4 g/L的檸檬酸濃度顯著促進(jìn)了該藻的總脂合成，該濃度下的總脂含量(35.20%)比對(duì)照組增加了17.77%。檸檬酸濃度為0.1 g/L時(shí)總脂產(chǎn)率最大(0.018 g/(L·d))，顯著高于對(duì)照及其他處理組。

不同濃度檸檬酸對(duì)微綠球藻總脂含量和總脂產(chǎn)率的影響見圖6a～b。從圖6可以看出，總脂含量隨檸檬酸濃度的增加而增大，在0.4 g/L時(shí)達(dá)到最大值(40.42%)，比對(duì)照組增加了36.97%；總脂產(chǎn)率在檸檬酸濃度為0.1 g/L時(shí)達(dá)到最大值(0.025 g/(L·d))，比對(duì)照組增加了13.84%。高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的總脂產(chǎn)率顯著低于對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)。

圖5 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻總脂含量和總脂產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of different citric acid concentrations on the total lipid contents and total lipid productivity of Halochlorococcum sarcotum

圖6 不同濃度檸檬酸對(duì)微綠球藻總脂含量和總脂產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of different citric acid concentrations on the total lipid contents and total lipid productivity of Nannochloris oculata

2.4 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻和微綠球藻脂肪酸組成的影響

不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻脂肪酸組成的影響見表1。從表1中可以看出，該藻的主要脂肪酸是16:0(21.03%～22.47%)、18:0(3.39%～7.01%)、20:0(1.85%～3.50%)、18:1n-9(28.05%～42.47%)、16:3n-3(7.01%～11.98%)和18:2n-6(13.20%～14.91%)。多重比較結(jié)果顯示，檸檬酸濃度對(duì)18:0、20:0、18:1n-9及16:3n-3含量的影響差異顯著(P<0.05)，對(duì)18:2n-6含量的影響差異不顯著(P>0.05)。其中，0.1～0.2 g/L處理組的16:0顯著高于對(duì)照及其他處理組；隨檸檬酸濃度增加，18:0、18:1n-9和MUFA(單不飽和脂肪酸總和)的含量均呈增加趨勢(shì)，都在檸檬酸濃度為0.4 g/L時(shí)達(dá)到最大值，與對(duì)照組相比，分別增加了94.72%、51.40%和51.40%；20:0、16:3n-3和PUFA(多不飽和脂肪酸總和)含量均隨檸檬酸濃度增加而降低，對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的上述脂肪酸含量顯著高于高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)。檸檬酸濃度對(duì)SFA(飽和脂肪酸總和)的影響差異不顯著(P>0.05)。

表2給出了微綠球藻脂肪酸組成隨不同濃度檸檬酸的變化情況。表2顯示，該藻的主要脂肪酸是16:0(23.63%～28.00%)、18:0(3.69%～5.83%)、20:0(1.72%～3.35%)、18:1n-9(33.45%～46.54%)、16:3n-3(4.45%～7.65%)和18:2n-6(11.73%～18.42%)。多重比較結(jié)果表明，檸檬酸濃度對(duì)16:0、18:1n-9、16:3n-3和18:2n-6含量的影響差異顯著(P<0.05)，對(duì)18:0和20:0含量的影響差異不顯著(P>0.05)。檸檬酸濃度為0.2 g/L時(shí)16:0含量達(dá)到最大值，比對(duì)照組增加了18.50%。18:1n-9和MUFA含量均隨檸檬酸濃度的增加而升高，在檸檬酸濃度為0.4 g/L時(shí)達(dá)到最大值，分別比對(duì)照組增加了39.13%和39.13%。16:3n-3、18:2n-6和PUFA含量均隨檸檬酸濃度增加而降低，高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的上述脂肪酸含量顯著低于對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)。檸檬酸濃度對(duì)SFA的影響差異顯著(P<0.05)，檸檬酸濃度為0.2 g/L時(shí)SFA含量最高，但與0.4 g/L處理組差異不顯著。

表1 不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比)Table 1 Effects of different citric acid concentrations on the fatty acid compositions of Halochlorococcum sarcotum(Expressed in perrentage of total fatty acids) /%

注：abc表示方差分析差異程度，同一行數(shù)值上存在不同字母表明處理組間差異顯著(P<0.05)，存在相同字母表明處理組間差異不顯著(P>0.05)。

Note: abc indicated variance analysis in the difference degree, values with different letters in the same line were significantly different from each other (P<0.05), values with same letters in the same line were no significantly different from each other (P>0.05).

3 討論

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)能夠利用植物活體發(fā)出的葉綠素?zé)晒?，快速、有效檢測出植物細(xì)胞光合功能的受損情況。Fv/Fm表示PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率，能夠反映環(huán)境變化對(duì)微藻光合作用產(chǎn)生的影響，F(xiàn)v/Fm值在不良環(huán)境下會(huì)明顯降低[27]。在整個(gè)培養(yǎng)周期中，海綠球藻和微綠球藻高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的Fv/Fm值始終顯著低于對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)，該結(jié)果表明，高濃度檸檬酸(0.2～0.4 g/L)脅迫下，2株綠藻的PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率降低，PSⅡ反應(yīng)中心受損，原初反應(yīng)被抑制。qP表示光化學(xué)淬滅，反映了PS Ⅱ 處于光適應(yīng)狀態(tài)下進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)的能力。Pm表示最大光合作用效率[28]，Ik表示最小飽和光照強(qiáng)度。海綠球藻和微綠球藻對(duì)照及低濃度處理組(0～0.1 g/L)的qP、Pm和Ik值均顯著高于高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)，上述結(jié)果說明0.2～0.4 g/L的檸檬酸濃度不利于2株綠藻的光合作用，進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)的能力受到抑制，最大光合作用效率降低。NPQ為非光化學(xué)淬滅，海綠球藻和微綠球藻高濃度處理組(0.2～0.4 g/L)的該參數(shù)顯著高于其他處理組，原因可能是微藻在高濃度檸檬酸(0.2～0.4 g/L)脅迫下，通過提高NPQ來散失光合色素吸收的過多光能[29]，從而保證光合系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，降低對(duì)細(xì)胞的傷害。丙酮酸羧化酶存在于所有光合生物中，是光合作用過程中的關(guān)鍵酶，參與光合碳同化等重要代謝途徑[30-31]。有機(jī)酸是常用的丙酮酸羧化酶的抑制劑[32]。檸檬酸是經(jīng)過發(fā)酵制取的一種有機(jī)酸[33]。由此可以看出，高濃度檸檬酸通過抑制海綠球藻和微綠球藻的丙酮酸羧化酶活性，破壞藻細(xì)胞PSⅡ反應(yīng)中心，且檸檬酸濃度越大破壞程度越大，從而阻礙電子傳遞，降低電子傳遞活性和光合作用效率。

研究表明，添加外源檸檬酸對(duì)微藻生長有一定的影響[15-17]。丁彥聰?shù)萚15]對(duì)小球藻的研究結(jié)果表明，到達(dá)收獲期時(shí)，在添加了濃度為0.78 mmol/L(0.15 g/L)檸檬酸的培養(yǎng)液中小球藻的細(xì)胞密度最大，為對(duì)照組的2.5倍。楊凱[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬酸濃度為100 mg/L(0.1 g/L)時(shí)，克里藻、枝鞘藻的生長最佳，而真枝藻則在檸檬酸濃度為120 mg/L(0.12 g/L)下生長效果最好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適合海綠球藻和微綠球藻生長的檸檬酸濃度均為0.1 g/L，與楊凱對(duì)克里藻、枝鞘藻的研究結(jié)果一致。此外，丁彥聰?shù)萚15]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的最初幾天，小球藻在0.26～0.52 mmol/L(0.05～0.1 g/L)的較低濃度檸檬酸培養(yǎng)液中生長較快，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，小球藻在0.78 mmol/L(0.15 g/L)的較高濃度檸檬酸培養(yǎng)液中生長速度加快。而我們的結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)周期中，低濃度檸檬酸(0.05～0.1 g/L)促進(jìn)海綠球藻和微綠球藻的生長，而高濃度檸檬酸(0.2～0.4 g/L)則抑制2株綠藻的生長。這種差異主要與實(shí)驗(yàn)所用藻種、檸檬酸濃度范圍以及培養(yǎng)條件有關(guān)，丁彥聰?shù)萚15]在L1海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻，檸檬酸濃度為0～0.78 mmol/L(0～0.15 g/L)，培養(yǎng)時(shí)間為14 d；而本實(shí)驗(yàn)是在f培養(yǎng)基中培養(yǎng)海綠球藻和微綠球藻，檸檬酸濃度為0.05～0.4 g/L，培養(yǎng)時(shí)間為4 d。一方面，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行0.15 g/L檸檬酸濃度對(duì)海綠球藻和微綠球藻生長的研究，因此無從得知此檸檬酸濃度下2株綠藻的生長狀況。另一方面，丁彥聰?shù)萚15]實(shí)驗(yàn)的檸檬酸濃度最高設(shè)定為0.78 mmol/L(0.15 g/L)，因此也無從得知0.2～0.4 g/L的檸檬酸對(duì)小球藻生長的影響。

表2 不同濃度檸檬酸對(duì)微綠球藻脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比)Table 2 Effects of different citric acid concentrations on the fatty acid compositions of Nannochloris oculata(Expressed in perrentage of total fatty acids) /%

注：abc表示方差分析差異程度，同一行數(shù)值上存在不同字母表明處理組間差異顯著(P<0.05)，存在相同字母表明處理組間差異不顯著(P>0.05)。

Note: abc indicated variance analysis in the difference degree, values with different letters in the same line were significantly different from each other (P<0.05), values with same letters in the same line were no significantly different from each other (P>0.05).

乙酰輔酶A羧化酶是所有生物中脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，催化的反應(yīng)是脂肪酸合成第一個(gè)限速步驟[34-36]。檸檬酸能增加乙酰輔酶A羧化酶的多聚體比例，是一種乙酰輔酶A羧化酶活性的變構(gòu)激活劑[37-38]。因此，添加外源檸檬酸能夠促進(jìn)脂肪酸合成速率[39]，促進(jìn)油脂積累。楊凱[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加100 mg/L(0.1 g/L)的檸檬酸時(shí)克里藻和枝鞘藻的總脂含量最高，添加120 mg/L(0.12 g/L)的檸檬酸時(shí)，真枝藻的總脂含量最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.4 g/L的檸檬酸培養(yǎng)條件下，2株綠藻總脂含量均達(dá)到最大值，與以上結(jié)果有所差異，差異的原因主要與微藻種類、培養(yǎng)條件以及檸檬酸濃度有關(guān)。楊凱[17]是在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)淡水綠藻(克里藻、枝鞘藻)和淡水藍(lán)藻(真枝藻)，檸檬酸濃度為30～150 mg/L(0.03～0.15 g/L)，培養(yǎng)時(shí)間33 d；而本實(shí)驗(yàn)是在f培養(yǎng)基中培養(yǎng)海水的海綠球藻和微綠球藻，檸檬酸濃度為0.05～0.4 g/L，培養(yǎng)時(shí)間為4 d。丁彥聰?shù)萚15]對(duì)小球藻的研究則表明，0～0.78 mmol/L(0～0.15 g/L)的外源檸檬酸對(duì)小球藻總脂含量無顯著影響，與本實(shí)驗(yàn)對(duì)海綠球藻的部分研究結(jié)果相似，即0～0.2 g/L的檸檬酸濃度對(duì)海綠球藻的總脂合成無顯著促進(jìn)效果。綜上所述，檸檬酸濃度對(duì)某些微藻的油脂合成有一定的促進(jìn)作用，但對(duì)另一些微藻的總脂含量沒有顯著影響，添加外源檸檬酸對(duì)微藻總脂含量是否有影響以及影響程度隨著微藻種類、檸檬酸濃度以及培養(yǎng)條件的不同而變化。研究表明，總脂產(chǎn)率能夠反映藻細(xì)胞油脂積累速率，彌補(bǔ)了僅利用生物量或總脂含量作為產(chǎn)油藻株評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的不足[40]，因此本實(shí)驗(yàn)用總脂含量和總脂產(chǎn)率相結(jié)合的方法來綜合評(píng)價(jià)外源檸檬酸對(duì)2株綠藻油脂積累的影響。

在微藻脂肪酸合成過程中，經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶催化合成的丙二酸單酰輔酶A與乙酰輔酶A共同作為引物合成16碳和18碳的飽和脂肪酸，然后經(jīng)過碳鏈延長酶及去飽和酶作用逐步形成不飽和脂肪酸[41-42]。檸檬酸既是乙酰輔酶A羧化酶的變構(gòu)激活劑[37-38]，也是合成乙酰輔酶A的原料之一[10-11]，因此，檸檬酸在決定細(xì)胞內(nèi)代謝燃料走向分解利用或以脂肪酸形式貯存方面有重要作用[43]。國內(nèi)外有關(guān)不同濃度檸檬酸對(duì)微藻脂肪酸的研究一般集中在脂肪酸含量方面，對(duì)脂肪酸組成的研究很少[15-17]。本實(shí)驗(yàn)中，2株綠藻的18:1n-9和MUFA均隨檸檬酸濃度增大而增加，16:3n-3和PUFA均隨檸檬酸濃度增大而降低，SFA隨檸檬酸濃度的變化趨勢(shì)則與微藻種類有關(guān)，說明高濃度檸檬酸對(duì)2株綠藻的18:1n-9和MUFA的合成有促進(jìn)作用，而對(duì)16:3n-3和PUFA的合成有抑制作用，檸檬酸濃度對(duì)海綠球藻SFA的合成影響不顯著，對(duì)微綠球藻的SFA合成有一定的促進(jìn)作用。因此檸檬酸濃度對(duì)不同藻種脂肪酸組成的影響存在差異，目前關(guān)于檸檬酸對(duì)微藻脂肪酸組成的相關(guān)文獻(xiàn)還未見報(bào)道，具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

本研究得出，不同濃度檸檬酸對(duì)海綠球藻和微綠球藻的生長、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、總脂含量和脂肪酸組成均有顯著影響。檸檬酸濃度為0.1 g/L時(shí)，2株綠藻的生長狀況和葉綠素?zé)晒鈪?shù)達(dá)到較為理想狀態(tài)，且它們的總脂產(chǎn)率達(dá)到最高。因此，適合2株綠藻生長及產(chǎn)脂的最佳檸檬酸濃度是0.1 g/L。本研究探索了不同藻種的最佳檸檬酸濃度，在保證微藻生物量的前提下提高總脂含量,為海綠球藻和微綠球藻的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。