不同灸量隔姜灸對(duì)脾虛證大鼠胃組織絲裂原細(xì)胞外激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶表達(dá)的影響

賁定嚴(yán)++寧炯杰++徐寅++羅燕++李木清++王云輝++易展?

摘要：目的 觀察不同灸量隔姜灸對(duì)脾虛證大鼠胃組織絲裂原細(xì)胞外激酶（MEK）1/2和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2表達(dá)的影響，探討隔姜灸治療脾虛證的可能作用機(jī)制及量效特征。方法 將75只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、隔姜灸3壯組、隔姜灸6壯組、隔姜灸9壯組，每組15只。200%大黃濃縮液4 ℃灌胃制作脾虛證大鼠模型。造模成功后，隔姜灸組選取“足三里”“中脘”予不同灸量治療，連續(xù)8 d。HE染色鏡下觀察大鼠胃組織病理學(xué)改變，免疫組化檢測(cè)大鼠胃組織MEK1/2及ERK1/2的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠胃黏膜損傷明顯，可見較大的破損、脫落；與模型組比較，隔姜灸3壯組大鼠胃黏膜表面有部分脫落、破損情況改善，隔姜灸6壯組和隔姜灸9壯組大鼠胃黏膜表面較完整、脫落及破損明顯改善。與空白對(duì)照組比較，模型組胃組織MEK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，隔姜灸各組胃組織MEK1/2及ERK1/2蛋白明顯表達(dá)升高（P<0.01）；與隔姜灸3壯組比較，隔姜灸6壯組和隔姜灸9壯組胃組織MEK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01），但二者作用效果相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 隔姜灸通過提高胃組織MEK1/2及ERK1/2的蛋白表達(dá)，激活MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)脾虛證大鼠胃黏膜的修復(fù)。

關(guān)鍵詞：灸量；隔姜灸；脾虛證；胃黏膜增殖修復(fù)；絲裂原細(xì)胞外激酶；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.012

中圖分類號(hào)：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）01-0054-05

Effects of Different Dosages of Moxibustion with Ginger-Separated Moxibustion on MEK1/2 and ERK1/2 of Gastric Tissue in Rats with Spleen Deficiency

BI Ding-yan1， NING Jiong-jie1， XU Yin2， LUO Yan3， LI Mu-qing1， WANG Yun-hui1， YI Zhan1

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

3. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China

Abstract： Objective To observe effects of different dosages of moxibustion with ginger-separated moxibustion on expressions of mitogen extracellular kinase （MEK） 1/2 and extracellular regulated protein kinase （ERK） 1/2 of gastric tissue in rats with spleen deficiency； To explore the possible mechanism and the dose-effect relationship. Methods Seventy-five SD rats were randomly divided into blank control group， model group， ginger-separated moxibustion for three zhuang group， six zhuang group and nine zhuang group according to random digits table method， with fifteen rats in each group. The rat model of spleen deficiency was established by intragastric administration with 200% Rhei Radix et Rhizoma infusion at 4 ℃. Ginger-separated moxibustion groups were treated with different dosage of moxibustion at “Zusanli”， “Zhongwan” for eight days after the modeling. Pathological changes of gastric tissue by HE staining were observed under light microscope， and immunohistochemistry was used to detect the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue of rats. Results Compared with the blank

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（13C685）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2016B351）

通訊作者：易展，E-mail：2271813059@qq.com

control group rats， the gastric mucosa injury in the model group was obvious， which showed that the damage and abscission was more serious； compared with the model group， the gastric mucosa of rats was partly exfoliated and the damage was improved in three zhuang group， and the surface of gastric mucosa of rats was more complete and damage was improved obviously in six zhuang group and nine zhuang group； compared with the blank control group， the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue increased obviously in other groups （P<0.01）； compared with three zhuang group， the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue increased in six zhuang group and nine zhuang group （P<0.01）， but the effects of the two group were similar， without statistical significance （P>0.05）. Conclusion Ginger-separated moxibustion can repair gastric mucosa in rats with spleen deficiency， which may be closely associated with its effect in increasing the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue and activating the MEK/ERK signal transduction pathway.endprint

Keywords： dosage of moxibustion； ginger-separated moxibustion； spleen deficiency； proliferation and restoring of gastric mucosa； mitogen activated protein kinase； extracellular regulated protein kinase； rats

脾虛證是指脾氣虛弱導(dǎo)致脾失運(yùn)化的病證，是消化性潰瘍、慢性胃炎等消化系統(tǒng)疾病的常見中醫(yī)證型。有研究發(fā)現(xiàn)，脾虛大鼠胃底部黏膜缺損、炎細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張充血、黏膜下層水腫[1]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)通路作用于核轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞增殖和凋亡關(guān)系密切，并參與胃黏膜炎癥及損傷過程，其中絲裂原細(xì)胞外激酶（MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]。臨床研究顯示，針灸治療脾胃虛寒證胃炎療效確切，尤其是艾灸療法的作用更加明顯[4]。前期研究表明，隔姜灸不僅能改善脾胃虛寒證患者的臨床癥狀，還具有抗氧化等良性調(diào)節(jié)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察不同灸量隔姜灸對(duì)MEK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)的影響，從MEK/ERK信號(hào)通路角度探討不同灸量隔姜灸對(duì)脾虛證大鼠胃黏膜的保護(hù)作用及量效特征，以期為隔姜灸治療脾虛證的臨床運(yùn)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

雌性健康SD大鼠75只，SPF級(jí)，月齡2～3月，體質(zhì)量200～250 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70%環(huán)境。75只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、隔姜灸3壯組、隔姜灸6壯組、隔姜灸9壯組，每組15只。

1.2 主要試劑與儀器

艾條，南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠；生姜片，厚2～3 mm，直徑1.8 cm；ERK1/2試劑盒（美國Proteintech Group公司），MEK1/2試劑盒（英國Abcam公司），石蠟、中性樹膠（美國Sigma公司），蘇木素、PBS、枸櫞酸鹽緩沖液、二步法試劑盒（Wellbio公司），DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），常規(guī)化學(xué)試劑（國藥控股上海生物醫(yī)藥有限公司）。搖床（其林貝爾儀器制造有限公司），恒溫箱（北京六一儀器廠），微波爐（美的集團(tuán)），切片刀（德國萊卡），包埋機(jī)（常州中威電子儀器有限公司），精密pH計(jì)（雷磁上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），顯微鏡（Motic實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.3 造模

參考文獻(xiàn)[6]方法造模。每只大鼠200%大黃濃縮液（1 mL/100 g）4 ℃灌胃，每日2次，連續(xù)14 d。觀察大鼠體質(zhì)量、飲食飲水量、皮膚毛色、大便情況、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)等變化。200%大黃濃縮液制備方法：生大黃購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，10 g/包，加入100 ℃蒸餾水煮沸5 min，然后用4層紗布過濾3～4次，再用100 ℃水浴濃縮至200%（相當(dāng)于2 mg原藥材/mL），4 ℃保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)[6]制定脾虛證動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。主癥：①泄瀉，嚴(yán)重時(shí)脫肛；②食少納呆。兼癥：①形體消瘦，體質(zhì)量減輕；②神態(tài)萎靡不振，四肢不收，毛色枯槁無華；③蜷縮聚堆；④容易疲勞。具備2項(xiàng)主癥和2項(xiàng)兼癥可認(rèn)為脾虛證模型造模成功。

1.4 取穴

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]中常用動(dòng)物穴位定位法及擬人對(duì)照法，以胸鎖聯(lián)合和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點(diǎn)為肚臍。足三里：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處；中脘：臍與胸骨劍突連線中點(diǎn)，約臍上20 mm處。

1.5 干預(yù)及取材

造模成功后，剪除大鼠穴位區(qū)2 cm×2 cm鼠毛，暴露局部皮膚組織，酒精消毒。用自制大鼠固定夾將大鼠仰臥位固定，待大鼠安靜后進(jìn)行艾灸治療。隔姜灸治療組：將放有艾炷（7 mm×9 mm）的姜片固定于穴位區(qū)，點(diǎn)燃施灸，待艾炷燃盡后換下一壯，各隔姜灸治療組分別按每穴每日3壯、6壯、9壯的灸量，連續(xù)治療8 d。空白對(duì)照組與模型組大鼠只固定不作處理。治療完成后，大鼠禁食24 h，禁水6 h，用10%烏拉坦（1 mL/100 g）麻醉后剖腹，將胃幽門部和賁門部用止血鉗結(jié)扎，在兩結(jié)扎線兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗胃內(nèi)殘留物。在超凈工作臺(tái)下，于胃黏膜損傷明顯處，取1 cm×0.5 cm大小的組織塊，生理鹽水沖洗干凈，置于4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h，切片（厚度5 ?m），備檢。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

采用免疫組化檢測(cè)ERK1/2、MEK1/2的蛋白表達(dá)。①60 ℃烤片45 min；②切片脫蠟至水（先將切片置于二甲苯中10 min×2次，然后依次置于100%、95%、85%、75%乙醇中5 min，再用蒸餾水沖洗5 min）；③熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），電加熱至沸騰，間隔5～10 min×2次，冷卻后用0.01 mol/L PBS（pH 7.2～7.6）洗滌3 min×3次；④加入3%H2O2，室溫10 min滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3 min×3次；⑤孵育一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗（MEK1/2為1∶300、ERK1/2為1∶100），4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次；⑥孵育二抗：滴加50～100 μL兔抗鼠IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；⑦DAB顯色：滴加預(yù)制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌；⑧蘇木素復(fù)染5～10 min，1%鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)；⑨梯度乙醇（60%～100%）脫水，每級(jí)5 min，取出后置于二甲苯中10 min，反復(fù)2次。中性樹膠封片，顯微鏡觀察，采用ImagePro Plus圖像分析軟件分析。endprint

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，符合正態(tài)分布采用方差分析，方差齊用LSD或SNK法，方差不齊用Tamhane's T2或Dunnett's T3法，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量和食量保持穩(wěn)定，動(dòng)作敏捷好動(dòng)，精神狀態(tài)良好，大便干燥成型，毛色光澤；造模后大鼠體質(zhì)量增長緩慢，食量下降，活動(dòng)減少，喜蜷臥，大便溏泄，毛色不澤；隔姜灸各組干預(yù)8 d后，食欲增強(qiáng)，活動(dòng)增加，精神狀況明顯改善，糞質(zhì)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)改善。

2.2 胃組織病理變化

空白對(duì)照組大鼠胃黏膜表面細(xì)胞完整，各層組織結(jié)構(gòu)正常未見萎縮、脫落或缺損；模型組大鼠胃黏膜損傷明顯，可見較大的破損脫落；與模型組比較，隔姜灸3壯組大鼠胃黏膜表面有部分脫落、破損情況改善，隔姜灸6壯組和隔姜灸9壯組大鼠胃黏膜表面較完整、脫落及破損明顯改善。結(jié)果見圖1。

2.3 隔姜灸對(duì)模型大鼠胃組織絲裂原細(xì)胞外激酶1/2和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠胃組織MEK1/2和ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，隔姜灸各組胃組織MEK1/2和ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與隔姜灸3壯組比較，隔姜灸6壯組和隔姜灸9壯組胃組織MEK1/2和ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01），但二者效果相當(dāng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1、圖2和圖3。

3 討論

胃黏膜損傷是導(dǎo)致急慢性胃炎、胃潰瘍等疾病的主要病理環(huán)節(jié)，脾虛致使臟腑功能異常，進(jìn)而影響胃黏膜屏障功能，破壞胃黏膜防御機(jī)制和導(dǎo)致慢性胃病的發(fā)生[8]?！镀⑽刚摗て⑽甘⑺フ摗酚小鞍俨〗杂善⑽杆ザ病?，提示脾胃與人體防御功能關(guān)系密切，脾胃虧虛是消化系統(tǒng)疾病特別是胃黏膜局部損傷發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。因此，在治療上應(yīng)從脾胃角度入手，糾正脾胃虧虛的病理基礎(chǔ)，提高胃黏膜自身保護(hù)和防御功能。

灸法是最具傳統(tǒng)特色的中醫(yī)外治法之一，其溫?zé)岽碳つ墚a(chǎn)生良好的溫通及溫補(bǔ)效應(yīng)，從而發(fā)揮養(yǎng)生保健和防病治病的功效[9]。隔姜灸是將生姜之辛溫走竄之力，灸火之祛寒行血、溫通經(jīng)絡(luò)之功相結(jié)合的綜合治療方法。姜艾結(jié)合施灸，發(fā)揮協(xié)同作用，效果相得益彰。《醫(yī)宗金鑒·刺灸心法要訣》有“凡灸諸病，火足氣到，始能求愈”，提示艾灸灸量直接影響療效[10]，臨床治病必須達(dá)到一定的灸量，才能取得最佳效果。而灸治時(shí)間是影響灸量的一個(gè)重要因素。

細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi)，其參與細(xì)胞凋亡、增殖及炎癥性組織損傷，其核心由3種蛋白激酶構(gòu)成，即Raf/MEK/ERK。Raf是分子質(zhì)量為40～75 kD的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，有3種同工酶A-Raf、B-Raf和Raf-1。MEK為MAP2K家族成員，有MEK1、MEK2兩個(gè)亞型，上游的Raf1蛋白激酶被活化后，其C端催化區(qū)能與MEK結(jié)合，并使催化區(qū)中的Thr和Ser磷酸化，從而激活MEK?；罨腗EK能夠磷酸化酪氨酸/蘇氨酸（Tyr/Thr）殘基，其作用是磷酸化并激活下游底物ERK1/2，從而影響細(xì)胞生長、增殖、分化。其中，ERK是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。ERK1/2也是多種細(xì)胞外信號(hào)（激素、細(xì)胞因子、生長因子等）引起細(xì)胞增殖與分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路或匯聚點(diǎn)。研究表明，磷酸化的ERK1/2活性升高可刺激Caco2/15細(xì)胞株在體外的增生，當(dāng)增生到一定程度后，ERK1/2活性逐步降低，細(xì)胞增殖停止并轉(zhuǎn)向分化，表明ERK1/2是胃腸道細(xì)胞分化過程的重要調(diào)節(jié)因子[11]。李鐵浪等[12]研究表明，艾灸通過激活TFF/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)脾虛胃潰瘍大鼠損傷胃黏膜的增殖修復(fù)。

本研究結(jié)果顯示，大黃濃縮液灌胃14 d后，大鼠體質(zhì)量增長緩慢，食量下降，活動(dòng)減少，喜蜷臥，大便溏泄，毛色不澤，提示造模成功。成模后采用不同灸量隔姜灸進(jìn)行干預(yù)，大鼠食欲增強(qiáng)，活動(dòng)增加，精神狀況明顯改善，糞質(zhì)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)改善，說明不同灸量隔姜灸均能改善脾虛表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，模型組胃組織MEK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)升高，提示大鼠胃黏膜受損后有一定的自我修復(fù)功能，激活了MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并啟動(dòng)胃黏膜的重建和修復(fù)；隔姜灸“足三里”“中脘”后，隔姜灸各組胃組織MEK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，由此我們推斷隔姜灸通過上調(diào)MEK1/2的表達(dá)，進(jìn)一步提高ERK1/2的活性，激活MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)脾虛證大鼠胃黏膜損傷組織的增殖修復(fù)，光鏡下胃黏膜表面脫落、破損情況改善。同時(shí)與隔姜灸3壯組比較，隔姜灸6壯組和隔姜灸9壯組胃組織MEK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)升高，提示在一定范圍內(nèi)，隨著灸量的增加，隔姜灸促進(jìn)胃黏膜組織的增殖修復(fù)作用越強(qiáng)，但隔姜灸6壯組和隔姜灸9壯組作用效果相當(dāng)，說明并不是灸量越大，其產(chǎn)生的效應(yīng)越強(qiáng)，與光鏡下胃黏膜組織的表現(xiàn)類似。盧明香等[13]研究不同灸量隔姜灸對(duì)高脂血癥大鼠穴位局部溫度的影響指出，6壯組和9壯組所達(dá)到的最高溫度均比3壯組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而6壯組和9壯組間差異無統(tǒng)計(jì)意義。說明機(jī)體對(duì)隔姜灸的刺激作用可能具有一定的有效閾值范圍，即適宜的灸量，當(dāng)隔姜灸達(dá)到有效閾值，即達(dá)到效應(yīng)的平臺(tái)期，即使刺激量超過閾值，隔姜灸的刺激作用也不再增加。

綜上所述，隔姜灸能促進(jìn)脾虛證大鼠胃黏膜的增殖修復(fù)，其作用機(jī)制可能與升高胃組織MEK1/2及ERK1/2蛋白表達(dá)，激活MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，且在一定范圍內(nèi)，隨著灸量的增加，隔姜灸促進(jìn)胃黏膜組織的增殖修復(fù)作用增強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李晨，王垂杰.3種脾虛證模型大鼠胃黏膜損傷情況的比較[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2013，21（3）：127-130.endprint