拮抗菌XY1培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

張曉宇，高振峰，張新憲

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西 太谷 030801）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，每年因病蟲草害造成的經(jīng)濟損失巨大[1-2]，目前，一般采用化學農(nóng)藥進行防治，但由于化學農(nóng)藥的大量使用，不僅對大氣、土壤、水體等造成了嚴重污染[3-4]，影響人們的身體健康，而且病原物的抗藥性也在增強[5-6]，給病害防治帶來困難。用有益生物防治各種作物病蟲害是生物防治的一大趨勢，近年來，利用拮抗微生物防治芒果炭疽病已取得一定的成效[7-8]。很多試驗證明，芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的細菌可作為拮抗微生物，有效防治柑橘青霉病[9]、蒂腐病[10]及綠霉病[11]，桃、杏和李的褐腐病[12]，櫻桃褐腐病[13]。目前，用于病害生物防治的芽孢桿菌主要有短芽孢桿菌（Bacillus brevis），蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），短小芽孢桿菌（Bacillus pumillus）和多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）等，對多種病原菌引起的病害具有防病效果或抑制作用[14]。

本研究首次對從杏葉中篩選出的拮抗菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在為生物抑菌劑的制備奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 拮抗菌株P(guān)seudomonas aeruginosa XY1，梨鏈格孢菌Alternaria alternata和梨尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，由山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所采后病理實驗室分離提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 000 mL；NB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL；YSP 培養(yǎng)基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，蔗糖 20 g，蒸餾水1 000 mL；NYBD培養(yǎng)基：酵母膏 5 g，牛肉膏 8 g，葡萄糖 10 g，蒸餾水1 000 mL；CM培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏 3 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.1.3 主要儀器及試劑 賽多利斯CP224S型電子天平（德國）；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；LS-B50L型立式數(shù)顯壓力蒸汽滅菌鍋（江蘇江陰濱江醫(yī)療器械廠）；DHZ-D型恒溫搖床（太倉市實驗設(shè)備廠）；UV-5100B型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；PHS-3C型酸度計（上海精科雷磁儀器廠）。試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體生長量測定 以不接種拮抗菌株的培養(yǎng)基液為空白對照，測定其在波長為600 nm時的發(fā)酵液OD值。

1.2.2 抑菌物質(zhì)積累量的測定 采用抑菌圈法[15]，發(fā)酵液離心10 min（10 000 r/min）取上清，濾膜過濾后制成無菌濾液。無菌濾液與PDA培養(yǎng)基按照1∶50混勻，待培養(yǎng)基冷卻后，將直徑為5 mm的梨尖孢鐮刀菌和梨鏈格孢菌菌塊接入平板中心，空白對照以無菌水代替無菌濾液。25℃恒溫培養(yǎng)，待空白對照將要長滿培養(yǎng)皿時，測定病斑菌塊的直徑，并且計算抑菌率（%）。

1.2.3 種子液制備 挑取新鮮XY1單菌落，接種于20mLNB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng) 24h（160r/min），制得XY1種子液。

1.2.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)液篩選 在NB，LB，CM，NYBD，YSP這5種滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，按2%的接種量，接種XY1的種子液。28℃黑暗振蕩培養(yǎng)72h（160r/min），測定不同基礎(chǔ)培養(yǎng)液中XY1菌體生長量（OD600）和抑菌物質(zhì)的積累量。重復3次。

1.2.5 培養(yǎng)液碳源篩選 分別用麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、糊精和葡萄糖代替上述優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的碳源，將XY1種子液分別接種于培養(yǎng)液中（接種量為2%（V∶V））。28℃黑暗振蕩培養(yǎng)72 h（160 r/min），測定不同碳源培養(yǎng)液中XY1菌體生長量（OD600）和抑菌物質(zhì)的積累量。重復3次。

1.2.6 培養(yǎng)液氮源篩選 將1.2.4和1.2.5篩選到的最佳培養(yǎng)液和最佳碳源為固定培養(yǎng)液和碳源，以蛋白胨、尿素、牛肉膏＋蛋白胨、酵母膏＋蛋白胨、牛肉膏＋酵母膏和胰蛋白胨＋酵母膏為氮源制得培養(yǎng)液，將XY1種子液分別接種于培養(yǎng)液中（接種量為2%（V∶V））。28℃黑暗振蕩培養(yǎng) 72h（160r/min），測定不同氮源培養(yǎng)液中XY1菌體生長量（OD600）和抑菌物質(zhì)的積累量。重復3次。

1.2.7 其他培養(yǎng)條件的優(yōu)化采用正交試驗法L16（45）對拮抗菌XY1發(fā)酵培養(yǎng)條件中的溫度、初始pH值、每250 mL三角瓶裝液量和接種量等條件進行5因素4水平優(yōu)化[16]（表1）。在不同的發(fā)酵條件下培養(yǎng)成分相同的培養(yǎng)液，測定不同處理培養(yǎng)液的菌體生長量和抑菌物質(zhì)積累量，同時進行正交試驗極差分析。

用1 mol/LHCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的初始pH。3次重復。

表1 培養(yǎng)條件的正交試驗因素和水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對數(shù)據(jù)進行整理和繪圖；采用SPSS 17.0進行正交試驗極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)液對發(fā)酵效果的影響

分別用5種不同培養(yǎng)液對拮抗菌株XY1進行72 h培養(yǎng)后，發(fā)酵液中的菌體生長量和抑菌物質(zhì)產(chǎn)生量均存在差異。從圖1可以看出，NYBD培養(yǎng)液中XY1菌體生長量最大，CM培養(yǎng)液中XY1菌體生長量最少；比較這5種培養(yǎng)液的無菌濾液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率后發(fā)現(xiàn)，NYBD無菌濾液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率均比其他培養(yǎng)液抑菌率大（圖2）?；谝陨显囼灲Y(jié)果，選擇NYBD培養(yǎng)液作為拮抗菌XY1的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

2.2 碳源對發(fā)酵效果的影響

用6種不同碳源代替NYBD培養(yǎng)基中的葡萄糖，經(jīng)72 h發(fā)酵培養(yǎng)，XY1的菌體生長量和抑菌物質(zhì)累積量如圖3所示。從圖3可以看出，XY1菌體生長量在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)液中最多，其次是蔗糖，且二者在0.05水平上差異不顯著；比較不同碳源培養(yǎng)液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率可以發(fā)現(xiàn)，蔗糖培養(yǎng)液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為88.75%和90%?；谝陨显囼灲Y(jié)果，確定蔗糖為菌株XY1發(fā)酵最佳碳源。

2.3 氮源對發(fā)酵效果的影響

用蔗糖代替NYBD中的葡萄糖、用6種不同氮源代替牛肉膏和酵母膏，72 h發(fā)酵培養(yǎng)，XY1的菌體生長量和抑菌物質(zhì)累積量如圖4所示。從圖4可以看出，XY1菌體生長量在以胰蛋白胨＋酵母膏和牛肉膏＋酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中較大，且在0.05水平上差異不顯著；比較不同氮源培養(yǎng)液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率可以發(fā)現(xiàn)，胰蛋白胨＋酵母膏培養(yǎng)液抑菌物質(zhì)累積最大，對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為89.5%和83.54%?；谝陨显囼灲Y(jié)果，確定胰蛋白胨＋酵母膏為菌株XY1發(fā)酵最佳氮源。

2.4 正交試驗設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)條件

表2 XY1最佳培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果

續(xù)表2

根據(jù)上述最佳碳源和氮源的試驗結(jié)果，按照正交試驗設(shè)計L16（45）表進行優(yōu)化條件試驗。測定XY1在不同培養(yǎng)條件發(fā)酵液的菌體生長量、對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率，采用綜合平衡法分析得到培養(yǎng)條件的最佳組合，結(jié)果列于表2。

根據(jù)平均數(shù)k的大小，當試驗指標為OD600時，最優(yōu)水平組合為A3B3C2D4E2；當試驗指標為對鏈格孢菌抑菌效果時，最優(yōu)水平組合為A2B3C4D1E2；當試驗指標為對尖孢鐮刀菌抑菌效果時，最優(yōu)水平組合為A1B3C2D4E2。根據(jù)極差大小，當試驗指標為OD600時，各因素的主次順序為B＞A＞C＞E＞D；當試驗指標為對鏈格孢菌抑菌效果時，各因素的主次順序為B＞A＞D＞C＞E；當試驗指標為對尖孢鐮刀菌抑菌效果時，各因素的主次順序為C＞E＞B＞A＞D。根據(jù)綜合平衡法得到培養(yǎng)條件最佳組合是A2B3C2D1E2，即溫度25℃，初始pH值7.0，接種量1%，每250 mL三角瓶裝液量40 mL，發(fā)酵48 h。在此條件下，與優(yōu)化前相比，拮抗菌XY1菌體生長量提高6百分點，梨黑斑病抑菌率提高9%，梨枯萎病抑菌率提高10.1百分點（表2）。

3 討論

本試驗系統(tǒng)地研究了拮抗菌株XY1發(fā)酵的影響因素，結(jié)果表明，菌株XY1發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨8 g，酵母膏5 g,蔗糖9 g，蒸餾水1 000 mL，初始pH值7.0；最優(yōu)培養(yǎng)條件為：溫度25℃，初始pH值7.0，接種量1%、每250 mL三角瓶裝液量40 mL，發(fā)酵48 h。在此條件下，與優(yōu)化前相比，拮抗菌XY1菌體生長量提高6百分點，梨黑斑病抑菌率提高9百分點，梨枯萎病抑菌率提高10.1百分點。

拮抗菌發(fā)酵條件的優(yōu)化是菌株中試的基礎(chǔ)，鹿秀云等[17]研究結(jié)果表明，豆餅粉是拮抗細菌ST-87-14發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源，蔗糖是最適碳源，同時，通過L9（34）正交試驗優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)條件。朱宏建等[18]對辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）ND045發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，菌絲生長抑制率較優(yōu)化前提高11.01百分點，達到82.61%。閆建芳等[19]對龜裂鏈霉菌（Streptomyces rimosus）GQ-17的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化。鄧振山等[20]研究結(jié)果表明，對番茄灰霉病菌拮抗菌D6和D10發(fā)酵條件優(yōu)化后，菌株無菌濾液對番茄灰霉病菌的抑制作用增強。李紅亞等[21]研究表明，對棉花黃萎病拮抗細菌B.velezensis 6-61進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化后，菌株抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量高于通用培養(yǎng)基。姜云等[22]對篩選到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）菌株NJ13進行了發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。本研究通過對拮抗菌株XY1發(fā)酵條件的優(yōu)化為后續(xù)生防菌劑開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。

有報道稱，礦質(zhì)元素及微量元素也可為拮抗菌株提供生長所需營養(yǎng)[23]，在今后的發(fā)酵培養(yǎng)基篩選時應重視礦質(zhì)元素及微量元素的作用。

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