鼠尾藻(Sargassum thunbergii)對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)脅迫的響應(yīng)*

呂 芳 丁 剛 王翔宇 房 慧 吳海一①

(1. 山東省海洋生物研究院 青島 266104; 2. 青島市大型海藻工程技術(shù)研究中心 青島 266104;3. 山東省海水健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 青島 266104)

有機(jī)物是近海環(huán)境的主要污染物之一, 這類污染物難以降解、易于積蓄, 對(duì)海洋生物造成毒害, 使一些海洋水產(chǎn)資源受到嚴(yán)重影響(顏天等, 2000; Chen et al, 2005)。藻類作為海洋環(huán)境中的初級(jí)生產(chǎn)者, 是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要基礎(chǔ), 其生長(zhǎng)和代謝會(huì)直接受到有機(jī)污染物的影響, 進(jìn)而影響到初級(jí)消費(fèi)者和次級(jí)消費(fèi)者的生命活動(dòng)。因此, 研究藻類對(duì)有機(jī)污染物的響應(yīng), 有助于揭示有機(jī)污染物對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)造成的威脅, 為解決海洋環(huán)境的污染問題提供科學(xué)依據(jù)。

鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters, PAEs)是海洋中主要的有機(jī)污染物之一, 對(duì)人和動(dòng)物具有致癌、致畸、致突變和干擾內(nèi)分泌等毒性(Kasahara et al, 2002),對(duì)水生生物(如浮游動(dòng)物、魚類、藻類)的生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生影響(Rhodes et al, 1995; 況琪軍, 2003; Chen et al, 2005; 余江等, 2007), 且能在生物體內(nèi)富集和放大(遲杰等, 2005; 聶湘平等, 2008), 其中鄰苯二甲酸二甲酯(dimethy1 phthalate, DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)和鄰苯二甲酸二異辛酯[Di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP]被我國(guó)列為環(huán)境優(yōu)先控制污染物(陳濟(jì)安, 2007)。因此PAEs對(duì)海洋環(huán)境的污染日益引起學(xué)者的重視。

國(guó)內(nèi)外在有機(jī)污染物對(duì)大型海藻生理生化特征的影響方面已有一些報(bào)道, 主要集中在色素、蛋白及抗氧化防疫指標(biāo)的測(cè)定方面(李欽等, 2004; 吳志輝等,2006; Yu et al, 2007)。對(duì)于大型海藻, 光合生理特征的變化是衡量其生長(zhǎng)狀況的一個(gè)首要指標(biāo), 但目前關(guān)于有機(jī)污染物對(duì)大型海藻光合生理特征以及關(guān)鍵基因表達(dá)變化的研究還較少。

鼠尾藻(Sargassum thunbergii)是我國(guó)沿海常見的經(jīng)濟(jì)海藻, 其藻體長(zhǎng)、生長(zhǎng)快、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng), 可用于提取褐藻膠、甘露醇、碘等工業(yè)原料以及褐藻多酚、多糖等活性物質(zhì), 而且是海洋生態(tài)環(huán)境修復(fù)的理想生物材料(詹冬梅等, 2006; 吳海一等, 2010), 具有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)以鼠尾藻為研究對(duì)象, 選取海洋環(huán)境中常見的有機(jī)污染物 DMP為代表, 研究鼠尾藻對(duì) DMP的響應(yīng), 以期為保護(hù)海洋經(jīng)濟(jì)藻類的養(yǎng)殖環(huán)境提供評(píng)價(jià)指標(biāo)和管理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鼠尾藻采自青島市太平灣潮間帶(36°05′N,120°35′E)。采集的藻體用低溫采集箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室, 海水反復(fù)清洗去除泥沙及雜質(zhì)后, 置于溫度 15°C, 光照1000lx的恒溫光照培養(yǎng)箱中充氣培養(yǎng), 5天后用于實(shí)驗(yàn)。選取生長(zhǎng)健壯、形態(tài)較一致、長(zhǎng)度在 4—5cm的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)是加DMP的過濾海水, DMP濃度設(shè)為 0.1mg/L(低)、0.3mg/L(中)、1.0mg/L(高)三個(gè)梯度, 以天然海水加等量的丙酮作為對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)在容積為3000mL的三角瓶中進(jìn)行, 每個(gè)三角瓶裝2000mL培養(yǎng)液。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)放置15株藻體。實(shí)驗(yàn)在溫度15°C、光周期12h∶12h、光照強(qiáng)度3000lx的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)充氣進(jìn)行, 每天更換培養(yǎng)液。于實(shí)驗(yàn)開始后的第3、5、10、15天取樣測(cè)定鼠尾藻的比生長(zhǎng)速率、葉綠素a含量、光合放氧速率和呼吸速率、rbcL基因的表達(dá)量等指標(biāo)。

1.3 比生長(zhǎng)速率的測(cè)定

比生長(zhǎng)速率(relative growth rate, RGR)的計(jì)算公式如下:

式中Wt為實(shí)驗(yàn)中期或結(jié)束時(shí)藻體鮮重(g),W0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)藻體鮮重(g),t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。

1.4 葉綠素a含量的測(cè)定

參照 Jeffrey等(1975)與王麗梅(2011)的方法測(cè)定。將藻體在液氮中研磨成勻漿狀, 加入8mL80%丙酮于4°C黑暗處抽提12h。4000r/min, 4°C離心15min,棄沉淀, 上清用80%丙酮定容至10mL。以80%丙酮作為空白對(duì)照, 通過分光光度計(jì)測(cè)定 639、647和664nm處的光密度值。重復(fù)3次以上, 計(jì)算平均值。葉綠素a的濃度(Cchla)按照公式Cchla=11.85×OD664-1.54×OD647-0.08×OD639計(jì)算, 單位為 mg/L。最后根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算每克鮮重藻體中的色素含量,單位為mg/g。

1.5 光合放氧速率和呼吸速率的測(cè)定

采用氧電極(Chlorolab-3, Hansatech, 英國(guó))測(cè)定藻體的光合放氧速率和呼吸速率。測(cè)定反應(yīng)杯的環(huán)境溫度為 20°C。光照強(qiáng)度選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的飽和光強(qiáng)300μmol/m2·s, 光合速率表示為每單位鮮重藻體的放氧速率(nmolO2/min·gFW), 呼吸速率表示為每單位鮮重藻體的耗氧速率(nmolO2/min·gFW), 以凈光合放氧速率與呼吸耗氧速率之比獲得P/R的值。

1.6 rbcL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

以 E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit(Omega Biotek)提取待測(cè)藻體的總RNA, 以High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit參照說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以18S rRNA作為內(nèi)參基因, 設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物(表1), PCR反應(yīng)在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio Rad, USA)中進(jìn)行, 所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)重復(fù), 反應(yīng)條件如下: 95°C預(yù)變性10min; 95°C處理10s,58°C處理30s, 40個(gè)循環(huán); 應(yīng)用CFX96 Manager軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。以自然海水中生長(zhǎng)的藻體作為參照,用ΔΔCT法(Livaket al, 2001)計(jì)算待測(cè)組藻體rbcL基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。顯著性差異用單因素方差分析, 分析軟件為 SPSS 13.0, 當(dāng)P<0.05時(shí)為顯著性差異。

表1 熒光定量PCR的引物Tab. 1 The primers for real-time quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 比生長(zhǎng)速率

如圖 1所示, 當(dāng)鼠尾藻暴露在不同質(zhì)量濃度的DMP溶液時(shí), 對(duì)照組藻體的比生長(zhǎng)速率在實(shí)驗(yàn)期間沒有顯著變化(P>0.05), 低濃度 DMP(0.1mg/L)下藻體的生長(zhǎng)速率在實(shí)驗(yàn)前5天內(nèi)顯著升高, 然后逐漸下降, 至 15d時(shí)已顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。而中、高濃度 DMP下藻體的生長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)期間均呈負(fù)增長(zhǎng), 且DMP濃度越高, 藻體的生長(zhǎng)速率越低。

圖1 DMP處理下鼠尾藻的比生長(zhǎng)速率Fig. 1 The effects of DMP on the specific growth rate of Sargassum thunbergii

2.2 葉綠素a的含量

鼠尾藻在低濃度DMP中, 藻體的葉綠素a含量隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯的上升趨勢(shì), 至 15d時(shí),較對(duì)照組上升了28.4%; 但在中、高濃度DMP中時(shí),葉綠素a含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯的下降趨勢(shì), 且DMP濃度越高, 葉綠素a的含量越低, 至培養(yǎng)15d時(shí), 中、高質(zhì)量濃度DMP下的葉綠素a含量較對(duì)照組分別下降了17.9%、22.8%(圖2)。

2.3 光合放氧速率和呼吸速率

從圖3的比較中可以看出, 對(duì)照組藻體的光合放氧速率、呼吸速率和P/R值沒有明顯變化, 而不同DMP濃度處理下卻呈現(xiàn)差異性。低濃度DMP組藻體培養(yǎng)3d后的光合放氧速率和P/R都顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 而呼吸速率與對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05)。中、高濃度 DMP處理下藻體的光合放氧速率明顯下降, 在培養(yǎng)15d后, 較對(duì)照組分別下降了69%和 92.8%, 而呼吸速率在培養(yǎng) 3d時(shí)無顯著變化,隨后逐漸下降,P/R值在培養(yǎng)期間持續(xù)下降, 且DMP濃度越高, 降幅越大, 至15d時(shí)較對(duì)照組分別下降了66.2%和92.1%。

圖2 DMP對(duì)鼠尾藻葉綠素a含量的影響Fig. 2 The effects of DMP on chlorophyll a content of S.thunbergii

2.4 rbcL基因相對(duì)表達(dá)量的變化

如圖 4所示, 對(duì)照組rbcL基因的表達(dá)量無顯著變化, 低濃度DMP組rbcL基因的表達(dá)量卻隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸升高, 15d時(shí)升至對(duì)照組的1.6倍; 與此同時(shí),中、高濃度DMP組rbcL基因的表達(dá)量均顯著下降,15d時(shí)僅為對(duì)照的38.4%和17.4%。

3 討論

3.1 不同DMP濃度對(duì)鼠尾藻生長(zhǎng)的影響

本研究結(jié)果表明, 有機(jī)污染物 DMP對(duì)鼠尾藻生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為濃度和作用時(shí)間的相關(guān)性。低濃度DMP(0.lmg/L)下鼠尾藻生長(zhǎng)情況良好, 生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸變大, 表明低濃度的 DMP對(duì)鼠尾藻不但沒有毒害作用, 反而有促進(jìn)作用。而高濃度的 DMP(≥0.3mg/L)則明顯抑制鼠尾藻的生長(zhǎng), 且隨著 DMP濃度的升高和暴露時(shí)間的推移, 藻體的新陳代謝受到抑制, 藻細(xì)胞開始衰退甚至死亡, 藻體表現(xiàn)出發(fā)黃、發(fā)白、脫落等表觀性狀。余江等(2007)在龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)對(duì)DMP毒性響應(yīng)的研究中也發(fā)現(xiàn), 低濃度的 DMP(0.lmg/L)對(duì)龍須菜有促進(jìn)作用, 而DMP濃度超過0.3mg/L時(shí)表現(xiàn)明顯的抑制作用。此外, 在其他一些種類的有機(jī)污染物對(duì)藻類毒性的研究中, 也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象(李鈞等, 2000;李欽等, 2004), 因此這可能是普遍存在的一種毒理學(xué)現(xiàn)象。

目前, 有機(jī)污染物對(duì)藻類產(chǎn)生毒性的機(jī)理還沒有統(tǒng)一的定論。關(guān)于較低濃度污染物對(duì)藻類產(chǎn)生促進(jìn)作用的原因, 學(xué)者們普遍認(rèn)可的一種解釋是生物具有一種“毒物的興奮效應(yīng)”(Hormesis), 是其自我保護(hù)的一種機(jī)制(Stebbing, 1982)。產(chǎn)生的機(jī)制可能是:(1)低濃度的有機(jī)污染物激活了藻細(xì)胞內(nèi)一些相關(guān)酶的活性, 因而促進(jìn)了藻類的代謝; (2)有機(jī)物對(duì)藻類的毒害和藻類降解有機(jī)污染物兩個(gè)過程同時(shí)存在,在濃度較低時(shí)降解過程占主導(dǎo)地位, 因而在整體上表現(xiàn)為降解(Chiet al, 2004; 遲杰等,2005; Gaoet al,2015), 降解產(chǎn)物可作為促進(jìn)藻類生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)源; (3)低濃度的有機(jī)污染物可以引起藻細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度在一定范圍的升高, 而此時(shí)脂質(zhì)過氧化程度的升高并不引發(fā)對(duì)細(xì)胞的傷害, 反而具有刺激藻細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的作用(謝榮等, 2000)。而高濃度有機(jī)污染物對(duì)藻類一般都有抑制作用, 本研究也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。

圖3 DMP處理下鼠尾藻藻體的光合放氧速率(a)、呼吸速率(b)和P/R (c)的比較Fig. 3 The effects of DMP on the oxygen exchange parameters of S. thunbergii

圖4 DMP處理下rbcL基因在轉(zhuǎn)錄水平上相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 4 The effects of DMP on the relative expression of rbcL gene at the transcriptional level of S. thunbergii

3.2 不同DMP濃度對(duì)鼠尾藻光合作用的影響

高濃度有機(jī)污染物對(duì)藻類的毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)為抑制光合作用、呼吸作用和固氮作用, 降低酶的活性, 從而影響藻類的活性代謝和生理進(jìn)程(李鈞等,2000; Yuet al, 2007; Liuet al, 2016)。葉綠素a是植物最重要的光合色素, 因此光合作用的強(qiáng)弱與植物體中葉綠素a的含量息息相關(guān)。李欽等(2004)對(duì)壇紫菜(Porphyra haitannensis)的研究表明0.lmg/L的甲胺磷可使葉綠素a的含量上升; 余江等(2007)對(duì)龍須菜的研究結(jié)果也表明0.1mg/L DMP作用下葉綠素a含量逐漸上升, 而高濃度的DMP則引起葉綠素a含量的降低。本文的研究結(jié)果也充分證實(shí)了這一點(diǎn), 鼠尾藻暴露在DMP中葉綠素a含量變化表現(xiàn)為低濃度略升高而高濃度顯著下降的趨勢(shì)。在一定濃度DMP脅迫下, 葉綠素a含量的上升可能與低濃度DMP脅迫并未對(duì)藻的生長(zhǎng)造成影響, 反而促進(jìn)其生長(zhǎng)有一定關(guān)系。而高濃度DMP作用下, 葉綠素a含量下降的原因可能是: (1)葉綠素a的合成受到抑制, Alberte等(1977)研究發(fā)現(xiàn), 逆境脅迫下葉綠素a含量降低的主要原因是葉綠體片層中捕光 chla/b-Pro復(fù)合體合成受到抑制; (2)已有的葉綠素a降解, 原因可能是DMP脅迫使一些葉綠素酶的活性增強(qiáng), 因此促進(jìn)了葉綠素a的分解或者DMP脅迫導(dǎo)致藻細(xì)胞中活性氧和自由基的催化合成, 進(jìn)一步引起葉綠素a的降解。

從氧電極的檢測(cè)結(jié)果來看(圖3), 低濃度DMP處理下藻體的光合放氧速率高于對(duì)照組(P<0.05), 而呼吸速率與對(duì)照組間差異不顯著, 中、高濃度 DMP處理下藻體的光合放氧速率迅速下降, 而呼吸速率在處理 3d才出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這表明在藻細(xì)胞內(nèi), 葉綠體可能比線粒體更易受到 DMP的毒害, 但這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。凈光合放氧速率與凈呼吸耗氧速率的比值 P/R是衡量細(xì)胞代謝水平的有效參數(shù)(Humphrey, 1975), 它受眾多因素影響, 如細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)(Ryther, 1955)、營(yíng)養(yǎng)環(huán)境(McAllister et al, 1964)等, 在正常藻體中這一比值約為4 (Melis et al, 2006)。本實(shí)驗(yàn)中正常藻體的 P/R比為 4.3, 低濃度 DMP下P/R值約為4.4, 呈現(xiàn)出正常的光合能力, 且光合活性略微增強(qiáng)。而中、高濃度DMP處理5d后, P/R值分別降為3.4和2.1, 已顯著低于正常值, 至15d時(shí), P/R值只有約1.5和0.3(圖3), 表明此時(shí)藻體的光合作用已受到極大的破壞。

3.3 不同DMP濃度對(duì)鼠尾藻光合基因rbcL表達(dá)的影響

核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase, Rubisco)是植物體內(nèi)重要的功能蛋白和儲(chǔ)能蛋白, 是光合碳同化過程的關(guān)鍵限速酶, 對(duì)光合作用的研究有重要意義, 其亞基的編碼基因 rbcL的表達(dá)受植物生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)和生長(zhǎng)環(huán)境的影響。許建方(2013)研究了滸苔(Ulva prolifera)的 rbcL基因在干出、不同鹽度、不同光照強(qiáng)度和不同溫度條件下的表達(dá)模式, 結(jié)果表明 rbcL基因在干出過程中的表達(dá)量逐漸降低, 而在鹽度稍高(45‰)或稍低(15‰)、強(qiáng)光和黑暗、高溫和低溫等脅迫處理時(shí)表達(dá)量都會(huì)升高, 但超過一定范圍時(shí), 表達(dá)量都會(huì)有所降低。Shao等(2014)對(duì)海帶(Saccharina japonica)的研究發(fā)現(xiàn) rbcL基因的表達(dá)是一種快遞光響應(yīng)模式, 光照下表達(dá)量上升, 而黑暗條件下表達(dá)量下降, 呈現(xiàn)晝夜變化的規(guī)律。對(duì)于大型海藻在溫度、鹽度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境脅迫下光合作用的分子變化機(jī)制的研究不僅局限于此, 但是有關(guān)大型海藻對(duì)有機(jī)物脅迫的研究卻多在生理水平上, 在分子水平的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)用熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)了鼠尾藻在不同濃度DMP作用下rbcL基因相對(duì)表達(dá)量的變化。從本研究的結(jié)果(圖 4)看, 低濃度的 DMP(0.lmg/L)可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo) rbcL基因的表達(dá), 長(zhǎng)時(shí)間暴露和高濃度DMP則抑制rbcL基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明,DMP作用下, rbcL基因表達(dá)量與光合作用變化規(guī)律一致, 因此我們推測(cè) DMP對(duì)鼠尾藻光合作用產(chǎn)生影響的作用機(jī)制之一可能是影響 rbcL基因的表達(dá)量,從而對(duì)細(xì)胞中Rubisco酶的合成量產(chǎn)生影響, 使藻的光合作用發(fā)生變化。

以上結(jié)果可以看出, 有機(jī)物脅迫與溫度、鹽度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境因子一樣均可導(dǎo)致 rbcL基因表達(dá)的變化, rbcL基因的表達(dá)量與藻的生長(zhǎng)狀況有一定的相關(guān)性, 因此, rbcL基因可以作為診斷大型海藻生長(zhǎng)狀況的潛在分子指標(biāo), 通過 rbcL基因的表達(dá)量來評(píng)估大型海藻應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)特征, 這將為評(píng)價(jià)海洋經(jīng)濟(jì)藻類養(yǎng)殖環(huán)境的影響提供一種新的思路。

4 結(jié)論

水體有機(jī)物污染和藻類生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的相關(guān)性, 即低濃度的 DMP能促進(jìn)鼠尾藻的生長(zhǎng)和葉綠素a的合成, 并使藻體的光合作用增強(qiáng), 誘導(dǎo)rbcL基因的表達(dá), 而高濃度的 DMP則抑制鼠尾藻的生長(zhǎng)、光合作用和 rbcL基因的表達(dá)。藻類對(duì)有機(jī)物脅迫的響應(yīng)是多層次的, 既有生理生化方面的, 也有基因轉(zhuǎn)錄方面的, 并且這種調(diào)控在不同的藻類中可能不同。因此我們下一步將對(duì)大量藻種開展廣泛研究, 用多項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)環(huán)境脅迫對(duì)藻類的潛在影響, 從而更有效地對(duì)水環(huán)境污染做出早期預(yù)警, 對(duì)藻類個(gè)體、種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)造成的環(huán)境脅迫做出更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。

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