基于形態(tài)學(xué)與核糖體DNA及其cDNA高通量測序的海洋沉積物中纖毛蟲多樣性比較*

黃平平 趙 峰 徐奎棟①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生物分類與系統(tǒng)演化實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

底棲纖毛蟲作為底棲微食物網(wǎng)中的重要成員能夠促進(jìn)初級生產(chǎn)力向更高營養(yǎng)級轉(zhuǎn)換, 從而促進(jìn)底棲生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(徐奎棟, 2011)。過去對海洋底棲纖毛蟲多樣性的認(rèn)識主要基于活體觀察或固定染色的形態(tài)學(xué)研究方法。例如 Hausmann等(2002)通過半定量培養(yǎng)的方法, 對地中海東部海域底棲原生動物進(jìn)行研究, 共發(fā)現(xiàn)35種纖毛蟲。在黃海,Meng等(2012)通過密度梯度離心-定量蛋白銀染色法(Ludox-QPS)對夏季的48個(gè)站位進(jìn)行了分析, 共鑒定198種底棲纖毛蟲; 代仁海(2012)以相同方法在春季黃海的11個(gè)站位獲得96種底棲纖毛蟲。然而, 形態(tài)學(xué)研究手段自身存在的問題和不足限制了對底棲纖毛蟲多樣性更為深入的認(rèn)識, 如耗時(shí)費(fèi)力, 需要良好的分類學(xué)基礎(chǔ), 大多數(shù)類群個(gè)體數(shù)量少、個(gè)體微小且難以培養(yǎng)而易被忽視, 未有針對包囊的分類學(xué)依據(jù),固定液的效能會導(dǎo)致不同程度的低估等(Karayanni et al, 2004; 陳旭淼等, 2014)。

與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)研究方法相比, 基于基因測序的分子生物學(xué)研究手段突破了對纖毛蟲個(gè)體數(shù)量及培養(yǎng)的限制, 理論上只要有遺傳物質(zhì)存在即可被檢測到。目前高通量測序技術(shù)的發(fā)展極大地?cái)U(kuò)展了對海洋底棲纖毛蟲多樣性的認(rèn)識。Gong等(2015)通過 18S rRNA基因焦磷酸測序?qū)S海底棲真核微生物的研究中發(fā)現(xiàn), 就序列數(shù)和可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)數(shù)所占比例而言, 甲藻和纖毛蟲均為優(yōu)勢類群。Pawlowski等(2011)以相同方法, 在不足4g的沉積物中檢獲630余個(gè)纖毛蟲OTUs。然而,通過形態(tài)學(xué)手段卻無法獲得如此眾多的物種。PCR和測序等過程均可能導(dǎo)致對多樣性的高估, 但目前對其高估程度還難以準(zhǔn)確定量(Kunin et al, 2010)。此外,不同的數(shù)據(jù)處理軟件、參數(shù)的選擇等均可導(dǎo)致OTUs數(shù)的改變, 進(jìn)而影響分子多樣性的評價(jià)(Santoferrara et al, 2014)。由此, 通過分子手段檢獲的這種高多樣性是真實(shí)存在, 還是由于分子技術(shù)和數(shù)據(jù)處理等問題造成的假象, 依然不得而知。

鑒于形態(tài)學(xué)研究手段以及分子生物學(xué)技術(shù)在揭示纖毛蟲多樣性方面均存在一定的問題與不足, 結(jié)合多個(gè)方法進(jìn)行比較研究, 探討不同技術(shù)手段獲得結(jié)果的異同, 顯得尤為重要。研究者們曾以易于鑒定的浮游丁丁蟲類(Tintinnid)纖毛蟲為研究對象, 比較分析形態(tài)觀察和 DNA測序兩種方法獲得的多樣性,發(fā)現(xiàn)分子手段檢獲的多樣性較形態(tài)學(xué)方法高一到兩個(gè)數(shù)量級(Bachy et al, 2013; Santoferrara et al, 2014)。然而上述研究僅涉及單一的浮游類群。

迄今, 尚沒有工作涉及沉積物中纖毛蟲的方法學(xué)比較。沉積物環(huán)境不僅包括底棲纖毛蟲活動蟲體的遺傳信息, 還包含浮游為主的寡毛亞綱和舞毛亞綱纖毛蟲(Grattepanche et al, 2014)裂解釋放的DNA以及它們的包囊等遺傳物質(zhì)(Doherty et al, 2010; Torti et al, 2015)。Reid 等(1978)和 Rubino 等(2000)研究了沉積物中浮游類群的包囊, 發(fā)現(xiàn)了浮游丁丁蟲類纖毛蟲包囊的存在。Kim等(2008)對日本女川灣及韓國馬山灣沉積物中浮游類纖毛蟲(具頭急游蟲)包囊的形態(tài)及其原位沉降的研究中發(fā)現(xiàn), 在一定條件下, 浮游類纖毛蟲的包囊會以較大速率沉降。因此, 基于 DNA測序檢獲的沉積物中的纖毛蟲多樣性, 可能既包括活動蟲體, 同時(shí)也包括胞外 DNA和以包囊形式存在的纖毛蟲。與DNA相比, RNA降解速率較快(Novitsky,1986), 因此通過 cDNA測序, 理論上可獲取纖毛蟲活動蟲體的多樣性。

本文以海洋沉積物中的纖毛蟲為研究對象, 通過 Ludox-QPS制片, 顯微觀察獲取活動蟲體的多樣性構(gòu)成(Xu et al, 2010), 同時(shí)提取沉積物中總DNA/RNA, 測序獲得纖毛蟲分子多樣性構(gòu)成信息,對上述三種方法獲得的結(jié)果進(jìn)行比較分析, 探討基于形態(tài)學(xué)與核糖體18S DNA及其cDNA高通量測序手段檢獲的海洋沉積物中纖毛蟲多樣性的異同, 為后續(xù)分子多樣性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查站位與樣品采集

本研究于2015年8月17日搭乘“東方紅2號”科學(xué)考察船在南黃海(36°0′3.6″N, 121°20′27.6″E)進(jìn)行樣品采集, 水深 34.91m, 底層水溫度 12.87°C, 底層水鹽度31.52。

利用0.1m2改進(jìn)型Gray-Ohara箱式采泥器采集2箱未受擾動的沉積物樣品: (1) 使用注射器改造的采樣管(內(nèi)徑2.3cm)采集0—2cm芯樣分別進(jìn)行瓶裝, 加入等體積預(yù)冷 4%戊二醛進(jìn)行固定, 置于 4°C冷藏保存; (2) 同時(shí)刮取0—2cm表層沉積物約20g放入封口袋中, 快速置于-20°C冰箱中冷凍保存。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

采用Ludox-QPS法分析纖毛蟲的物種多樣性(Xu et al, 2010), 共兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)(兩箱泥), 各一個(gè)技術(shù)重復(fù)。主要步驟為: 采集的2個(gè)固定的沉積物樣品首先進(jìn)行降鹽濃縮, 每一重復(fù)取9mL(經(jīng)驗(yàn)值為3mL,但為確保多樣性數(shù)據(jù)準(zhǔn)確, 采用 9mL使每張片子上的纖毛蟲數(shù)均達(dá)到200以上)樣品加入Ludox HS 40密度梯度離心, 取生物層過濾到孔徑 5μm 的硝酸纖維素膜上, 定量蛋白銀染色制片(QPS), 最終兩張片子(兩箱泥)在 200-1000×(Leica DM 4500B)放大倍數(shù)下全片鏡檢觀察。依據(jù) Carey(1992), Lynn等(2002),Lynn(2008), 宋微波等(2009)及相關(guān)的文獻(xiàn)資料, 大多數(shù)纖毛蟲鑒定到屬, 部分鑒定到種。纖毛蟲的絕對豐度以每立方厘米的纖毛蟲蟲數(shù)表示(cell/cm3), 相對豐度以每類群絕對豐度占總豐度的百分比表示。

1.3 DNA和RNA提取及PCR擴(kuò)增

DNA提取和RNA反轉(zhuǎn)錄均采用兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)(兩箱泥)、各3個(gè)技術(shù)重復(fù)。其中沉積物DNA提取采用PowerSoil DNA Isolation kit (Mo-Bio, USA), 6個(gè)樣品(兩箱泥, 每箱3個(gè)重復(fù)), 各取0.3g用于DNA提取; RNA提取采用 RNA PowerSoil Total RNA Isolation kit (Mo-Bio, USA), 2個(gè)樣品(兩箱泥, 每箱1個(gè)), 各取2g用于RNA提取。每箱泥提取的總RNA取 3個(gè)分樣, 通過 PrimerScript Ⅱ1st strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 提取的DNA以及反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA通過巢式PCR對纖毛蟲18S rRNA基因V4區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增(Stock et al, 2013), 擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)(Lara et al, 2007; Stoeck et al, 2010): 纖毛蟲特異性引物Cil F、Cil R1、Cil R2、Cil R3; 真核V4高變區(qū)通用引物EukF、EukR(表1)。

表1 纖毛蟲巢式PCR特異性引物及堿基序列表Tab.1 Oligonucleotide sequences and ciliate-specific primers used for the ciliate nested-PCR

第一輪PCR: 采用纖毛蟲特異性引物, 擴(kuò)增長度600余bp, 反應(yīng)體系如下: 正反向引物各0.5μL, 模板1.5μL, 2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix 12.5μL, 最后加雙蒸水補(bǔ)齊 25μL。反應(yīng)流程: 95°C 預(yù)變性 5min; 然后 94°C變性 45s, 58°C退火 1min, 72°C延伸1min, 共35個(gè)循環(huán); 最后72°C延伸10min終止于 12°C(Laraet al, 2007)。

第二輪 PCR: 以第一輪 PCR產(chǎn)物為模板, 采用真核特異性引物對 V4高變區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增, 擴(kuò)增長度約 400bp, 反應(yīng)體系如下: 正反向引物各 1μL,模板 1.5μL, 2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix 23.5μL, 最后加雙蒸水補(bǔ)齊 50μL。反應(yīng)流程: 95°C 預(yù)變性 5min; 然后 94°C 變性 30s, 57°C 退火 45s, 72°C延伸1min, 共10個(gè)循環(huán); 94°C變性30s, 49°C退火45s,72°C延伸1min, 共25個(gè)循環(huán); 最后72°C延伸2min終止于 12°C(Stoecket al, 2010)。

1.4 測序及序列數(shù)據(jù)分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物質(zhì)量, 若符合要求, 則將來自同一箱泥的3個(gè)重復(fù)的核糖體18S DNA及其 cDNA的 PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行合并, 最終核糖體18S DNA及其cDNA的PCR產(chǎn)物各兩組(兩箱泥), 進(jìn)行Illumina Miseq測序(下簡稱DNA測序和cDNA測序)。

樣品送測北京諾禾致源生物信息科技有限公司,使用New England Biolabs公司的NEB Next UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測,合格后, 使用Illumina MiSeq進(jìn)行上機(jī)測序。

根據(jù) Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出樣品數(shù)據(jù), 截去 Barcode和引物序列,使用FLASH(V1.2.7)對樣品reads(DNA測序兩重復(fù)共209055 reads, cDNA測序兩重復(fù)共90706 reads)進(jìn)行拼接, 得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)即Raw Tags(Mago?et al, 2011)。采用 QIIME(V1.7.0)對序列進(jìn)行過濾處理: a) Tags截取: 將Raw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤19)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)? b) Tags長度過濾: Tags經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集, 進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags(Caporasoet al, 2010)。經(jīng)以上處理得到的Tags序列通過 UCHIME與數(shù)據(jù)庫(Gold Database)進(jìn)行比對, 檢測及去除嵌合體序列, 得到最終的有效數(shù)據(jù)即Effective Tags (Edgaret al, 2011; Haaset al, 2011)。

采用UPARSE(Edgar, 2013)對以上所得Effective Tags進(jìn)一步處理。流程如下: 去重復(fù), 統(tǒng)計(jì)每條序列豐度; 去除單一重復(fù)的序列; 以 97%水平進(jìn)行 OTU聚類, 即97%的序列相似度視作同種。對獲得的OTU代表序列與美國國家生物技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫采用基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)進(jìn)行比對, 獲得相應(yīng)序列的分類信息。其中纖毛蟲的相對豐度以每個(gè)類群的序列數(shù)占總序列數(shù)的比例表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用 Venny2.1繪制餅圖, 使用 Excel繪制條形圖。使用PRIMER軟件包中的CLUSTER分析三種方法在揭示纖毛蟲多樣性及相對豐度方面的一致性;相似性百分比(Similarity Percentages, SIMPER)分析找出對聚類分組起主要作用的科, 分析之前原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og(x+1)轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察、DNA及其cDNA測序所獲纖毛蟲多樣性構(gòu)成

三種分析方法中, 形態(tài)學(xué)方法檢獲的纖毛蟲多樣性最低, 包含8綱、20目、30科、36屬、97種, 其中核殘跡綱的部分類群、膜口亞綱的全部、旋唇綱和籃口綱的少數(shù)個(gè)體僅能鑒定到目級水平。以97%的相似性視為一個(gè)OTU, 則DNA測序檢獲的多樣性次之,包含10綱、28目、55科、76屬、174個(gè)OTUs。cDNA測序檢獲的多樣性最高包含10綱、31目、68科、99屬、284個(gè)OTUs。三種方法同時(shí)檢獲的有8綱、16目、20科、17屬, 分別占形態(tài)學(xué)方法檢獲總數(shù)的100%、80%、67%、47%。而同時(shí)被兩種分子手段檢獲的個(gè)數(shù)依次為10綱、28目、51科、72屬, 在綱和目級水平上完全一致, 而在科屬水平上分別占 DNA測序方法檢獲總數(shù)的93%和95%(圖1)。

在屬級階元上, 三種方法同時(shí)檢獲的有 17屬,包含形態(tài)鑒定獲得的 30種纖毛蟲, 占鑒定的纖毛蟲總物種數(shù)的31%(圖2)。該17屬中, DNA及其cDNA測序分析獲得的分別有32個(gè)和50個(gè)OTUs, 均占各自檢獲的總OTUs數(shù)的18%(圖2)。此外, 另有17個(gè)屬僅通過形態(tài)學(xué)鑒定獲得, 而 84個(gè)屬僅通過分子手段檢獲, 顯示DNA及其cDNA測序方法獲得了更多的屬(圖 1)。

對僅通過形態(tài)鑒定獲得的17屬的相關(guān)序列分析發(fā)現(xiàn), 其中的 7個(gè)屬包括豐富度較高的裸口蟲屬(Holophrya)和中圓蟲屬(Metacystis)在NCBI中均無相關(guān)序列。對僅通過分子檢獲的 84個(gè)屬重新 BLAST比對發(fā)現(xiàn), 在序列之間相似性十分近似甚至在同等相似下, 同一 OTU可以與多個(gè)屬包括 5個(gè)僅通過形態(tài)學(xué)檢測的屬匹配。另外的5個(gè)形態(tài)檢測到的屬未能通過分子手段獲得, 可能是個(gè)體數(shù)量少所致。其中,個(gè)體數(shù)量最少的蓋雷蟲屬(Geleia)、雙眉蟲屬(Diophrys)和腹毛蟲屬(Hypotrichidium)數(shù)量僅占纖毛蟲總數(shù)的 0.24%, 而圓纖蟲屬(Strongylidium)個(gè)體數(shù)量僅占總數(shù)的 0.48%, 擬斜管蟲屬(Chilodontopsis)數(shù)量高一些, 占2.88%。

圖1 形態(tài)學(xué)(Mor)、DNA及其cDNA測序三種方法在綱、目、科、屬水平上檢獲的共有/特有的分類階元數(shù)Fig.1 The number of shared and unique taxa at the levels of class/order/family/genus detected by morphological (Mor) and DNA and cDNA high-throughput methods

圖2 形態(tài)學(xué)(Mor)、DNA及其cDNA測序三種方法檢獲的共有屬的物種數(shù)/OTU數(shù)Fig.2 The number of morphospecies/OTUs at the level of genus simultaneously detected by morphological (Mor) and DNA and cDNA high-throughput methods

相對纖毛蟲屬級階元, 科級階元在NCBI數(shù)據(jù)庫中更為完備。對三種方法檢獲的科級階元的物種數(shù)/OTU數(shù)的聚類分析結(jié)果顯示, 形態(tài)學(xué)的兩個(gè)重復(fù)聚為一支(GroupⅠ), cDNA測序的兩個(gè)重復(fù)聚為一支(Group Ⅲ),然后與 DNA 測序的兩個(gè)重復(fù)(Group Ⅱ)聚在一起(圖3a)。SIMPER分析表明, GroupⅠ與GroupⅡ的平均非相似性為 67%, GroupⅠ與 Group Ⅲ的平均非相似性為68%, Group Ⅱ與 Group Ⅲ的平均非相似性為 33%, 顯示兩種分子手段的結(jié)果更為近似。對形態(tài)學(xué)方法及DNA測序方法非相似性貢獻(xiàn)率最高的科為中圓蟲科,該科僅通過形態(tài)學(xué)方法檢獲, 主要貢獻(xiàn)的屬為中圓蟲屬(NCBI中無序列)豐富度位居第二; 僅通過DNA測序方法檢獲的浮游類群的累積貢獻(xiàn)率高達(dá) 19%, 涉及 32個(gè)OTUs(表2)。對形態(tài)學(xué)方法及cDNA測序方法非相似性貢獻(xiàn)率最高的科為刀口蟲科, 其次為中圓蟲科; 僅通過 cDNA測序方法檢獲的浮游類群的累積貢獻(xiàn)率為12%, 寄生生活的無口類和后口類及厭氧生的斜毛類累積貢獻(xiàn)率為12%, 共涉及65個(gè)OTUs(表3)。

圖3 形態(tài)學(xué)(Mor)、DNA及其cDNA測序三種方法檢獲的基于科級水平的物種數(shù)/OTUs (a)及其相對豐度(b)的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of the number of morphospecies/OTUs (a) at the level of family as well as their relative abundance (b) detected by morphological (Mor) and DNA and cDNA high-throughput methods

表2 基于科級水平豐富度聚類獲得的形態(tài)組(GroupⅠ)和DNA測序組(GroupⅡ)的非相似性貢獻(xiàn)(粗體示浮游類群)Tab.2 Dissimilarity contribution of the ciliate species richness at the level of family between Groups Ⅰ and Ⅱ (pelagic ciliates are indicated in boldface)

表3 基于科級水平豐富度聚類獲得的形態(tài)組(GroupⅠ)和cDNA測序組(Group Ⅲ)的非相似性貢獻(xiàn)(粗體示浮游類群)Tab.3 Dissimilarity contribution of the ciliate species richness at the level of family between Groups I and III (pelagic ciliates are indicated in boldface)

2.2 形態(tài)觀察、DNA及其cDNA測序所獲纖毛蟲豐度構(gòu)成

對科級階元的優(yōu)勢類群分析表明, 形態(tài)學(xué)方法檢獲豐度最高的科為裸口蟲科, 其中裸口蟲屬(Holophrya)貢獻(xiàn)總豐度的38%; 中圓蟲科居次, 其中圓蟲屬(Metacystis)貢獻(xiàn)總豐度的13%。兩屬分別隸屬前口綱的前管目和前口目, 均為黃海底棲生優(yōu)勢類群。形態(tài)學(xué)方法檢獲的均為底棲生類群。

DNA測序檢獲的相對豐度最高的科為鉤刺亞綱(Haptoria)的櫛毛蟲科, 其中櫛毛蟲屬(Cyclotrichium)為典型的浮游類群, 貢獻(xiàn)了相對豐度的45%; 隸屬于寡毛亞綱(Oligotrichia)的急游蟲科、舞毛亞綱(Choreotrichia)的鈴殼蟲科和擬盜蟲科亦屬浮游纖毛蟲, 共貢獻(xiàn)了相對豐度的42%。值得注意的是, DNA檢測的浮游纖毛蟲占了纖毛蟲總相對豐度的90%。

cDNA測序方法檢獲的相對豐度最高的科與形態(tài)學(xué)方法相同為裸口蟲科, 其中的隱核蟲屬(Cryptocaryon)為寄生類纖毛蟲, 貢獻(xiàn)了相對豐度的22%。這可能是由于NCBI并不存在裸口蟲屬的序列,通過序列比對只能比對到較為相似的隱核蟲屬。隸屬于鉤刺亞綱的旋前管蟲科相對豐度居次, 其中的伸頸蟲屬(Trachelotractus)貢獻(xiàn)了相對豐度的 19%。cDNA方法檢獲的浮游類纖毛蟲相對豐度為 7%。但就優(yōu)勢類群而言, cDNA方法與形態(tài)學(xué)方法更為相似,均為底棲生纖毛蟲。

對形態(tài)觀察、DNA及其cDNA測序三種方法所獲科級纖毛蟲相對豐度的聚類分析結(jié)果顯示, 形態(tài)學(xué)檢測的兩個(gè)重復(fù)聚為一支(GroupⅠ), 然后與cDNA 測序的兩個(gè)重復(fù)(GroupⅢ)聚在一起, DNA 測序的兩個(gè)重復(fù)聚為另一支(GroupⅡ) (圖3b)。SIMPER分析表明, GroupⅠ與GroupⅡ的平均非相似性為96%,GroupⅡ與GroupⅢ的平均非相似性為85%, GroupⅠ與GroupⅢ的平均非相似性為67%, 顯示形態(tài)學(xué)方法與cDNA測序方法的結(jié)果更為近似。對形態(tài)學(xué)方法及DNA方法非相似性貢獻(xiàn)的主要為浮游類纖毛蟲, 僅通過 DNA方法檢獲, 累積貢獻(xiàn)率為 48%, 涉及相對豐度的 90%; 裸口蟲科和中圓蟲科的累積貢獻(xiàn)率為25%, 形態(tài)學(xué)方法檢獲了相對豐度的 51%, 而 DNA方法僅檢獲了2%(表4)。對DNA及其cDNA方法非相似性貢獻(xiàn)的主要類群同樣是浮游纖毛蟲, 其累積貢獻(xiàn)率為45%(表5)。對形態(tài)學(xué)方法及cDNA方法非相似性貢獻(xiàn)的類群除急游蟲科外, 均為底棲類群。造成差異的主要原因在于部分類群如中圓蟲科(中圓蟲屬NCBI無序列)僅通過形態(tài)學(xué)方法檢獲, 貢獻(xiàn)率為10%;其他類群如旋前管蟲科、管葉蟲科和刀口蟲科僅通過cDNA方法檢獲, 累積貢獻(xiàn)率為20%(表6)。

表4 基于科級水平相對豐度聚類獲得的形態(tài)組(GroupⅠ)和DNA測序組(GroupⅡ)的非相似性貢獻(xiàn)(粗體示浮游類群)Tab.4 Dissimilarity contribution of the ciliates species relate abundance at the level of family between Groups Ⅰ and Ⅱ (pelagic ciliates are indicated in boldface)

表5 基于科級水平相對豐度聚類獲得的DNA(GroupⅡ)及其cDNA測序組(Group Ⅲ)的非相似性貢獻(xiàn)(粗體示浮游類群)Tab.5 Dissimilarity contribution of the ciliates species relate abundance at the level of family between GroupsⅡ and Ⅲ (pelagic ciliates are indicated in boldface)

表6 基于科級水平的相對豐度聚類獲得的形態(tài)檢測組(Group Ⅰ)和cDNA測序組(Group Ⅲ)的非相似性貢獻(xiàn)(粗體示浮游類群)Tab.6 Dissimilarity contribution of the ciliates species relate abundance at the level of family between Groups Ⅰ and Ⅲ (pelagic ciliates are indicated in boldface)

3 討論

3.1 形態(tài)觀察、DNA及其cDNA測序?qū)Ｑ蟮讞w毛蟲多樣性的評估效能

相較于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法, 高通量測序技術(shù)揭示了更高的真核生物多樣性。Santoferrara等(2014)結(jié)合形態(tài)觀察和焦磷酸測序評估浮游纖毛蟲的多樣性發(fā)現(xiàn), 通過測序獲得的多樣性較形態(tài)學(xué)方法高一個(gè)數(shù)量級。但分子揭示的高多樣性是真實(shí)存在, 還是一種假象, 或者是其他因素造成的, 成為一個(gè)廣泛關(guān)注的問題。

本研究首次結(jié)合形態(tài)觀察、DNA及其cDNA測序三種方法, 比較評估了黃海沉積物中纖毛蟲的多樣性。研究顯示, 兩種分子手段的結(jié)果更為相似, 形態(tài)學(xué)方法檢獲的物種多樣性分別為DNA和cDNA測序方法檢獲的OTU數(shù)的1/2和1/3。分析認(rèn)為, 這些差異的產(chǎn)生是由多種因素造成的。首先, 基于形態(tài)分類學(xué)的方法局限可導(dǎo)致物種多樣性的低估。本研究采用的Ludox-QPS法(密度梯度離心結(jié)合定量蛋白銀染色), 可在屬/種水平上揭示大部分底棲纖毛蟲的多樣性 (Xuet al, 2010)。然而, 由于纖毛蟲的固定及染色效能局限, 某些纖毛蟲如核殘跡綱的許多類群可能并未完整保存下來, 部分類群僅能鑒定到科甚至目級, 從而導(dǎo)致物種多樣性不同程度的低估。

在DNA測序檢獲的76個(gè)屬、174個(gè)OTUs中, 包含了浮游纖毛蟲的 15個(gè)屬、35個(gè) OTUs。然而, 這些浮游類群的活動蟲體在沉積物中是幾乎不存在的,在底棲纖毛蟲的形態(tài)學(xué)檢測中鮮少出現(xiàn)。因此, 將這些類群考慮在內(nèi), 無疑會高估底棲纖毛蟲的多樣性。導(dǎo)致沉積物中大量浮游纖毛蟲出現(xiàn)的原因在于, 沉積物不僅包括活動蟲體的DNA, 同時(shí)包括一些裂解、釋放的DNA及浮游類群的包囊DNA等(Torti et al,2015)。Dell'Anno等(2004)對亞得里亞海沿岸沉積物中胞外DNA降解速率的研究發(fā)現(xiàn), DNA的周轉(zhuǎn)時(shí)間由29到93天不等。因此, DNA方法檢獲的不僅有活動蟲體, 還包括埋藏在沉積物中的歷史DNA。

在cDNA測序檢獲的99個(gè)屬、284個(gè)OTUs中, 18個(gè)屬、37個(gè)OTUs為浮游類纖毛蟲。這一結(jié)果表明, 沉積物中依然存在浮游纖毛蟲的 RNA, 而通常認(rèn)為RNA在生物死亡后會很快降解。Novitsky等(1986)對海洋沉積物中死亡微型生物 RNA的研究發(fā)現(xiàn), 盡管RNA的降解速率遠(yuǎn)高于DNA的降解速率, 但14天后依然有30%—40%的RNA未降解。即使將浮游類群排除在外, cDNA方法相較DNA方法檢獲了更高的底棲纖毛蟲多樣性, 這可能主要是兩種分子方法采用的樣品量不同所致。樣品量是影響微型生物多樣性評價(jià)的重要因素; Penton等(2016)和Dolan等(2011)針對土壤和水體樣品研究發(fā)現(xiàn)檢獲的物種數(shù)隨樣品量增加而增多。cDNA方法所用的沉積物樣品量是DNA方法的2倍, 因此檢獲了更高的多樣性。然而,形態(tài)學(xué)方法所用的沉積物樣品量約為DNA測序樣品量的3倍, 是cDNA測序樣品量的1.5倍, 但所獲多樣性仍然較分子方法低, 這也間接表明分子手段較形態(tài)學(xué)方法而言在檢獲纖毛蟲多樣性上優(yōu)勢明顯,可更全面地揭示沉積物中的纖毛蟲多樣性。

此外, 與形態(tài)學(xué)方法相比, 分子手段在鑒定稀有類群方面優(yōu)勢明顯, 在僅通過分子手段檢獲的 84個(gè)屬中, 有64個(gè)屬相對豐度低于1%。在海洋沉積物中,大部分底棲纖毛蟲以較低的豐度存在, 因此通過形態(tài)學(xué)檢獲不易。本研究通過形態(tài)學(xué)分析的6g沉積物中, 很大一部分纖毛蟲僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)個(gè)體。

3.2 三種方法檢測的海洋底棲纖毛蟲豐度/相對豐度比較

本研究使用 Ludox-QPS方法檢測的結(jié)果表明,以裸口蟲科及中圓蟲科為主的前口綱纖毛蟲豐度最高, 占了總豐度的 53%。這與課題組先前的研究結(jié)果是一致的。Meng等(2012)對 2007年7月黃海 48個(gè)站位的底棲纖毛蟲研究發(fā)現(xiàn), 前口綱的豐度可達(dá)總豐度的 45%; 周百靈等(2016)和 Zhou等(2016)分別對2010年和2011年7月和11月黃海底棲纖毛蟲的研究發(fā)現(xiàn), 前口綱的豐度所占比例分別為 40%—45%。

相較于此, DNA高通量測序揭示了更多的浮游纖毛蟲類群, 其序列相對豐度竟達(dá) 90%。Zhao等(2016)在黃海陸架區(qū)沉積物中纖毛蟲 DNA高通量測序分析顯示, 浮游纖毛蟲的相對豐度更達(dá)95%?？梢?以沉積環(huán)境的總 DNA進(jìn)行纖毛蟲多樣性研究, 不僅可以反映活動蟲體的多樣性信息, 同時(shí)還可反映“歷史”群落以及包囊的多樣性信息。

cDNA高通量測序檢測的序列相對豐度結(jié)果與形態(tài)學(xué)方法類似, 底棲纖毛蟲序列相對豐度占比約93%。其中, 形態(tài)學(xué)檢測的個(gè)體豐度最高的裸口蟲科在內(nèi)的前口綱, 其序列相對豐度亦最高, 所占比例達(dá)35%。然而, 分子方法檢測的對裸口蟲科主要貢獻(xiàn)的屬是寄生的隱核蟲屬而非底棲生的裸口蟲屬, 推測由于NCBI中沒有裸口蟲屬相關(guān)序列, 因此只能比對到相似度較高的隱核蟲屬所致。

值得注意的是, 測序所得的序列相對豐度無法反映環(huán)境中相應(yīng)纖毛蟲確切的豐度信息。Gong等(2013)通過單細(xì)胞定量 PCR對寡毛類及緣毛類纖毛蟲核糖體 RNA基因拷貝數(shù)研究中發(fā)現(xiàn), 相較其它原生生物和真菌, 部分纖毛蟲的rDNA具有較高的拷貝數(shù), 且其數(shù)量無論是在種內(nèi)還是在種間均具有一定差異。因此, rDNA高通量測序所獲各類群的序列相對豐度與群落中實(shí)際的個(gè)體相對豐度并無一一對應(yīng)關(guān)系。盡管如此, 已有的研究還是通過序列的相對豐度來區(qū)分相對優(yōu)勢類群與稀有類群, 進(jìn)行大致的界定。新近的研究也將序列的相對豐度與形態(tài)學(xué)方法所獲的相對豐度做比較分析, 探索進(jìn)行相對優(yōu)勢類群的比較(Bachy et al, 2013; Santoferrara et al, 2014)。本研究以相同方法對DNA及其cDNA測序結(jié)果進(jìn)行了處理, 發(fā)現(xiàn) DNA測序獲得的浮游類纖毛蟲序列所占比例高達(dá) 90%, 而 cDNA測序?yàn)?7%, 且相對豐度最高的類群與形態(tài)學(xué)方法相同。因此, 分析認(rèn)為盡管纖毛蟲存在DNA拷貝數(shù)不同的問題, 但較之DNA高通量測序, cDNA高通量測序檢獲的底棲纖毛蟲在群落結(jié)構(gòu)上與形態(tài)學(xué)方法更為接近。

4 結(jié)論

對比分析了基于形態(tài)學(xué)、DNA及其cDNA高通量測序檢獲的黃海沉積物中的纖毛蟲多樣性, 發(fā)現(xiàn)三種方法均受到多種因素的影響, 導(dǎo)致評價(jià)結(jié)果差異明顯。分子手段有助于更全面地研究海洋沉積物中的纖毛蟲多樣性, 檢獲的多樣性基本涵蓋了形態(tài)學(xué)手段檢獲的所有底棲類群, 此外還包括了數(shù)量較多的浮游類群。相較DNA高通量測序, cDNA測序與形態(tài)學(xué)方法獲得的結(jié)果更為一致, 在研究活動蟲體多樣性方面更有優(yōu)勢, 而 DNA測序方法可同時(shí)揭示包囊及過去群落信息。

致謝 本課題組孟昭翠、陳旭淼、李菊博士在Ludox-QPS方法及分類鑒定中給予協(xié)助, 詹子鋒博士、維妙博士生協(xié)助采樣, 在此謹(jǐn)致謝忱。

代仁海, 2012. 黃東海底棲纖毛蟲多樣性及微型底棲生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn). 青島: 中國科學(xué)院海洋研究所博士學(xué)位論文,1—93

宋微波, 沃 倫 A, 胡曉鐘, 2009. 中國黃渤海的自由生纖毛蟲. 北京: 科學(xué)出版社, 1—515

陳旭淼, 徐奎棟, 2014. 深海原生動物多樣性研究進(jìn)展. 海洋科學(xué), 38(10): 119—126

周百靈, 維 妙, 李 菊等, 2016. 黃海底棲纖毛蟲的群落結(jié)構(gòu)與時(shí)空變化. 海洋與湖沼, 47(2): 336—345

徐奎棟, 2011. 海洋微型底棲生物的多樣性與地理分布. 生物多樣性, 19(6): 661—675

Bachy C, Dolan J R, López-García P et al, 2013. Accuracy of protist diversity assessments: morphology compared with cloning and direct pyrosequencing of 18S rRNA genes and ITS regions using the conspicuous tintinnid ciliates as a case study. The ISME Journal, 7(2): 244—255

Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J et al, 2010. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods, 7(5): 335—336

Carey P G, 1992. Marine Interstitial Ciliates: An Illustrated Key.London, New York, Tokyo, Melbourne, Madras: Chapman &Hall Identification Guide, 1—351

Dell'Anno A, Corinaldesi C, 2004. Degradation and turnover of extracellular DNA in marine sediments: ecological and methodological considerations. Applied and Environmental Microbiology, 70(7): 4384—4386

Doherty M, Tamura M, Vriezen J A C et al, 2010. Diversity of Oligotrichia and Choreotrichia ciliates in coastal marine sediments and in overlying plankton. Applied and Environmental Microbiology, 76(12): 3924—3935

Dolan J R, Stoeck T, 2011. Repeated sampling reveals differential variability in measures of species richness and community composition in planktonic protists. Environmental Microbiology Reports, 3(6): 661—666

Edgar R C, 2013. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods, 10(10): 996—998

Edgar R C, Haas B J, Clemente J C et al, 2011. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics,27(16): 2194—2200

Gong J, Dong J, Liu X H et al, 2013. Extremely high copy numbers and polymorphisms of the rDNA operon estimated from single cell analysis of oligotrich and peritrich ciliates. Protist, 164(3):369—379

Gong J, Shi F, Ma B et al, 2015. Depth shapes α- and β-diversities of microbial eukaryotes in surficial sediments of coastal ecosystems. Environmental Microbiology, 17(10): 3722—3737 Grattepanche J D, Santoferrara L F, Andrade J et al, 2014.Distribution and diversity of oligotrich and choreotrich ciliates assessed by morphology and DGGE in temperate coastal waters.Aquatic Microbial Ecology, 71(3): 211—221

Haas B J, Gevers D, Earl A M et al, 2011. Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons. Genome Research, 21(3):494—504

Hausmann K, Hülsmann N, Polianski I et al, 2002. Composition of benthic protozoan communities along a depth transect in the eastern Mediterranean Sea. Deep Sea Research Part I:Oceanographic Research Papers, 49(11): 1959—1970

Karayanni H, Christaki U, Van Wambeke F et al, 2004. Evaluation of double formalin—Lugol’s fixation in assessing number and biomass of ciliates: an example of estimations at mesoscale in NE Atlantic. Journal of Microbiological Methods, 56(3):349—358

Kim Y O, Ha S, Taniguchi A, 2008. Morphology and in situ sedimentation of the cysts of a planktonic oligotrich ciliate,Strombidium capitatum. Aquatic Microbial Ecology, 53(2):173—179

Kunin V, Engelbrektson A, Ochman H et al, 2010. Wrinkles in the rare biosphere: pyrosequencing errors can lead to artificial inflation of diversity estimates. Environmental Microbiology,12(1): 118—123

Lara E, Berney C, Harms H et al, 2007. Cultivation-independent analysis reveals a shift in ciliate 18S rRNA gene diversity in a polycyclic aromatic hydrocarbon-polluted soil. FEMS Microbiology Ecology, 62(3): 365—373

Lynn D H, 2008. The Ciliated Protozoa: Characterization,Classification, and Guide to the Literature. 3rd ed. Dordrecht,Netherlands: Springer

Lynn D H, Small E B, 2002. Phylum ciliophora. In: Lee J J,Leedale G F, Bradbury P C eds. An Illustrated Guide to the Protozoa. 2nd ed. Lawrence, Kansas, USA: Society of Protozoologists, Allen Press, 371—656

Mago? T, Salzberg S L, 2011. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics,27(21): 2957—2963

Meng Z C, Xu K D, Dai R H et al, 2012. Ciliate community structure, diversity and trophic role in offshore sediments from the Yellow Sea. European Journal of Protistology,48(1): 73—84

Novitsky J A, 1986. Degradation of dead microbial biomass in a marine sediment. Applied and Environmental Microbiology,52(3): 504—509

Pawlowski J, Christen R, Lecroq B et al, 2011. Eukaryotic richness in the abyss: insights from pyrotag sequencing.PLoS One, 6(4): e18169

Penton C R, Gupta V V S R, Yu J L et al, 2016. Size matters:assessing optimum soil sample size for fungal and bacterial community structure analyses using high throughput sequencing of rRNA gene amplicons. Frontiers in Microbiology, 7: 824

Reid P P C, John A W G, 1978. Tintinnid cysts. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 58(3):551—557

Rubino F, Belmonte G, Miglietta A M et al, 2000. Resting stages of plankton in recent North Adriatic sediments. Marine Ecology, 21(3—4): 263—284

Santoferrara L F, Grattepanche J D, Katz L A et al, 2014.Pyrosequencing for assessing diversity of eukaryotic microbes: analysis of data on marine planktonic ciliates and comparison with traditional methods. Environmental Microbiology, 16(9): 2752—2763

Stock A, Edgcomb V, Orsi W et al, 2013. Evidence for isolated evolution of deep-sea ciliate communities through geological separation and environmental selection. BMC Microbiology, 13: 150

Stoeck T, Bass D, Nebel M et al, 2010. Multiple marker parallel tag environmental DNA sequencing reveals a highly complex eukaryotic community in marine anoxic water.Molecular Ecology, 19(S1): 21—31

Torti A, Lever M A, J?rgensen B B, 2015. Origin, dynamics, and implications of extracellular DNA pools in marine sediments.Marine Genomics, 24: 185—196

Xu K D, Du Y F, Lei Y L et al, 2010. A practical method of Ludox density gradient centrifugation combined with protargol staining for extracting and estimating ciliates in marine sediments. European Journal of Protistology, 46(4):263—270

Zhao F, Xu K D, 2016. Molecular diversity and distribution pattern of ciliates in sediments from deep-sea hydrothermal vents in the Okinawa Trough and adjacent sea areas. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers, 116:22—32

Zhou B L, Xu K D, 2016. Spatiotemporal variation in community structure of marine benthic ciliates in the Yellow Sea during and after macroalgal and giant jellyfish blooms. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 34(4): 629—641