中藥制劑蘭州方對(duì)免疫介導(dǎo)的再生障礙性貧血模型小鼠骨髓增殖的影響

黃邦榮，張永萍，倪 紅，李治梅

（1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.武威腫瘤醫(yī)院，甘肅 武威 733000）

再生障礙性貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)再障）屬中醫(yī)學(xué)“血虛”“血證”“虛勞”“虛損”及“血枯”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為腎主骨，骨藏髓，髓血同源，可見(jiàn)腎與骨髓造血有密切關(guān)系。中醫(yī)還認(rèn)為“血者水谷之精也，生化于脾”“中焦受氣取汁，變化而赤是為血”，可見(jiàn)脾與造血也有一定關(guān)系。因此，辨證論治應(yīng)以腎、脾為核心，尤其以腎為主。全國(guó)著名中西醫(yī)結(jié)合專(zhuān)家裴正學(xué)教授認(rèn)為：健脾補(bǔ)腎是治療再障的根本大法，在此理論基礎(chǔ)上，根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，研制出具有補(bǔ)腎生髓、健脾益氣、養(yǎng)血和胃功效的蘭州方，對(duì)治療再障、調(diào)整機(jī)體免疫功能具有良好療效。為進(jìn)一步研究中醫(yī)健脾補(bǔ)腎理論治療再障的作用機(jī)理，進(jìn)行中藥制劑蘭州方對(duì)再障模型小鼠骨髓增殖的實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康BALB/C小鼠90只，雌雄各半，體重（20±2）g，8～10周齡；DBA/2小鼠10只，雌雄各半，8周齡[1]。由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14-009號(hào)。

1.1.2 藥品 蘭州方（由生地、山萸肉、山藥、丹皮、北沙參、人參須、潞黨參、太子參、桂枝、浮小麥、大棗、麥冬、五味子、炙甘草、白芍、墓頭回等組成，由甘肅省蘭州市薈萃堂制成顆粒沖劑，每包含生藥量36.25 g），貞芪扶正顆粒（由佛慈制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字262020416）。

1.1.3 儀器 直線加速器（德國(guó)，西門(mén)子Primus）、光學(xué)顯微鏡（Olympus，Bx60-F5）、超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司 VS-1300L型）、脫水機(jī)（德國(guó)，LEICATP1020）、切片機(jī)（德國(guó)，LEICARM2135）、病理組織漂烘處理儀（常州中威電子儀器廠，PHY-Ⅲ型）、包埋機(jī)（常州中威電子儀器廠，BMJ-Ⅲ型）、染色儀（常州中威電子儀器廠，CM1900HE）。

1.1.4 胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備 取DBA/2小鼠斷頸處死，用75%酒精浸泡5分鐘，常規(guī)消毒后，無(wú)菌取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結(jié)，加少量生理鹽水，輕輕剪碎、碾碎后，用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，通過(guò)4號(hào)針頭制作成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性，活性細(xì)胞達(dá)95%以上。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 參照姚軍等再障造模，并根據(jù)趙忻等[2]關(guān)于免疫介導(dǎo)小鼠再障造模的方法進(jìn)行改進(jìn)，除正常對(duì)照組的15只BALB/C小鼠外，將其余75只BALB/C小鼠（剩余組）經(jīng)直線加速器6 Mvγ射線照射全身，照射高度100 cm，時(shí)間1分鐘，劑量3.0 GY。照射4小時(shí)內(nèi)，經(jīng)尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液0.2 ml，細(xì)胞數(shù)1×106/只[3]。造模一周后，經(jīng)尾靜脈采血，血分析結(jié)果表明：剩余組的白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白與正常對(duì)照組比較，均明顯下降（P＜0.01或P＜0.05），見(jiàn)表1。骨髓涂片：造模一周后，每組隨機(jī)取5只小鼠，脫頸處死后取出左側(cè)股骨，用4號(hào)針頭取1 ml RPMI-1640液沖出骨髓滴于載玻片上推片，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行骨髓組織形態(tài)學(xué)觀察[4]。結(jié)果表明，剩余組小鼠骨髓涂片顯示骨髓增生低下，粒系平均＜15%、紅系＜7%、巨核細(xì)胞0～7個(gè)/HP；正常對(duì)照組骨髓增生活躍，粒系平均＞40%、紅系平均＞14%、巨核細(xì)胞45～72個(gè)/HP，兩組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的免疫介導(dǎo)的再障小鼠模型是成功的[5]，可以按原方案進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。

表1 直線加速器γ射線對(duì)再障小鼠外周血HGB、RBC、WBC、PLT的影響（±s）

表1 直線加速器γ射線對(duì)再障小鼠外周血HGB、RBC、WBC、PLT的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

PLT（×109·L-1）1 588.4±240.00 655.3±125.96**組別正常對(duì)照組（n=15）剩余組（n=75）HGB（g·L-1）134±16.00 112±9.39*RBC（×1012·L-1）8.91±1.20 8.08±0.58 WBC（×109·L-1）9.12±3.36 4.20±0.96**

1.2.2 動(dòng)物分組 將BALB/C小鼠90只隨機(jī)分組，其中正常對(duì)照組15只，蘭州方大、中、小劑量組各15只，模型組15只，貞芪扶正顆粒對(duì)照組15只。

1.2.3 給藥方法 模型組給予等量生理鹽水灌胃，蘭州方（顆粒）、貞芪扶正顆粒使用前分別用蒸餾水充分溶解，根據(jù)文獻(xiàn)中人/小鼠用藥等效劑量換算法，中藥的中劑量組相當(dāng)于成人臨床用量的20倍[6]，故蘭州方大、中、小劑量組分別給予0.02 g/g·d、0.01 g/g·d和0.005 g/g·d藥液1 ml（相當(dāng)于成人用量的40倍、20倍、10倍）；給予貞芪扶正顆粒每只0.01 g/g·d（相當(dāng)于成人臨床用量的20倍）1 ml。各組均以普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)灌胃40天[7]。

1.2.4 小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù) 骨髓有核細(xì)胞（BMC）提?。簠⒄仗婆逑业萚8]的方法，灌胃40天后，先用頸椎脫臼法處死小鼠，然后用鼠齒鑷夾住左側(cè)股骨（右側(cè)待用），剪去骨骺，用20號(hào)針頭刺穿骨末端，接著用注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液2 ml向骨髓腔內(nèi)快速推入，沖洗出骨髓細(xì)胞，收集在滅菌離心管內(nèi)，最后用注射器反復(fù)推拉骨髓細(xì)胞懸液幾次，使骨髓細(xì)胞充分分散，制成懸液，以備光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。

將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上，將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3分鐘，鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下列公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/ml=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10 000。

1.2.5 骨髓組織形態(tài)學(xué)觀察 取小鼠右側(cè)股骨中段，經(jīng)甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、切片、HE-Giemsa染色等處理后備用。將切片放在光學(xué)顯微鏡的高倍鏡下（10×40）觀察，按文獻(xiàn)[4]方法，用5×5規(guī)格的網(wǎng)形測(cè)微器以計(jì)點(diǎn)法測(cè)定骨髓造血組織容量百分率，即時(shí)隨機(jī)選擇10個(gè)視野，觀察與記錄每個(gè)視野內(nèi)10個(gè)點(diǎn)所擊中的目標(biāo)，如果交接點(diǎn)擊中造血組織或脂肪組織或血竇，即記錄為1點(diǎn)；如擊中造血/脂肪組織的邊界，即記錄為1/2點(diǎn)，共觀察100點(diǎn)，按下列公式計(jì)算出造血組織、脂肪組織和血竇的容量百分率。造血組織容量百分率（%）=造血組織擊中數(shù)/（造血組織擊中數(shù)+脂肪組織擊中數(shù)+血竇擊中數(shù)）×100%。脂肪組織容量百分率（%）=脂肪組織擊中數(shù)/（造血組織擊中數(shù)+脂肪組織擊中數(shù)+血竇擊中數(shù)）×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s）表示。兩組計(jì)量資料采用Student's ttest檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析（One-way anovo），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨BMC計(jì)數(shù)（見(jiàn)表2）

表2 股骨BMC計(jì)數(shù)（±s）

表2 股骨BMC計(jì)數(shù)（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

分組正常對(duì)照組模型組蘭州方大劑量組蘭州方中劑量組蘭州方小劑量組貞芪扶正顆粒對(duì)照組有核細(xì)胞計(jì)數(shù)（×106/L）12.22±0.66 2.72±0.52*4.14±0.99**#6.34±0.14*##4.39±0.61**#4.32±0.32**##

由表2可見(jiàn)，模型組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對(duì)照組小鼠BMC計(jì)數(shù)較正常對(duì)照組小鼠明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對(duì)照組BMC計(jì)數(shù)較模型組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、中、小劑量組BMC的計(jì)數(shù)與貞芪扶正顆粒對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 骨髓組織形態(tài)學(xué)觀察（見(jiàn)表3）

表3 骨髓組織形態(tài)學(xué)觀察（±s）

表3 骨髓組織形態(tài)學(xué)觀察（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與蘭州方中劑量組比較，△P＜0.05

分組正常對(duì)照組模型組蘭州方大劑量組蘭州方中劑量組蘭州方小劑量組貞芪扶正顆粒對(duì)照組造血組織容量百分率（%）92.22±0.66 10.72±2.52*26.57±2.24*#△36.38±2.34*#29.10±1.06*#△27.22±1.46**#△脂肪組織容量百分率（%）1.72±0.23 21.08±2.21*26.19±2.61**##△22.34±1.14**#24.14±0.99**##△28.32±0.35*#△

由表3可見(jiàn)，模型組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對(duì)照組造血組織容量百分率較正常對(duì)照組明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）；模型組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對(duì)照組脂肪組織容量百分率較正常對(duì)照組明顯增多（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對(duì)照組造血組織容量百分率較模型組顯著升高（P＜0.05），而脂肪組織容量百分率較模型組亦顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、小劑量組造血組織容量百分率和脂肪組織容量百分率與貞芪扶正顆粒對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；蘭州方中劑量組造血組織容量百分率高于蘭州方大、小劑量組和貞芪扶正顆粒對(duì)照組（P＜0.05）；蘭州方中劑量組脂肪組織容量百分率低于蘭州方大、小劑量組和貞芪扶正顆粒對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

（1）骨髓造血是造血祖/干細(xì)胞通過(guò)有絲分裂分化增殖的動(dòng)態(tài)過(guò)程，各級(jí)祖細(xì)胞經(jīng)過(guò)不斷增殖分化，形成各種原始幼稚細(xì)胞，最后發(fā)育為成熟血細(xì)胞而釋放入周?chē)?。骨髓中的有核?xì)胞由上述各級(jí)細(xì)胞組成，其數(shù)量變化在一定程度上代表了骨髓造血細(xì)胞增殖的程度。骨髓造血組織主要由網(wǎng)狀結(jié)締組織和造血細(xì)胞組成。網(wǎng)狀細(xì)胞和網(wǎng)狀纖維構(gòu)成造血組織的網(wǎng)架，網(wǎng)孔中充滿不同發(fā)育階段的各種血細(xì)胞以及少量造血干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞等，造血組織含量的提高是骨髓造血細(xì)胞增殖量化的反映。

（2）本次結(jié)果表明，蘭州方中健脾補(bǔ)腎、益氣活血的中藥的確可以促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增生，提高造血組織容量百分率，使用藥后蘭州方大、中、小劑量組造血組織容量百分率和脂肪組織容量百分率趨于1∶1的正常姿態(tài)，從而提高外周血象相關(guān)指標(biāo)。大量臨床與實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道也證明[9-10]，健脾補(bǔ)腎活血的方藥能提高免疫介導(dǎo)再障小鼠骨髓CFU-GM、CFU-S、BFU-E、CFU-D、CFU-E產(chǎn)率，改善骨髓環(huán)境，從而調(diào)節(jié)和促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖分化，使造血組織容量百分率增加。除此之外，蘭州方能改善骨髓微環(huán)境，有利于骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)生長(zhǎng)，增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞黏附造血細(xì)胞的能力，以此調(diào)節(jié)和促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖分化，使造血組織容量增加、外周血細(xì)胞回升。

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