酶生物傳感器在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用

王 虹 王 軍

(江蘇警官學(xué)院公安科技系，江蘇 南京 210031)

農(nóng)藥常被廣泛地應(yīng)用于抵抗病蟲(chóng)災(zāi)害、清除雜草、提高產(chǎn)量。食用受到農(nóng)藥污染的蔬菜、水果而造成的急性中毒事件[1]、食品出口過(guò)程中因農(nóng)藥殘留超標(biāo)導(dǎo)致退貨的國(guó)際貿(mào)易事件[2]、與農(nóng)藥中毒有關(guān)的自殺案件、投毒案件、意外事故也時(shí)常出現(xiàn)[3，4]。對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行分析檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)判斷中毒原因和案件的性質(zhì)至關(guān)重要。

農(nóng)藥檢測(cè)的常規(guī)方法有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、色譜-質(zhì)譜法[7，8]、光譜分析[9，10]等。這些方法雖然具有高準(zhǔn)確度、高精確度，但需要較長(zhǎng)的前處理時(shí)間，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)并獲得檢測(cè)結(jié)果。隨著生物技術(shù)和微電子技術(shù)的發(fā)展，生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中則體現(xiàn)出實(shí)時(shí)快速、簡(jiǎn)單便攜和低成本的分析優(yōu)勢(shì)，因此頗受關(guān)注[11，12]。本文介紹了酶生物傳感器的分類(lèi)、酶的固定技術(shù)，比較了電化學(xué)型酶生物傳感器、光學(xué)型及壓電型酶生物傳感器的應(yīng)用領(lǐng)域、檢測(cè)限和優(yōu)缺點(diǎn)。

1酶生物傳感器

酶生物傳感器(Enzymatic Biosensor，EBS)是指將酶與特定的載體或電極結(jié)合并將酶促反應(yīng)的產(chǎn)物信息(如物質(zhì)濃度變化、光熱反應(yīng)等)經(jīng)過(guò)能量轉(zhuǎn)換器變?yōu)殡娦盘?hào)輸出的一種裝置[13]。 根據(jù)酶與物質(zhì)反應(yīng)機(jī)理不同，酶生物傳感器一般可以分為膽堿酯酶?jìng)鞲衅?CHE)和有機(jī)磷水解酶?jìng)鞲衅?OPH)[14]。

根據(jù)酶生物傳感器制作過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)換器的不同，又可將其分為電化學(xué)型生物傳感器、光學(xué)型生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等[15]，其中電化學(xué)型生物傳感器最為常見(jiàn)，按電極反應(yīng)方式不同分為電位型、電流型(安培型)、電位-電流型以及隨著微電子技術(shù)發(fā)展起來(lái)的離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)晶體管型(ISFET)[16]。

電化學(xué)型EBS的能量轉(zhuǎn)換器即電化學(xué)電極，識(shí)別元件則為酶活性材料。由于反應(yīng)在電極周?chē)赐瓿桑仕扔须娀瘜W(xué)電極響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，又有酶的特異性識(shí)別和選擇性催化功能，因此在傳感領(lǐng)域發(fā)展最早，研究?jī)?nèi)容最豐富，應(yīng)用范圍也最為廣泛。

光導(dǎo)纖維EBS由光導(dǎo)纖維、酶分子識(shí)別元件及檢測(cè)器構(gòu)成[17]。它是依據(jù)酶選擇性識(shí)別待檢測(cè)物質(zhì)，催化反應(yīng)，并伴隨可檢測(cè)的磷光、熒光、拉曼光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光等光變化，通過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)到待檢測(cè)物質(zhì)濃度[18]。

石英晶體微天平(QCM)依據(jù)壓電石英晶體諧振測(cè)量技術(shù)，早期主要用于檢測(cè)氣體有機(jī)物和無(wú)機(jī)物[19]，后來(lái)發(fā)展到壓電石英晶體EBS。Abad等[20]將固定有乙酰膽堿酯酶(AChE)的晶體電極浸沒(méi)在3-吲哚乙酸組織培養(yǎng)基中，來(lái)測(cè)量對(duì)氧磷和西維因，檢測(cè)限分別可達(dá)5.0×10-8和1.0×10-7mol/L。

2檢測(cè)食品中農(nóng)殘常用的酶生物傳感器

圖1所示為傳感器基本構(gòu)成，其核心部件是分子識(shí)別元件和能量轉(zhuǎn)換器。在酶生物傳感器中識(shí)別元件即為固定化的酶，可以識(shí)別待測(cè)物質(zhì)催化反應(yīng)，引起的物質(zhì)的量的變化或光熱的變化即經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換后用于檢測(cè)。因此酶的固定技術(shù)可以說(shuō)是酶生物傳感器制作中最重要的一項(xiàng)技術(shù)。

圖1 生物傳感器構(gòu)成示意圖Fig 1 sketch drawing of biosensor

2.1 酶固定技術(shù)

酶的固定技術(shù)是將酶和載體或者電極結(jié)合，使酶能夠集中在一定空間范圍內(nèi)與待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行催化反應(yīng)的方式。酶的固定方法會(huì)影響酶的穩(wěn)定性、反應(yīng)靈敏性和使用壽命等。一般酶固定方法有吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)鍵結(jié)合法、包埋法等[21]。

吸附法較為簡(jiǎn)單，有物理吸附和化學(xué)吸附兩種。優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，且酶活力損失較小，但是這種固定方法酶易脫落，不夠穩(wěn)定。在絲網(wǎng)印刷電極表面乙酰膽堿酯酶(AChE) 的固定中會(huì)用到這種方法[22]。

交聯(lián)法是由酶分子間或分子內(nèi)通過(guò)交聯(lián)劑作用發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而形成不溶于水的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這樣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)輕薄且易吸附，會(huì)附著在一些固體的表面從而使酶得到固定[23]。這種酶固定方法穩(wěn)定性好，響應(yīng)快，但酶活性中心易失活所以重復(fù)性較差。

共價(jià)鍵結(jié)合法是酶的側(cè)鏈基團(tuán)和電極表面發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)鍵而相互結(jié)合從而使酶得到固定的方法。參加共價(jià)結(jié)合反應(yīng)的不能是酶的活性中心，否則會(huì)使酶的活性大大降低。這種固定方法由于發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)故穩(wěn)定牢固，酶分子不易脫落，使用壽命長(zhǎng)，但是化學(xué)修飾和激烈的反應(yīng)可能使酶活性降低，且操作復(fù)雜，成本較高。

包埋法是通過(guò)物理方法將酶分子包埋在高分子聚合物形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)中得以固定。與共價(jià)鍵結(jié)合法不同，這種方法一般不產(chǎn)生化學(xué)修飾，故很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)酶活性影響較小。缺點(diǎn)是分子量大的底物在凝膠網(wǎng)格內(nèi)擴(kuò)散較固難。光纖型EBS的制作中常用這種方法來(lái)固定酶，在電流型EBS制作中也常見(jiàn)到[23]。

酶的固定方法各有優(yōu)點(diǎn)和不足，應(yīng)該結(jié)合具體的酶生物傳感器類(lèi)型、固定的基質(zhì)性質(zhì)及傳感器作用方式來(lái)確定選擇合適的固定方法來(lái)提高性能。在實(shí)際應(yīng)用中，有時(shí)會(huì)把兩種固定方法結(jié)合起來(lái)使用以?xún)?yōu)勢(shì)互補(bǔ)獲得更好的性能。例如將吸附和交聯(lián)法結(jié)合，通過(guò)交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來(lái)克服吸附法中酶易從載體漏失或脫落的問(wèn)題，增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性[24]。

2.2 電化學(xué)型酶生物傳感器

電化學(xué)型酶生物傳感器是目前應(yīng)用最為廣泛的一種酶生物傳感器。隨著研究進(jìn)展它又分為多個(gè)不同的分支種類(lèi)，表1列出了幾種類(lèi)型電化學(xué)型酶生物傳感器的制作方式及檢測(cè)限。在制作方式、檢測(cè)限、重復(fù)性、反應(yīng)時(shí)間以及線(xiàn)性范圍方面均有不同。

傳統(tǒng)電位型EBS在檢測(cè)農(nóng)藥殘留方面發(fā)展最早，它制作簡(jiǎn)單、靈敏度較高、響應(yīng)快、線(xiàn)性范圍寬、重復(fù)性較好，且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、基本無(wú)需對(duì)待測(cè)樣品做前處理。但相對(duì)而言傳統(tǒng)pH電極直接檢測(cè)的精密度不高、工作曲線(xiàn)也不是很穩(wěn)定、電極壽命短，因此逐漸被其他類(lèi)型電化學(xué)型EBS所取代。

表1 常見(jiàn)電化學(xué)型酶生物傳感器比較Table 1 the compare of electrochemical enzyme biosensor

離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)管(ISFET) EBS是隨著微電子技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的。其構(gòu)造簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性更高，且檢測(cè)靈敏度和使用壽命較傳統(tǒng)電極高。該種EBS本身也向微型化、集成化發(fā)展；同時(shí)ISFET適合批量制造，故其市場(chǎng)已較為成熟，具有廣闊的應(yīng)用潛力。

電流型EBS的種類(lèi)最為繁多，早期的電流型EBS由于檢測(cè)電位較高，一些電化學(xué)活性物質(zhì)對(duì)其干擾較大，影響其靈敏度；加入一些介體修飾后雖然降低了檢測(cè)電位，并且提高了檢測(cè)限，但電極制作工藝復(fù)雜，重復(fù)性差，難以推廣應(yīng)用。后來(lái)絲網(wǎng)印刷技術(shù)的發(fā)展和引入使電流型EBS研究有了新的突破，在選擇性、重復(fù)性、靈敏度方面均得到提高[16]。絲網(wǎng)印刷技術(shù)最大優(yōu)勢(shì)是實(shí)現(xiàn)了酶電極探頭批量生產(chǎn),且電極重現(xiàn)性好，降低了傳感器的成本，在實(shí)際推廣應(yīng)用中只需進(jìn)一步提高酶的穩(wěn)定性以及成本控制。從表中可以看出，電流型EBS的檢測(cè)限在幾種電化學(xué)型EBS中是最高的，可以達(dá)到10-8的數(shù)量級(jí)，在今后的發(fā)展中也很有潛力。

電位-電流型EBS作為兩者的結(jié)合，是一個(gè)新的研究方向。它結(jié)合了電位型EBS響應(yīng)時(shí)間短、重復(fù)性好、檢測(cè)范圍廣以及電流型EBS靈敏度高、檢測(cè)限低的優(yōu)勢(shì)，但是受傳感器制作成本高及核心芯片制作工藝復(fù)雜的限制，到實(shí)際應(yīng)用仍需研究改進(jìn)。

不同類(lèi)型的酶生物傳感器的優(yōu)缺點(diǎn)不是一成不變的，與制作方式和應(yīng)用場(chǎng)合有極大關(guān)系，選擇不同的酶就會(huì)使傳感器效果不同。例如膽堿酯酶中，丁酰膽堿酯酶對(duì)農(nóng)藥的抑制性比乙酰膽堿酯酶更強(qiáng)，故用其代替乙酰膽堿酯酶所制作的傳感器更加的靈敏、檢測(cè)限也更高，有時(shí)甚至能提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。有機(jī)磷水解酶則是通過(guò)水解底物來(lái)完成反應(yīng)的，其針對(duì)性、準(zhǔn)確性很高，它只需一步反應(yīng)，故其反應(yīng)速度比較快，響應(yīng)時(shí)間短，但一般由于底物量較少，對(duì)檢測(cè)精度要求就很高，制作起來(lái)也相對(duì)比較困難。綜上可見(jiàn)，酶生物傳感器的效果其實(shí)是各個(gè)因素的綜合結(jié)果。

2.3 光學(xué)型及壓電型酶生物傳感器

光學(xué)型EBS主要由光纖和生物敏感膜組成，隨著研究進(jìn)展不斷有最新技術(shù)引入，也存在著一些亟待解決的不足之處。

壓電型(石英晶體微天平(QCM))EBS以QCM為信號(hào)轉(zhuǎn)換器。QCM是根據(jù)壓電石英晶體諧振測(cè)量技術(shù)制成的，晶體吸附外來(lái)物后振動(dòng)頻率的變化和附著層的質(zhì)量變化可以轉(zhuǎn)換為信號(hào)輸出，具有10-9g級(jí)的質(zhì)量檢測(cè)能力，它對(duì)表面質(zhì)量負(fù)載的高度靈敏特性使之成為傳感器制備中較好的信號(hào)轉(zhuǎn)換器。表2列出了幾種常見(jiàn)的光學(xué)型和壓電型酶生物傳感器的比較結(jié)果。

表2 常見(jiàn)光學(xué)型及壓電型酶生物傳感器比較Table 2 the compare of optical and piezoelectric enzyme biosensor

光纖EBS以光為檢測(cè)信號(hào)，靈敏度極高，可以達(dá)到10-9～10-10數(shù)量級(jí)，響應(yīng)時(shí)間短，抗電磁場(chǎng)干擾能力強(qiáng)，信息傳遞容量大，能量損耗低等，在常量至微量甚至超微量分析方面,具有其他傳感技術(shù)所不具有的優(yōu)勢(shì)。同樣由于光的特性，使得光纖EBS易受背景光的干擾，穩(wěn)定性較差，且制作時(shí)固定生物材料難度更大。然而無(wú)論如何，光纖EBS快速、可逆，能夠?qū)崿F(xiàn)在線(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè),這點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用中有重要意義。

壓電型(石英晶體微天平(QCM))EBS是一種新穎的生物傳感器，它檢測(cè)靈敏度很高，快速簡(jiǎn)單，成本較低，且對(duì)樣品無(wú)需破壞處理，可以在線(xiàn)監(jiān)測(cè)。但是壓電型EBS對(duì)操作環(huán)境條件要求嚴(yán)格，濕度和溫度都可能影響其結(jié)果，故在實(shí)際應(yīng)用中有時(shí)難以達(dá)到預(yù)期效果，不利于推廣應(yīng)用。 但是光纖EBS和壓電型EBS的出現(xiàn)，給酶生物傳感器的發(fā)展提供了新的思路，從能量轉(zhuǎn)換的角度來(lái)開(kāi)發(fā)更多種類(lèi)的傳感器。

對(duì)比電化學(xué)型、光學(xué)型、壓電型這三大類(lèi)酶生物傳感器，雖有各自發(fā)展之先后，但自身都存在一些優(yōu)點(diǎn)和不足之處。

電化學(xué)型EBS以酶作分子識(shí)別元件對(duì)底物有高度選擇性，具有較高的靈敏度，同時(shí)電極響應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)迅速?，F(xiàn)在隨著發(fā)展還出現(xiàn)了以動(dòng)植物細(xì)胞和組織來(lái)代替純酶試劑，降低了生物傳感器的制作成本。電化學(xué)型EBS適用范圍廣，性能穩(wěn)定，其技術(shù)已經(jīng)相對(duì)完善且有實(shí)際應(yīng)用意義，有廣闊的發(fā)展前景。

光學(xué)型和壓電型EBS是新型的生物傳感器，它們都有極高的檢測(cè)靈敏度(這也是酶生物傳感器的特性之一)，并且都可以實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。但是兩者的制作過(guò)程均略顯復(fù)雜，檢測(cè)范圍受到限制，壓電型EBS對(duì)操作環(huán)境要求嚴(yán)格，因此兩者離實(shí)際應(yīng)用推廣還有一段距離，但仍是生物傳感技術(shù)的重要分支，具有重要的研究意義。

3結(jié) 論

酶生物傳感器開(kāi)辟了農(nóng)藥殘留檢測(cè)的新領(lǐng)域，在測(cè)定農(nóng)藥，特別是痕量微量的農(nóng)藥殘留，與其它需用儀器進(jìn)行分析的方法相比較，它更方便、快速且需對(duì)樣品所做的前處理較少。但酶生物傳感器尤其是一些電化學(xué)生物傳感器以及一些新型酶生物傳感器的研究多在實(shí)驗(yàn)室條件下，被開(kāi)發(fā)應(yīng)用到實(shí)際檢測(cè)中的種類(lèi)很少。目前要生產(chǎn)用于農(nóng)藥殘留日常檢測(cè)的酶生物傳感器并在工業(yè)中實(shí)現(xiàn)推廣還要進(jìn)行大量的研究工作，其最大問(wèn)題還是穩(wěn)定性、靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。當(dāng)前要有所突破克服現(xiàn)有的一些不足還需要研究新的酶固定化技術(shù)，做到提高酶活力的同時(shí)延長(zhǎng)酶生物傳感器使用壽命；也可以通過(guò)研發(fā)新型信號(hào)轉(zhuǎn)換技術(shù)來(lái)研制新型酶生物傳感器。今后，酶生物傳感器將朝著經(jīng)濟(jì)化、小型化、功能多樣化、智能化和集成化方面發(fā)展。而想要把酶生物傳感器應(yīng)用到公安工作中來(lái)，不僅僅是要考慮到它快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，還要考慮到酶生物傳感器的選擇性比較高，但也正是這樣其毒物檢測(cè)范圍就會(huì)受到限制，通常只能針對(duì)某類(lèi)毒物或者農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，但公安案件中的檢材通常是很復(fù)雜多樣的，這樣的檢測(cè)結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)假陰性。不管是將多種酶一起固定在基質(zhì)上形成多酶膜還是一些其他的解決方法，酶生物傳感器在公安工作中的真正應(yīng)用還有很長(zhǎng)一段路要走，還有很多實(shí)際的問(wèn)題需要大家一起探索解決，不管如何，酶生物傳感器作為一種快速檢測(cè)方法還是十分有發(fā)展?jié)摿Φ摹?/p>

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