卒中治療藥物或治療方法臨床前評價的動物模型

中國卒中學會轉化醫(yī)學分會（執(zhí)筆：朱東亞）

卒中是由各種血管性因素（包括出血和缺血）引起的急性腦功能障礙。卒中具有高發(fā)生率、高死亡率、高致殘率等特點，給社會和家庭帶來沉重負擔。然而，大量臨床前動物模型上有效的治療藥物，在臨床試驗中均未得到陽性結果。雖然原因是復雜的，但動物模型制備的技術成熟度、模型的標準化、多樣性、與臨床的相關性、評價指標的選擇、實驗條件的控制，以及未遵循多中心隨機雙盲原則等，都可能導致臨床前與臨床試驗結果的不一致。鑒于此，中國卒中學會轉化醫(yī)學分會經過長期醞釀和多次深入討論，決定撰寫本文，并建議作為卒中臨床前藥物和治療方法評價的指南，希望能推動我國卒中臨床前研究的臨床轉化。

1 卒中動物模型的選擇與臨床意義

卒中一般分為兩大類，一類為出血性卒中，另一類是缺血性卒中，分別需要用腦出血動物模型和腦缺血動物模型進行臨床前評價。腦出血動物模型一般采用自體血腦內注射模型，注射部位和注射量可根據研究目標而定。臨床上缺血性卒中的梗死體積變異較大，至少需要一種能反映體積較大的梗死灶的動物模型和一種能反映體積較小的梗死灶的動物模型。大鼠頸內動脈線栓法制備大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）往往形成較大的梗死體積，可用于評價梗死灶較大的缺血性卒中。光化學法誘導腦缺血模型形成的梗死灶較小，并且可以人為控制梗死灶體積和梗死發(fā)生的位置，因此適合于評價梗死灶較小的缺血性改變。無論線栓模型還是光化學法誘導腦缺血模型，都和臨床實際的腦缺血有較大差異。因此，在評價治療藥物或治療方法對缺血性卒中的作用時，最好另加一個大鼠同種異體血栓栓塞模型，這種模型與臨床腦血栓形成比較接近。近年來，臨床上血管內溶栓或介入取栓的病例越來越多，這會導致缺血再灌注。此外，還有些患者出現自發(fā)再灌注。因此，在評價治療藥物或治療方法對缺血性卒中的作用時，應采用永久性缺血和缺血再灌注兩種模型。因各種原因導致在一段時間內大腦中斷血供，比如心臟手術等，可導致全腦缺血再灌注損傷，評價治療藥物或治療方法對這種缺血性卒中的作用時，最好采用大鼠四血管結扎缺血再灌注模型。此外，選擇動物模型時還要注意性別和年齡問題，至少有一種卒中模型分別使用雄性和雌性動物，至少有一種卒中模型使用老年大鼠。當然，臨床上卒中的類型多種多樣，不可能一一用動物模型復制，上述幾種動物模型基本可以覆蓋卒中的大部分情況[1]。

2 主要卒中動物模型的制備方法及評價指標

2.1 線栓法大鼠局灶性腦缺血模型（永久性和再灌注）

一般采用MCAO模型[2]。實際上，并非所有的缺血都發(fā)生在大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA），但MCAO比較容易復制，實驗條件也比較容易控制，個體之間的可比性較好，建議首選該模型。

2.1.1 制備方法

2.1.1.1 手術過程 將麻醉后的大鼠仰臥位固定于手術臺上，剪去頸部毛發(fā)，75%酒精、碘伏消毒頸部皮膚，頸部正中切開，用眼科鑷輕輕分開表面筋膜，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，鈍性分離甲狀腺動脈和枕動脈并電凝切斷。手術過程應盡量避免刺激氣管和神經。用動脈夾夾閉頸總動脈近心端和頸內動脈，防止出血。頸外動脈近心端和遠心端分別用縫線（6-0）結扎，近心端的縫線此時不扎緊，在兩個縫線間剪一微小切口，插入線栓，稍系緊頸外動脈近心端的結并剪斷頸外動脈。松開頸內動脈上的動脈夾，將插入的線栓翻折經頸總動脈分叉進入頸內動脈，然后徐徐插入至有輕微阻力為止（進入的線栓自分叉處至MCA起始端約20 mm），阻斷MCA的所有血供并再次系緊頸外動脈的縫線固定線栓，松開結扎頸總動脈的動脈夾。如研究永久性缺血，線栓插入后，剪斷血管外的線栓，消毒，縫合頸部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。如研究再灌注損傷，一般情況下缺血時間為60～120 min，然后拔栓進行再灌注。拔栓時先用動脈夾夾閉頸總動脈防止大出血，然后輕輕解開頸外動脈近心端的縫線，拔出線栓，重新扎緊縫線，消毒，縫合頸部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。如研究其他特殊問題，缺血時間可根據研究目標自行設定。

2.1.1.2 線栓規(guī)格 隨著大鼠成長，體重增加，血管粗細相應有所變化，MCAO術中使用的線栓應當根據動物的體重選擇不同規(guī)格的線栓。Doccol MCAO線栓穩(wěn)定性好，在國內外使用較廣。200～250 g成年大鼠推薦使用外徑0.35 mm的線栓（對應型號：403556PK5Re），250～280 g成年大鼠推薦使用外徑0.37 mm的線栓（對應型號：403756PK5Re），280～330 g成年大鼠推薦使用外徑0.39 mm的線栓（對應型號：403956PK5Re）。

表1 改良Bederson 5分制法

2.1.2 主要評價指標

2.1.2.1 急性期評價指標

①梗死體積測定：對于急性期的研究，首選2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法標示梗死組織。TTC的工作原理是三磷腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）代謝的變化，適用于梗死灶的早期階段，對于＞7 d的梗死灶，不適合用TTC染色法，可改為尼氏染色法或小動物核磁成像。但小動物核磁成像價格昂貴，并且需要的時間長，動物之間時間的一致性不容易控制，僅適合小樣本量的動物實驗。

②神經缺陷癥狀評分：急性期的神經缺陷癥狀采用改良Bederson 5分制法進行神經缺陷癥狀評價（表1）。

2.1.2.2 遠期評價指標

①神經缺陷評分：遠期的神經缺陷癥狀采用改良神經損傷嚴重程度評分（modified Neurological Severity Score，mNSS）法，對動物運動、感覺、反射及平衡功能進行綜合評價（表2）。

②認知功能評價：采用Morris水迷宮試驗測試大鼠空間學習記憶能力，包括：可視平臺試驗（visible platform trial），以排除感覺、視覺或運動功能障礙對空間學習記憶的影響；隱蔽平臺試驗（hidden platform trial），獲得登臺潛伏期，每天每只動物入水點順序保持一致，同一組內每只動物各不相同，以排除組內動物信息交流；空間探索試驗（probe trial），以觀察受試動物的空間定位能力，及在空間探索過程中的變化規(guī)律。

③運動功能評價：對于遠期的功能評價，運動功能是很關鍵的指標，常用的有網格實驗（grid-walking test）[3]、圓筒實驗[spontaneous forelimb task（cylinder test）][3]、足底膠紙實驗（modified sticky-tape test）[4]、轉角實驗（corner turn test）[5]、轉棒實驗（rotarod test）等[6]，至少要選擇兩種方法測定運動功能。

④生理參數評價：在急性期，要測定平均動脈壓（mean blood pressure，MBP）、血氧分壓（PaO2）、血二氧化碳分壓（PaCO2）、血pH、體重；遠期實驗要定期測定體重和攝食量，記錄死亡情況，繪制生存曲線圖。

2.1.3 實驗條件控制

2.1.3.1 腦血流 在腦缺血過程中，用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流。血流的下降程度與梗死概率成正相關。腦缺血后腦血流下降85%～95%為宜。如果腦血流下降＜85%，可認為腦缺血不完全，剔除該動物。

2.1.3.2 體溫 在腦缺血過程中，用電加熱毯加熱，控制肛溫（37±0.2）℃。

2.1.4 數據剔除條件 有下列情況時，數據可以剔除：①腦血流下降不滿足條件者；②麻醉清醒后，動物沒有典型的神經缺陷癥狀，提示缺血不成功；③出現抽搐、驚厥，一般因腦出血所致；④尸檢或終點解剖時發(fā)現腦出血。

2.2 光化學法誘導腦缺血模型

2.2.1 制備方法 將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，剪去頭部的毛發(fā)，用75%酒精、碘伏消毒皮膚，矢正中縱向剪開頭部皮膚，暴露顱骨，剝離顱骨表面結締組織膜，用棉簽擦去顱骨表面組織液并用洗耳球吹干，標記前鹵點和λ點，讀取前鹵點和λ點的D值，調整前鹵點和λ點的D值相差不超過0.2 mm，將直徑為8.0 mm的冷光源出光孔定位于前鹵點向右4.0 mm處。從大鼠股靜脈注射玫瑰紅（13 mg/kg；10 mg/ml溶于注射用生理鹽水中），2 min后用光強1800×100 lux～1900×100 lux的冷光源照射10 min，移除光纖，消毒，縫合頭部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)[7]。

2.2.2 主要評價指標

2.2.2.1 急性期評價指標

①梗死體積測定：對于急性期的研究，首選TTC染色法標示梗死組織。

②運動功能評價：同2.1.2.2。

2.2.2.2 遠期評價指標

①梗死體積測定：對于遠期研究，選用尼氏染色法標示梗死組織。

②運動功能評價：同2.1.2.2。③神經缺陷評分：同2.1.2.2。

④組織學評價：由于該模型梗死灶和梗死灶周圍區(qū)的界限分明，評價藥物是否影響梗死灶周圍區(qū)的組織學變化容易實施，建議在遠期藥效評價時觀察如下指標：神經元丟失情況，小膠質細胞激活情況，存活神經元樹突長度、分支數、樹突棘密度，軸突芽生情況，血管新生情況。

⑤生理參數評價：在急性期，要測定MBP、PaO2、PaCO2、血pH、體重；遠期實驗要定期測定體重和攝食量，繪制體重變化曲線圖。

2.2.3 實驗條件控制 同2.1.3。

表2 改良神經損傷嚴重程度評分（總分18分）

2.2.4 數據剔除條件 有下列情況時，數據可以剔除：①腦血流下降不滿足條件；②麻醉清醒后，動物沒有典型的運動功能缺陷，提示缺血不成功；③腦梗死誘導劑玫瑰紅注射有誤，可能導致梗死灶不準確。

2.3 遠端MCA閉塞模型

2.3.1 制備方法 將大鼠側臥位于手術臺上，剪去右側外耳道和右眼外眥之間的毛發(fā)，用75%酒精、碘伏消毒皮膚，在兩個位置連線的中點做一切口，長約2 cm。止血鉗拉開傷口，切斷顳肌，分離肌肉，暴露顴骨。用咬骨鉗除去顴弓，使用牽張器撐開下頜骨與顴弓，暴露卵圓窗。用骨鉆在卵圓窗前3 mm下1 mm處鉆孔，在顯微鏡下透過硬腦膜即可看見MCA，垂直于嗅束上行。挑破硬腦膜，分離MCA周圍的蛛網膜，暴露MCA。將中動脈挑起，用電凝器凝閉MCA，電凝位置在其分支豆紋動脈之前或靠近頸內動脈處?？p合頭部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)[8]。

2.3.2 主要評價指標

2.3.2.1 急性期評價指標

①梗死體積測定：同2.2.2.1。

②運動功能評價：同2.1.2.2。

2.3.2.2 遠期評價指標

①梗死體積測定：同2.2.2.2。

②運動功能評價。同2.1.2.2。

③神經缺陷評分：同2.1.2.2。

④組織學評價：同2.2.2.2。

⑤生理參數評價：同2.2.2.2。

2.3.3 實驗條件控制 同2.1.3。

2.3.4 數據剔除條件 有下列情況時，數據可以剔除：腦血流下降不滿足條件；麻醉清醒后，動物沒有典型運動功能缺陷，提示缺血不成功。

2.4 大鼠同種異體血栓MCA栓塞模型

2.4.1 制備方法（分兩天進行）

2.4.1.1 第一天 大鼠麻醉后仰臥位固定，暴露其股三角，剪去腿部毛發(fā)，75%酒精、碘伏消毒皮膚，用手術刀沿股三角上的股骨做一約10 mm的切口，分離暴露股動脈、股靜脈、神經束，鈍性分離出約5～8 mm股動脈，結扎股動脈遠心端，并在近心端用動脈夾瞬時阻斷血流，結扎處與動脈夾之間穿一根6-0縫線，并松松地系上一個活結，剪一小口，插入PE50管至動脈夾處，系緊活結，慢慢松開動脈夾，使血液順滑、直接地流入并充滿PE50管，再夾閉。取下PE50管，再系緊縫線，取下動脈夾，4-0縫線縫合傷口。將充滿血液的PE50置于一有蓋培養(yǎng)皿，置于37℃下2 h，然后儲存于4℃下22 h（期間保持充滿血液的PE50平整，并避免不必要的攪動）[9]。

2.4.1.2 第二天 取一平皿，加入生理鹽水，準備約500 mm的PE10連接于一含1 ml生理鹽水的注射器，將含有血栓的PE50截成約50 mm每段，將50 mm的含血栓PE50連接到PE10上，然后將血栓打入含生理鹽水的皿中，反復將血栓吸入打出PE10，10～15次后血栓變?yōu)槲⑷醯奶壹t色，表明血栓準備成功（注意：洗血栓時，打入皿中應盡量保持栓子為直線，避免折疊。若洗滌超過10～15次后血栓仍保持紅色則棄去不用）；將洗好的血栓分割成40 mm每段，儲存于含生理鹽水的有蓋培養(yǎng)皿中，室溫20～26℃可儲存4 h。超過4 h的血栓則棄去。MCAO前將血栓吸入改造好的PE50（改造PE50管全長至少120 mm，且其尖端長約22 mm，內徑0.3～0.4 mm，尖端后內徑0.4～0.97 mm，改造的PE50與250 μl微量進樣器相連）[9]。

2.4.1.3 MCAO模型制備 將麻醉后的大鼠仰臥位固定于手術臺上，剪去頸部毛發(fā)，75%酒精、碘伏消毒頸部皮膚，頸部正中切開，用眼科鑷輕輕分開表面的筋膜，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，輕輕剝離迷走神經，用動脈夾夾閉頸總動脈近心端。頸外動脈近心端和遠心端分別用縫線（6-0）結扎，并剪斷。在頸內動脈下穿一根縫線（2-0），防止出血，然后在頸外動脈和頸總動脈分叉處之間剪一微小切口，插入改造的PE50，經過頸總動脈分叉進入頸內動脈，然后徐徐插入至有輕微阻力為止（自分叉處約20 mm），稍稍退出1～2 mm，用微量注射泵以10 μl/min速度緩慢注射含有生理鹽水的血栓5～10 μl，注射血栓5 min后，輕輕拔出改造的PE50，恢復頸總動脈的血供，消毒，縫合頸部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)[9]。

2.4.2 主要評價指標

2.4.2.1 急性期評價指標

①梗死體積測定：同2.2.2.1。

②死亡率：相對于線栓MCAO模型，同種異體血栓MCA栓塞模型的死亡率較高，急性期死亡率是重要指標。

③神經缺陷癥狀評分：同2.1.2.1。

2.4.2.2 遠期評價指標

①神經缺陷評分：同2.1.2.2。

②認知功能評價：同2.1.2.2。

③運動功能評價：同2.1.2.2。

④生理參數評價：同2.1.2.2。

2.4.3 實驗條件控制 同2.1.3。

2.4.4 數據剔除條件 同2.1.4。

2.5 大鼠腦出血模型

推薦采用自體血注入法制備大鼠腦出血模型[10]，注射部位可以根據研究目的選擇，本文以紋狀體內自體血注射為例介紹。

2.5.1 制備方法 大鼠麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上，剪去頭部的毛發(fā)，用75%酒精、碘伏消毒皮膚，矢正中縱向剪開頭部皮膚，暴露顱骨，剝離顱骨表面結締組織膜，用棉簽擦去顱骨表面組織液并用洗耳球吹干，標記前鹵點和λ點，讀取前鹵點和λ點的D值，調整前鹵點和λ點的D值相差不超過0.2 mm，取前鹵點右側中線旁開3.0 mm、冠狀縫前0.02 mm，用尖頭錐鉆一直徑約1.0 mm的圓孔。暴露大鼠股三角，剪去腿部毛發(fā)，75%酒精、碘伏消毒皮膚，用手術刀沿股三角上的股骨做一約10 mm的切口，分離粘連暴露股動脈、股靜脈、神經束，鈍性分離出約5～8 mm股動脈，用微量進樣器取不抗凝自體股動脈血80 μl，將進樣器固定在微量注射泵上，進針深度距離顱骨表面5.5 mm，緩慢注入（10 μl/min），注射結束后留針3 min，然后緩慢將微量注射器拔出，用骨蠟封閉針眼，消毒，縫合頭部、腿部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。

2.5.2 主要評價指標

2.5.2.1 急性期評價指標

①出血指標：血腫部位和血腫范圍、血紅蛋白含量測定。

②腦水腫：出血側腦含水量測定。

③血腦屏障：用伊文思藍法定量測定血腦屏障的通透性。

④神經缺陷癥狀評分：同2.1.2.1。

2.5.2.2 遠期評價指標

①組織缺失體積：腦出血急性期后，水腫消退，由于出血區(qū)和周圍損傷區(qū)細胞死亡導致出血側腦組織體積減小，直接測量出血側和對側半球的腦組織體積，即可計算出出血側腦組織缺失體積。

②神經缺陷評分：同2.1.2.2。

③運動功能評價：同2.1.2.2。

④生理參數評價：同2.1.2.2。

2.5.3 實驗條件控制 在腦缺血過程中，用電加熱毯加熱，控制肛溫（37±0.2）℃。

2.5.4 數據剔除條件 有下列情況時，數據可以剔除：自體血注射時有血凝塊；麻醉清醒后，動物沒有典型的神經缺陷癥狀。

2.6 大鼠全腦缺血再灌注模型

全腦缺血模型常用沙土鼠雙側頸總動脈結扎再灌注模型和大鼠四動脈結扎再灌注模型。沙土鼠模型不穩(wěn)定，最好首選雙側椎動脈電凝法和動脈夾短暫阻塞雙側頸總動脈法制備大鼠四動脈結扎（four vessel occlusion，4VO）再灌注模型[11]。

2.6.1 制備方法（分兩天進行）

2.6.1.1 第一天 動物麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上，剪去頭和頸背部的毛發(fā)，用75%酒精、碘伏消毒皮膚，正中切開頸背部皮膚，暴露第一和第二頸椎，用棉簽擦去表面組織液并用洗耳球吹干，在體視顯微鏡下找到第一頸椎左右兩側的翼小孔，使用電凝針電凝翼小孔，阻塞左右兩側的椎動脈，消毒，縫合頭部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。

2.6.1.2 第二天 一期手術后24 h，使用異氟烷和氧氣按比例混合的混合氣體麻醉動物，仰臥位固定于手術臺上，剪去頸部毛發(fā)，75%酒精、碘伏消毒頸部皮膚，正中切開，用眼科鑷輕輕分開表面的筋膜，分離左右兩側頸總動脈，動脈夾夾閉兩側的頸總動脈，撤走麻醉氣體；缺血12 min后將動脈夾松開，恢復血供進行再灌注，消毒，縫合頸部皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。

2.6.2 主要評價指標

2.6.2.1 認知功能評價 同2.1.2.2。

2.6.2.2 組織學評價 該模型的典型組織學改變是海馬CA1區(qū)神經元死亡，需用兩種以上的方法測定海馬CA1區(qū)神經元死亡情況，建議使用NeuN免疫熒光法或Nissl染色組織化學法標記存活的神經元，用Fluoro Jade熒光染色標記壞死或凋亡的神經元。

2.6.2.3 生理參數評價 在缺血及再灌注過程中，觀察其腦電圖形態(tài)和各波段相對功率值的變化。

2.6.3 實驗條件控制 同2.5.3。

2.6.4 數據剔除條件 有下列情況時，數據可以剔除：四動脈結扎后動物翻正反射未消失；腦電圖未出現典型變化。

3 臨床前主要藥效學評價指導原則

3.1 模型選擇

溶栓或抗凝血類藥物只能選擇腦缺血模型，神經保護劑應同時選擇腦缺血和腦出血模型。腦缺血模型應包括但不限于線栓MCAO永久缺血和缺血再灌注模型、光照致化學損傷皮層永久梗死模型和同種異體血栓MCAO模型。同種異體血栓MCAO模型建議使用老年大鼠。在上述模型中，至少有一種模型使用雌性大鼠復制在雄性大鼠的實驗結果。如果受試藥物擬用于心臟手術等導致全腦缺血的臨床適應證時，應增加1個4VO全腦缺血再灌注模型。

3.2 藥物劑量組設置和樣本量

對于急性期藥效學的量效關系研究，至少按等比設高、中、低3個劑量組，另設1個陽性藥組，1個溶劑對照組，1個假手術組，可供統(tǒng)計的樣本量每組＞12只（假手術組10只）。對于遠期藥效學，由于工作量巨大，尤其認知及運動功能的行為學測定，組數太多很難保證個體間的一致性，一般選擇一個急性期的有效劑量即可，另設1個陽性藥組，1個溶劑對照組，1個假手術組，可供統(tǒng)計的樣本量每組＞15只（假手術組10只）。但遠期藥效至少有1個模型需反映量-效關系，設兩個以上的給藥組。

3.3 治療時間窗

臨床前的急性期藥效學評價必須有一個治療時間窗試驗，選擇一個有效劑量，在腦缺血后不同時間點開始給藥治療，一般選擇腦缺血后2、4、6 h開始治療。對于需要評價更寬時間窗的藥物，可以另行設計時間點。

3.4 給藥途徑

應嚴格按照擬推薦臨床的給藥途徑進行動物試驗，靜脈滴注的藥物可以用靜脈注射替代，但至少有一個模型要用靜脈滴注給藥。靜脈注射或滴注的藥物不能用腹腔注射或其他注射途徑替代。

3.5 永久性缺血和缺血再灌注

鑒于臨床上腦缺血再灌注比例較低，在模型選擇時尤其要重視永久性腦缺血，但至少要有一種缺血再灌注模型。

3.6 遠期藥效

遠期神經功能評價和影像學評價是臨床上卒中藥物治療效果的關鍵指標，因此臨床前必須進行遠期藥效學研究，觀察時間不少于4周，觀察指標包括學習記憶能力、運動功能、梗死體積、死亡累積曲線等。建議優(yōu)先使用小動物核磁成像測定遠期藥效的梗死體積。至少需要兩種模型能反映遠期藥效。

3.7 藥動學-藥效學相關性

為了反映藥物作用的特異性，應選擇一個急性缺血卒中模型，使用1～2個有效劑量，同時測定腦組織的藥物濃度和藥動學參數，建立藥動學-藥效學的相關性。

3.8 陽性藥對照

臨床前藥效學研究必須設陽性對照藥組，陽性藥首選有相同或相似作用機制的商品化藥物，如果沒有相同或相似作用機制的商品化藥物，可選擇有相同作用機制的國際公認的模型藥物，即這種對照藥雖然沒有商品化，但已被大量實驗室作為工具藥物使用。如果也沒有模型藥物，可使用臨床大量使用的同一適應證的商品化藥物。

3.9 溶劑對照

溶劑對照組使用的溶劑，必須是擬在臨床試驗時使用的制劑的溶劑，不能改變溶劑組成和配制方法。

3.10 動物品系

4VO全腦缺血模型應選用Wistar大鼠，其他模型選用SD大鼠，小鼠最好選用C57BL/6J或其他品系純的品種，不建議使用昆明種或ICR小鼠。

3.11 分組原則

①隨機原則：按照機遇均等的原則進行分組，其目的是使一切干擾因素造成的實驗誤差減少，而不受實驗者主觀因素或其他偏性誤差的影響，將動物隨機分配到實驗組與對照組。②對照原則：實驗過程中需要包含陽性對照組（標準對照品或陽性藥）和陰性對照組（給予不含藥物的溶媒）。③重復原則：在相同的條件下，多中心或多個實驗室可重復出相似的結果。④雙盲原則：雙盲實驗是一種更為嚴格的實驗方法，旨在消除可能出現在實驗者和參與者意識當中的主觀偏差和個人偏好。在雙盲實驗中，由設盲者負責動物的分組和受試藥物的配制，實驗者和參與者都不知道具體的分組情況及給藥情況，只有在所有數據被記錄完畢之后，由設盲者進行揭盲。

3.12 麻醉劑

卒中動物模型制備過程中使用甲氧氟烷或異氟烷等吸入麻醉，不建議使用水合氯醛等注射麻醉。

3.13 動物福利

動物試驗者必須有動物操作上崗合格證，動物處死必須在麻醉下進行，動物試驗操作需盡量減少動物的痛苦，動物尸體處理按所在單位的規(guī)定執(zhí)行。

結束語：這是第一次推出卒中臨床前評價指南，雖然中國卒中學會轉化醫(yī)學分會在一年多的時間里做了大量工作，但由于理論和技術方面的限制，該指南在諸多方面未臻完善，隨著在推廣過程中遇到的新問題，以及在卒中領域技術的新進展，還要不斷修訂。

[1] 楊國源，金坤林. 實驗卒中手術學[M]. 北京：中國科學技術出版社，2012：112-237.

[2] SUGHRUE M E，MOCCO J，KOMOTAR R J，et al.An improved test of neurological dysfunction following transient focal cerebral ischemia in rats[J]. J Neurosci Methods，2006，151（2）：83-89.

[3] CLARKSON A N，HUANG B S，MACISAAC S E，et al. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke[J]. Nature，2010，468（7321）：305-309.

[4] BOUET V，BOULOUARD M，TOUTAIN J，et al. The adhesive removal test：a sensitive method to assess sensorimotor de fi cits in mice[J]. Nat Protoc，2009，4（10）：1560-1564.

[5] HUA Y，SCHALLERT T，KEEP R F，et al. Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat[J]. Stroke，2002，33（10）：2478-2484.

[6] YANG F，WANG Z，ZHANG J H，et al. Receptor for advanced glycation end-product antagonist reduces blood-brain barrier damage after intracerebral hemorrhage[J]. Stroke，2015，46（5）：1328-1336.

[7] LINDAU N T，B?NNINGER B J，GULLO M，et al.Rewiring of the corticospinal tract in the adult rat after unilateral stroke and anti-Nogo-A therapy[J]. Brain，2014，137（Pt 3）：739-756.

[8] LI H，COLBOURNE F，SUN P，et al. Caspase inhibitors reduce neuronal injury after focal but not global cerebral ischemia in rats[J]. Stroke，2000，31（1）：176-182.

[9] ZHANG L，ZHANG R L，JIANG Q，et al. Focal embolic cerebral ischemia in the rat[J]. Nat Protoc，2015，10（4）：539-547.

[10] ARDIZZONE T D，ZHAN X，ANDER B P，et al.SRC kinase inhibition improves acute outcomes after experimental intracerebral hemorrhage[J]. Stroke，2007，38（5）：1621-1625.

[11] NANRI K，MONTéCOT C，SPRINGHETTI V，et al.The selective inhibitor of neuronal nitric oxide synthase，7-nitroindazole，reduces the delayed neuronal damage due to forebrain ischemia in rats[J]. Stroke，1998，29（6）:1248-1253.