董雯,王擁軍
中國(guó)卒中發(fā)病率和患病率在過(guò)去30年呈上升趨勢(shì),我國(guó)仍是世界上腦血管疾病負(fù)擔(dān)第一大國(guó)[1]。其中缺血性卒中占卒中發(fā)病率的87%左右[2]。但是,目前對(duì)于急性缺血性卒中的治療,除美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA),尚無(wú)其他有效的神經(jīng)保護(hù)劑進(jìn)入臨床。rt-PA由于其嚴(yán)格的時(shí)間窗以及出血轉(zhuǎn)化等風(fēng)險(xiǎn),發(fā)達(dá)國(guó)家僅有不到5%的缺血性卒中患者能受益[3]。因此,明確急性缺血性卒中損傷的分子機(jī)制,篩選出缺血性卒中后具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用的新干預(yù)靶點(diǎn),具有重大的社會(huì)效益和科學(xué)價(jià)值。
腦組織細(xì)胞中,星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)、支持和信息傳遞,而且其終足包繞微血管內(nèi)皮細(xì)胞,是連接神經(jīng)元和微血管的重要中介,其在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的作用也逐漸受到關(guān)注[4]。本研究通過(guò)分析小鼠基因芯片結(jié)果,探尋急性腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號(hào)通路,擬篩查腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中的新干預(yù)靶點(diǎn),為腦缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)劑的開(kāi)發(fā)提供新的思路。
1.1 材料 美國(guó)基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠腦組織分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片(Affymetrix Gene Chip Mouse Genome 430 2.0 Arrays)數(shù)據(jù)共8張,GEO編號(hào)為GSE35338。將8只醛脫氫酶1家族l1-綠色熒光蛋白(Aldehyde dehydrogenase 1 family member l1-Green Fluorescent Protein,Aldh1l1-GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠分為腦缺血再灌注模型組(腦缺血1 h再灌注24 h)和假手術(shù)組,每組各4只。利用線(xiàn)栓法制作小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,腦缺血1 h后將線(xiàn)栓從頸內(nèi)動(dòng)脈拔出實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組不插入線(xiàn)栓,其余操作同缺血再灌注組。再灌注24 h后,處死并取材腦組織,應(yīng)用2’3’5’-氯化三苯基四氮唑(2’3’5’-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色驗(yàn)證腦缺血再灌注模型成功。取腦缺血再灌注模型組缺血側(cè)和假手術(shù)組腦組織皮層,木瓜酶消化后,得到單細(xì)胞懸液,應(yīng)用熒光激活細(xì)胞分離儀(fluorescence activated cell sorter,F(xiàn)ACS)篩選的GFP陽(yáng)性細(xì)胞即為星形膠質(zhì)細(xì)胞。
每組芯片各4張。該芯片可檢測(cè)34 000個(gè)小鼠基因,較完整地覆蓋了小鼠全基因組表達(dá)譜。
1.2 差異基因的篩選 應(yīng)用隨機(jī)方差模型(random variance model,RVM)t檢驗(yàn)方法,對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,通過(guò)計(jì)算兩組間基因差異的顯著性水平(P)和差異倍數(shù)(fold change)篩選兩組間表達(dá)水平有差異的基因。根據(jù)P<0.05、fold change≥2進(jìn)行篩選,得到差異基因。
1.3 信號(hào)通路分析(pathway analysis) 應(yīng)用京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行系統(tǒng)化分析,通過(guò)自適應(yīng)線(xiàn)性向上(adaptive linear step up,ALSU)的方法控制假發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR),分析具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路。
1.4 核心信號(hào)通路的篩選 基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中各信號(hào)通路的上下游關(guān)系,構(gòu)建信號(hào)通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖即信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(pathway relation network,Path-net),分析參與腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的核心信號(hào)通路。度(Degree)值越大代表信號(hào)通路越靠近網(wǎng)絡(luò)圖的中心,即越核心。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 依據(jù)P<0.05且fold change≥2的標(biāo)準(zhǔn),采用RVMt檢驗(yàn)法篩選腦缺血再灌注組與假手術(shù)組間的顯著差異表達(dá)基因。應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)目標(biāo)基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行顯著性分析,按照P<0.05進(jìn)行篩選,得到顯著性的信號(hào)通路。
2.1 急性局灶性腦缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中差異表達(dá)基因的篩選 通過(guò)對(duì)芯片數(shù)據(jù)分析,共篩選出1966個(gè)在急性局灶性腦缺血再灌注后差異表達(dá)的基因,其中表達(dá)上調(diào)的基因有1210個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因有756個(gè)。急性腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中,表達(dá)上調(diào)5倍以上的基因有208個(gè);表達(dá)下調(diào)5倍以上的基因有6個(gè)。
根據(jù)芯片數(shù)據(jù)分析的結(jié)果,對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞中差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析,以得到差異基因的聚類(lèi)圖(圖1)。8例樣本被分為2組,前4列為腦缺血再灌注組,后4列為假手術(shù)組。應(yīng)用不同顏色區(qū)分差異表達(dá)基因在腦缺血再灌注組與假手術(shù)組間的表達(dá)情況。腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比,紅色表示基因表達(dá)上調(diào);綠色表示基因表達(dá)下調(diào)。由聚類(lèi)分析圖可見(jiàn)紅色和綠色形成顯著的4個(gè)部分,并且同一基因在同組內(nèi)表達(dá)情況相對(duì)一致,不同組間的基因表達(dá)存在明顯不同的聚類(lèi)群。
2.2 急性局灶性腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中的核心信號(hào)通路 對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組間差異基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析,按照P<0.05進(jìn)行篩選,得到154個(gè)差異表達(dá)的信號(hào)通路。通過(guò)信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(pathway relation network,Path-net),根據(jù)Degree值由大到小排序,初步篩選出15條關(guān)鍵信號(hào)通路。其中,絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK)信號(hào)通路的Degree值為34,在所有信號(hào)通路中的Degree值最大,其次為凋亡(apoptosis)、細(xì)胞周期(cell cycle)、p53信號(hào)通路(表1)。以MAPK信號(hào)通路為核心的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示。
2.3 腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中起重要調(diào)節(jié)作用的基因 本研究進(jìn)一步分析了MAPK、p53信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的差異基因。MAPK信號(hào)通路中的差異基因有31個(gè);p53信號(hào)通路中有19個(gè)差異基因。對(duì)MAPK和p53信號(hào)通路的50個(gè)差異基因按照P值進(jìn)行排序,以選擇在星形膠質(zhì)細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的基因。P值最小的兩個(gè)基因分別為細(xì)絲蛋白c(filamin,F(xiàn)lnc)和細(xì)胞周期蛋白d1(cyclin-dependent kinases,Ccnd1)(表2)。
圖1 差異基因聚類(lèi)分析圖
表1 腦缺血再灌注后星型膠質(zhì)細(xì)胞中15條關(guān)鍵信號(hào)通路
本研究對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注組星形膠質(zhì)細(xì)胞中有1966個(gè)差異表達(dá)基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)5倍以上的基因有208個(gè),遠(yuǎn)多于6個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。該結(jié)果提示,腦缺血再灌注激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中大量基因異常高表達(dá)。
信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)傳遞“信息”的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò),它通過(guò)蛋白質(zhì)間的相互作用影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。對(duì)差異基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了MAPK信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、凋亡、細(xì)胞周期是在腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路。以往的研究表明,MAPK信號(hào)通路在許多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用,如增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡、自噬和存活[5]。而且,MAPK信號(hào)通路在腦缺血損傷中的作用逐漸受到關(guān)注[6]。
本研究通過(guò)對(duì)信號(hào)通路中差異基因的P值進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)編碼CyclinD1的基因Ccnd1的P值(0.000 046)最小。CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子,促進(jìn)細(xì)胞周期正向進(jìn)行。已有研究表明,腦缺血后,腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)水平上調(diào)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致腦缺血損傷[7-9]。
圖2 腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)
表2 MAPK和p53信號(hào)通路中的差異基因
由Flnc基因編碼的細(xì)絲蛋白C(Filamin C),常表達(dá)于肌肉組織[10-11];但也有研究發(fā)現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)[12-13]。MASAYO等[14]的研究表明,F(xiàn)ilamin C在膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯升高,且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的分級(jí)程度相關(guān)。另外,細(xì)絲蛋白除與胞內(nèi)多種骨架蛋白結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞骨架作用之外,還與其他許多信號(hào)分子和受體結(jié)合,傳遞胞內(nèi)信號(hào),促使細(xì)胞遷移和黏附[15],但是其在腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,F(xiàn)lnc是腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)程中的關(guān)鍵差異基因,推測(cè)其可能成為保護(hù)腦缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)。
本研究結(jié)果對(duì)于深入探索腦缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子機(jī)制、尋找神經(jīng)保護(hù)新靶點(diǎn),提供了一定的研究基礎(chǔ)。由于本文結(jié)論是基于小樣本數(shù)據(jù)分析得到的結(jié)果,后續(xù)需要增加樣本量或者在細(xì)胞、小動(dòng)物水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外,F(xiàn)lnc參與腦缺血再灌注損傷的機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探究。
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