易栓癥與反復胚胎種植失敗的相關(guān)性研究

倪亞莉，鄧偉

(甘肅省婦幼保健院，蘭州 730050)

易栓癥是指存在抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等遺傳性或獲得性缺陷而具有高血栓栓塞傾向的一種疾病狀態(tài)。既往研究提示易栓癥與IVF胚胎反復種植失敗(IVF-RIF)有一定關(guān)聯(lián)[1-2]，因此有學者提出對IVF-RIF患者在胚胎種植前進行易栓癥相關(guān)檢查，異常者可及早給予預防性抗凝治療[3]。但目前國內(nèi)有關(guān)易栓癥與IVF-RIF關(guān)系的研究尚少?，F(xiàn)以此為切入點，通過對易栓標志物的篩查，探尋適宜于臨床檢測的易栓癥高危指標，為IVF-RIF患者診治提供實驗依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

采用病例-對照研究方法，隨機抽取2010年3月至2016年10月就診于我院生殖中心的90例RIF患者作為病例組，以成組匹配方式選取90例同期就診的首次胚胎移植即成功妊娠的不孕癥患者做為對照組。參照文獻[3]確定病例組及對照組入選條件：(1)不孕原因為輸卵管因素；(2)卵巢儲備功能檢測正常(月經(jīng)周期第2～5日FSH≤10 U/L，F(xiàn)SH/LH<2，雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)目≥6)；(3)夫婦雙方染色體核型正常；(4)無先天及/或后天獲得性子宮異常；(5)RIF為實施3次移植，移植至少4個優(yōu)質(zhì)胚胎而不能獲得妊娠者；(6)無內(nèi)分泌、自身免疫性疾病及感染性疾?。?7)無不良生活方式(酗酒、吸煙等)，年齡在20～39歲之間。上述標本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準及受檢者知情同意。

二、實驗材料與研究方法

參照《2012年易栓癥診斷中國專家共識》[4]及既往研究結(jié)果[5]，我們確定亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T、抗凝蛋白缺陷(抗凝血酶、蛋白S、蛋白C)為遺傳性易栓癥篩查指標；抗心磷脂抗體(ACL-IgG/IgM)、抗β2糖蛋白I抗體(抗β2-GPI)為獲得性易栓癥篩查指標。

1.抗凝血酶、蛋白S與蛋白C檢測：所有對象于清晨空腹抽取肘靜脈血2.7 ml，置于含0.3 ml的109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，抗凝劑與靜脈血充分混勻。以1 500×g離心15 min，血漿分離置于-80℃冰箱中備檢；檢測前0.5 h將標本置于37℃水浴中復融?？鼓?AT-Ⅲ)采用發(fā)色底物法，蛋白S與蛋白C活性檢測采用凝固法，采用日本Sysmex CA-7000全自動血凝分析儀，上海德靈公司試劑，同時用配套質(zhì)控品進行質(zhì)控?？鼓?、蛋白S、蛋白C任意一項活性低于正常參考值，認為存在抗凝蛋白缺陷。

2.ACL-IgG/IgM及抗β2-GPI檢測：均空腹采集枸櫞酸抗凝靜脈血4.5 ml，離心取血清-80℃凍存待檢；檢測前0.5 h將標本置于37℃水浴中復融。ACL-IgG/IgM及抗β2-GPI采用酶聯(lián)免疫吸附法，采用美國寶特酶標儀，ACL試劑由浙江伊利康生物科技公司提供，抗β2-GPI試劑由北京歐蒙公司提供，操作及結(jié)果判定按照試劑盒說明進行。

3.MTHFR C677T多態(tài)性檢測：采用基因測序分析方法。采集靜脈血2 ml，EDTA抗凝處理，用血液基因組DNA 提取試劑盒(QIAGEN，美國)提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆?，檢測前室溫溶化。PCR引物序列(上海生工公司合成)設計：

上游引物：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′；

下游引物：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。

PCR擴增反應：體積25 μl，2×PCR Mix 緩沖液12.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，模板2 μl，滅菌蒸餾水9.5 μl。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火(65℃)30 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次；72℃終末延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

基因測序：采用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN，美國)純化后，進行測序PCR反應：體積為10 μl，分別加入3 μl的純化PCR產(chǎn)物、0.5 μl測序引物(10 μmol/L)、4.5 μl H2O、2 μl BigDye Terminator v3.1稀釋液(5×Sequencing buffer 400 μl和1×BigDye Terminator v3.1 100 μl)。反應條件為：96℃ 2 min；(96℃ 10 s，50℃ 10 s，60℃ 10 s)30個循環(huán)；4℃保存。對測序PCR反應產(chǎn)物進行醋酸鈉/乙醇法純化后，每個樣本加10 μl的甲酰胺，94℃ 加熱4 min后放置冰上5 min，在ABI genetic analyzer 3530xl(ABI，美國)上進行毛細管電泳。電泳結(jié)束后使用chromas和BLAST軟件進行結(jié)果分析。

三、統(tǒng)計學分析

應用Excel 2013記錄整理病例各項資料，運用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組間基線資料比較采用t檢驗，易栓指標陽性率比較應用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Cramer V值檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組基本資料

兩組患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)激素水平(FSH、LH、T)比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

二、易栓癥與反復胚胎種植失敗的相關(guān)性分析

1. MTHFR基因C677T多態(tài)性與RIF相關(guān)性分析：調(diào)查人群基因型頻數(shù)分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=0.584，P>0.05)，具有群體代表性。MTHFR基因C677T多態(tài)性共有C/C、C/T型和T/T型3種基因型，測序結(jié)果見圖1，各種基因型分布見表2；基因型T/T在病例組(43.3%)顯著高于對照組(23.3%)(P<0.05)；對上述資料進行相關(guān)性分析，Cramer V值為0.574(P<0.05)，提示MTHFR的TT基因型與RIF的發(fā)生相關(guān)。

表1 患者一般情況(-±s)

圖1 MTHFR 基因C677T多態(tài)性三種不同基因型測序結(jié)果

組別病例數(shù)C/CC/TT/T病例組9019(21.1)32(35.6)39(43.3)*對照組9028(31.1)41(45.6)21(23.3)

注：與對照組比較，*P<0.05

2．抗凝蛋白缺陷與RIF相關(guān)性分析：病例組與對照組蛋白S活性、蛋白C活性、抗凝血酶活性均無顯著差異(P>0.05)。對上述資料進行相關(guān)性分析，Cramer V值為0.238(P>0.05)，提示抗凝蛋白缺陷與RIF發(fā)生無顯著相關(guān)(見表3)。

表3 病例組與對照組抗凝蛋白缺陷發(fā)生率比較[n(%)]

3. 抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白I抗體陽性率與RIF相關(guān)性分析：病例組與對照組ACL-IgG/IgM陽性率、抗β2-GPI陽性率均無顯著差異(P>0.05)。對上述資料進行相關(guān)性分析，Cramer V值為0.335(P>0.05)，提示抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白I抗體與RIF發(fā)生無顯著相關(guān)(表4)。

表4 病例組與對照組抗磷脂綜合癥發(fā)生率比較[n(%)]

討 論

胚胎反復種植失敗(RIF)一直是IVF-ET助孕治療過程中的難點，有研究發(fā)現(xiàn)易栓癥可影響胚胎成功種植，認為易栓癥患者子宮內(nèi)膜血管易形成微小血栓，導致其容受性紊亂，致使胚胎著床障礙或者著床后胎盤循環(huán)建立不良而導致種植失敗率增加[6]。根據(jù)《2012年易栓癥診斷中國專家共識》[4]建議，易栓癥分為遺傳性和獲得性兩種類型。遺傳性易栓癥包括抗凝蛋白缺陷、凝血因子缺陷、纖溶蛋白缺陷、代謝酶缺陷及凝血因子水平升高，而獲得性易栓癥則主要與抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白I抗體相關(guān)。

國外關(guān)于遺傳性易栓癥與RIF的關(guān)系報道不一，Bellver等[7]發(fā)現(xiàn)，與正常生育婦女相比較，凝血因子缺陷發(fā)生率在RIF組中顯著增高。Martinez-zamora等[8]發(fā)現(xiàn)，與正常生育婦女及首次IVF-ET成功患者相比較，RIF組纖溶蛋白缺陷發(fā)生率顯著高于其他兩組。相關(guān)系統(tǒng)評價發(fā)現(xiàn)抗凝蛋白缺陷、代謝酶缺陷與RIF均無顯著關(guān)聯(lián)，凝血因子缺陷與RIF顯著相關(guān)[2]。但遺傳性易栓癥具有地域和種族的不同性，我國人群最常見的遺傳性易栓癥是抗凝蛋白(主要包括抗凝血酶、蛋白C和蛋白S)缺陷。抗凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，主要作用于凝血酶及因子Xa而發(fā)揮其抗凝活性；蛋白C在被激活形成活化蛋白C后可滅活血漿中的凝血因子Ⅴa和Ⅷa，蛋白S是其重要的輔助因子。本研究發(fā)現(xiàn)抗凝蛋白缺陷與RIF發(fā)生無明顯相關(guān)，與既往報道一致。代謝酶缺陷即高同型半胱氨酸血癥(MTHFR多態(tài)性)亦屬于遺傳性易栓癥的一種，我們前期研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T位點的T/T基因型在復發(fā)性自然流產(chǎn)組(41.2%)高于正常對照組(26%)，是復發(fā)性自然流產(chǎn)的高危因素[5]，在本研究中亦發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性與RIF之間存在顯著相關(guān)，推測MTHFR基因C677T位點T/T基因型時酶活性降低，不能有效地促進同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，導致高同型半胱氨酸血癥，造成微血管內(nèi)皮損傷和功能異常，破壞機體凝血和纖溶系統(tǒng)，影響胚胎著床。抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白I抗體為獲得性易栓癥篩查指標，研究發(fā)現(xiàn)抗心磷脂抗體可使免疫平衡紊亂、補體系統(tǒng)過度激活，導致胎盤微血栓形成[9-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)RIF患者抗心磷脂抗體顯著增高[12]，推測可能與RIF存在一定關(guān)聯(lián)。但在本研究中，未發(fā)現(xiàn)抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白I抗體與RIF存在顯著關(guān)聯(lián)。

有研究發(fā)現(xiàn)抗凝治療可通過預防子宮內(nèi)膜微小血栓形成從而改善子宮內(nèi)膜的容受性，提高種植成功率[14]。Qublan等[15]納入83例≥3次種植失敗的易栓癥患者，隨機分為治療組(依諾肝素)與對照組(安慰劑組)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組種植成功率(20.9% vs.6.1%，P<0.001)及活產(chǎn)率(23.8% vs.2.8%，P<0.05)顯著高于對照組；Potdar等[16]發(fā)現(xiàn)低分子肝素治療組較對照組(安慰劑組)活產(chǎn)率顯著增高，流產(chǎn)率顯著降低，但種植率在兩組間無顯著差異。目前缺乏大樣本隨機對照試驗等循證醫(yī)學證據(jù)的支持，尚無足夠的證據(jù)表明對合并有易栓癥的RIF患者常規(guī)應用抗凝治療可以提高其胚胎種植率。

綜上所述，遺傳性或獲得性易栓癥可能在一定程度上干擾凝血-纖溶系統(tǒng)平衡，使凝血功能相對增強，導致胎盤微循環(huán)障礙，阻礙胚胎種植。MTHFR C677T多態(tài)性可能與RIF的發(fā)生有關(guān)，可作為本地區(qū)IVF患者的易栓癥篩查指標，預防性抗凝治療在一定程度上可能增加胚胎種植成功率。

[1] 倪亞莉，鄧偉，張霖.抗磷脂抗體與體外受精-胚胎移植結(jié)局的Meta分析[J].生殖醫(yī)學雜志，2014，23：619-623.

[2] 鄧偉，倪亞莉，楊杰，等.遺傳性易栓癥與不明原因反復種植失敗關(guān)系的系統(tǒng)評價[J].生殖醫(yī)學雜志，2015，24：214-219.

[3] 祁靜，臘曉琳.反復種植失敗的相關(guān)對策新進展[J].生殖與避孕，2014，34：149-154.

[4] 中華醫(yī)學會血液學分會血栓與止血學組.易栓癥診斷中國專家共識(2012年版)[J].中華血液學雜志，2012，33：982.

[5] 張慶華，郝勝菊，劉青，等.甘肅地區(qū)復發(fā)性自然流產(chǎn)與遺傳性易栓癥相關(guān)基因突變的關(guān)系研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23：27-34.

[6] Ricci G，Bogatti P，F(xiàn)ischer-Tamaro L，et al. Factor V Leiden and prothrombin gene G20210A mutation and in vitro fertilization：a prospective cohort study[J].Hum Reprod，2011，26：3068-3077.

[7] Bellver J，Soares SR，Alvarez C，et al.The role of thrombophilia and thyroid autoimmunity in unexplained infertility，implantation failureand recurrent spontaneous abortion[J]. Hum Reprod. 2008，23：278-284.

[8] Martinez-zamora MA，Creus M，Tassies D，et al.Reduced plasma fibrinolytic potential in patients with recurrent implantation failure after IVF and embryo transfer[J].Hum Reprod，2011，26：510-516.

[9] 辛虹，王立方，顓佳.抗磷脂抗體和產(chǎn)科疾病的關(guān)系[J].中國免疫學雜志，2011，27：382-384.

[10] 莫美蘭，梁佩燕，蔡靖，等.復發(fā)性流產(chǎn)患者抗心磷脂抗體和抗β2-GPI抗體的檢測與分析[J].生殖醫(yī)學雜志，2012，21：486-488.

[11] 王艷梅，凌國燦.抗磷脂綜合征與妊娠丟失的研究進展[J].生殖醫(yī)學雜志，2012，21：293-296.

[12] Hornstein MD，Davis OK，Massey JB，et al.Antiphospholipid antibodies and in vitro fertilization success：a meta-analysis[J].Fertil Steril，2000，73：330-333.

[13] Miyakis S，Lockshin MD，Atsumi T，et al.International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome(APS)[J].J Thromb Haemost，2006；4：295-306.

[14] Akhtar MA，Sur S，Raine-Fenning N，et al.Heparin for assisted reproduction：summary of a Cochrane review. Fertil Steril.2015，103：33-34.

[15] Qublan H，Amarin Z，Dabbas M，et al.Low-molecular-weight heparin in the treatment of recurrent IVF-ET failure and thrombophilia：a prospective randomized placebo-controlled trial[J].Hum Fertil，2008，11：246-253.

[16] Potdar N，Gelbaya TA，Konje JC，et al.Adjunct low-molecularweight heparin to improve live birth rate after recurrent implantation failure：a systematic review and meta-analysis[J].Human Reprod Update，2013，19：674-684.