楊旭 韓峰 向英 王菊容 陳雪梅 白玉芹(通訊作者)
(仁壽縣婦幼保健院兒???四川 眉山 620020)
先天性耳聾是目前我國新生兒最常見的先天性缺陷之一,發(fā)病率約為0.1~0.3%,且部分地區(qū)呈明顯上升趨勢,引起人們的關注和重視[1]。目前研究認為[2],先天性耳聾可由環(huán)境因素、基因突變等原因?qū)е?,其?0%的兒童期耳聾認為和遺傳等因素有關。因此對新生兒進行耳聾篩查尤為重要。本文對我院新生兒采用耳聾基因芯片法進行篩查,分析仁壽縣新生兒常見耳聾基因突變的位點分布情況,現(xiàn)報道如下。
本次選取958例2016年1月至2012年12月期間在我院行常規(guī)耳聾基因檢測的新生兒作為研究對象,采取新生兒足跟血提取DNA。所有研究對象均經(jīng)家屬同意并簽字入組研究。被檢測DNA組符合100~200ng/ul,純度D(260)/D(280)=1.7~2.0。
1.2.1 主要試劑 由深圳華大基因有限公司提供的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒。洗液配置:洗滌液I(0.3×SSC,0.1%SSD);洗滌液II(0.06×SSC)。雜交緩沖液,雜交芯片。
1.2.2 PCR擴增 PCR反應體系為20ul,每個DNA分別配置A、B反應體系。A:12.5ul引物混合物A1,4.5ul引物混合物A2,3.0ul模板DNA。B:12.5ul引物混合物B1,4.5ul引物混合物B2,3.0ul模板DNA。
1.2.3 PCR擴增步驟 在37℃下預變10min,95℃下預變15min,96℃下預變1min。之后94℃下30s,55℃下30s,72℃下45s為一個循環(huán),共進行32個循環(huán)。72℃下45s,60℃下10min。94℃到55℃速率為0.4℃/s,55℃至70℃速率為0.2℃/s。
1.2.4 雜交 PCR產(chǎn)物95℃下變性5min,放入冰水混合物冰浴3min。將雜交緩沖液加入融化(50℃),分為10ul每份,相同樣品模板A、B體系各取2.5ul產(chǎn)物,加入各個雜交緩沖液中,混勻后加入芯片微陣列區(qū)域,封閉后放置于50℃水浴中1h。
1.2.5 洗片 分別將洗滌劑I和II在42℃下進行混勻,80r/min。取出芯片后分別加入洗滌劑I和II,每加入一種均在80r/min下震蕩搖勻,洗滌2次。甩干后采用微陣列芯片法進行檢測,以晶芯LuxScanTM 10K-B微陣列芯片進行掃描。
所有研究對象中檢測GJB2基因突變頻率為2.8%,SLC26 A4基因突變頻率為2.1%。12S rRNA基因突變頻率為0.1%。
其中GJB2基因以235 del C位點最為常見,SLC26 A4基因以IVS 7-2 A>G位點突變最為常見,均高于其他基因位點的突變率,P<0.05。見表1。
表1 耳聾基因突變在新生兒人群中的分布情況
聽力是人體五大感官之一,與語言能力息息相關。據(jù)研究顯示[3],通過早期診斷和干預聽力障礙兒童可有效提高患兒的語言水平。流行病學顯示不同地區(qū)的耳聾突變基因不同,多數(shù)是有GJB2基因突變導致,占耳聾基因突變患兒的20%以上,另一部分是由線粒體DNA 12S rRNA 1555 A>G突變引起,占耳聾患兒的10%左右。還有部分地區(qū)主要由SLC26 A4基因突變引起,占到耳聾患兒的9%左右。因此針對部分地區(qū)耳聾患兒基因突變的研究,可有效制定篩查方式,從而提高耳聾的早期診斷率。
GJB2是常見的耳聾突變基因之一,在本文研究中顯示,仁壽縣兒童通過篩查,其中GJB2基因突變頻率高達2.8%,其中以235 del C位點突變?yōu)橹?,?.0%,可見GJB2基因突變是仁壽縣患兒最常見的基因突變之一,其中以235 del C位點突變?yōu)橹鳌LC26 A4屬于離子轉(zhuǎn)運體家族,認為在耳聾中是僅次于GJB2突變的基因。
綜上所述,仁壽縣新生兒人群中GJB2、SLC26 A4基因突變率較高,GJB2基因以235 del C位點突變率最高,SLC26 A4基因以IVS 7-2 A>G位點突變率最高。
[1]呂康模,熊業(yè)華,俞皓等.17000名新生兒遺傳性耳聾基因突變篩查[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2014,31(5):547-552.
[2]唐軍,胡敏,蘇艷等.518例新生兒聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查結(jié)果分析[J].聽力學及言語疾病雜志,2017,25(2):197-200.
[3]相麗麗,林倩,聶文英等.濟南市部分新生兒聽力和耳聾基因聯(lián)合篩查結(jié)果分析[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2015,50(5):401-405.