骨折后深靜脈血栓形成患者的內(nèi)源性抗凝能力評價

蘇玉，趙潔，吳俊

(1.北京積水潭醫(yī)院檢驗科，北京 100035；2.北京大學人民醫(yī)院檢驗科，北京 100044)

·臨床實驗研究·

骨折后深靜脈血栓形成患者的內(nèi)源性抗凝能力評價

蘇玉1，趙潔2，吳俊1

(1.北京積水潭醫(yī)院檢驗科，北京 100035；2.北京大學人民醫(yī)院檢驗科，北京 100044)

目的觀察骨折后下肢深靜脈血栓形成(DVT)患者的內(nèi)源性抗凝能力及其在DVT形成中的作用。方法選擇北京積水潭醫(yī)院骨折后下肢DVT患者95例作為DVT組，體檢健康者100例作為健康人對照組。收集患者術后第3天枸櫞酸鈉抗凝血漿標本，檢測纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)和D-二聚體(DD)；用Thrombopath發(fā)色底物顯色法檢測內(nèi)源性抗凝能力指標Protac凝血抑制率(PICI)；收集患者血清檢測高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。結(jié)果DVT組FDP、DD均高于健康人對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，DVT組PICI(%)低于健康人對照組(82.8±7.2 vs 87.8±3.6,P<0.01)；DVT組≥65歲患者較<65歲患者PICI下降約4.8%(P<0.05)；當PICI的cut-off值為84.2%時，卡方檢驗顯示，DVT與健康人對照組PICI陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；相關性分析顯示PICI與FDP、DD呈負相關，與HDL-C呈正相關(r分別為-0.318、-0.336和0.284，P均<0.01)；Logistic回歸分析顯示PICI是靜脈血栓的危險因素，OR值為1.243(P<0.01)。結(jié)論骨折后血栓患者的內(nèi)源性抗凝能力降低。

內(nèi)源性抗凝能力；深靜脈血栓；骨折；Protac凝血抑制率

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是骨科患者的嚴重并發(fā)癥[1-2]。根據(jù)北京積水潭醫(yī)院血管外科的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，創(chuàng)傷性DVT發(fā)病率高達43.2%[3]。DVT發(fā)病原因復雜，人體內(nèi)源性抗凝系統(tǒng)功能異常會增加靜脈血栓的發(fā)生風險[4-5]。目前，常用的DVT實驗室檢查指標有D-二聚體(D-dimer，DD)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation products，F(xiàn)DP)等[6-8]，而內(nèi)源性抗凝檢查的實驗成本較高[9]，尚缺乏能全面有效地評價患者內(nèi)源性抗凝能力的獨立的實驗室指標。

HemosIL Thrombopath試劑是一種新的評價內(nèi)源性抗凝功能的商品化檢測試劑，將患者血漿分為2份，一份加入促凝試劑以激活凝血酶，另一份加入促凝試劑和蛇毒提取物Protac試劑以激活內(nèi)源性抗凝過程；2份血漿分別通過自動化血凝分析儀檢測吸光度并計算Protac引起的凝血抑制率(protac-induced coagulation inhibition percentage，PICI)。目前國內(nèi)外尚未見用HemosIL Thrombopath試劑檢測骨折血栓患者內(nèi)源性抗凝能力的報道，本研究用病例對照研究評價骨折血栓患者內(nèi)源性抗凝能力，并分析其臨床意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2016年5月至2017年5月于北京積水潭醫(yī)院血管外科就診的下肢骨折后DVT患者95例(DVT組)，入組標準為：曾于7日內(nèi)發(fā)生下肢骨折，于北京積水潭醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手術治療，術前經(jīng)靜脈血管造影確診DVT、使用低分子量肝素抗凝治療，術后使用利伐沙班抗凝治療，由于華法林對內(nèi)源性抗凝能力存在影響，故嚴格排除曾使用華法林的患者。DVT組男45例，女50例，年齡21～87歲，中位年齡為61歲，股骨骨折43例，脛腓骨骨折24例，膝關節(jié)骨折15例，踝關節(jié)骨折10例，多發(fā)骨折3例。選取同期于北京積水潭醫(yī)院社區(qū)保健科就診的性別、年齡相匹配的體檢健康者100例(健康人對照組)，無血栓病史，無抗凝藥物治療史，其中男57例，女43例，年齡36～81歲，中位年齡60歲。2組年齡、性別比差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

1.2標本采集和處理 骨科手術后3 d采集DVT組患者靜脈血，抽血前曾使用利伐沙班常規(guī)抗凝治療。采集DVT組患者靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，用于內(nèi)源性抗凝能力、FDP和DD檢測。枸櫞酸鈉抗凝血在室溫下以2 000×g離心10 min，即刻檢測FDP和DD；隨后2 h內(nèi)分離血漿，-80 ℃凍存，用于后續(xù)的內(nèi)源性抗凝能力檢測，在檢測前，37 ℃水浴融解凍存的血漿標本。采集DVT組患者靜脈血于分離膠真空采血管，室溫下靜置15 min，2 000×g離心10 min分離血清，即刻檢測高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。

1.3主要儀器和試劑 ACL-TOP 500型血凝分析儀(美國Werfen公司)和HemosIL Thrombopath發(fā)光底物顯色試劑(美國HemosIL公司)用于內(nèi)源性抗凝能力PICI檢測；CS-2100型血凝分析儀(日本Sysmex公司)及FDP(日本積水公司)及DD(德國西門子公司)試劑用于FDP和DD檢測。7180型全自動生化分析儀(日本日立公司)和HDL-C試劑(北京柏定公司)用于HDL-C檢測。

1.4PICI、FDP、DD和HDL-C的檢測 在滿足質(zhì)量控制規(guī)則的條件下，用發(fā)光底物顯色法檢測PICI：將血漿標本稀釋后分裝入2個反應杯，分別加入激活物A(含有蛇毒提取物Protac)和激活物B(不含Protac)；37 ℃孵育，同時檢測2個反應杯的A值(ThP-A和ThP-B)，單位為吸光度變化/分鐘(mAbs/min)，PICI=(ThP-A-ThP-B)/ThP-B×100%。用膠乳免疫比濁法檢測FDP，用顆粒增強免疫比濁法檢測DD，用直接法-過氧化氫酶清除法檢測HDL-C。

2 結(jié)果

2.1健康人和骨折后DVT患者的內(nèi)源性抗凝能力評價 DVT組與健康人對照組FDP(μg/mL)分別為11.8(6.8，16.7)和1.2(1.1，1.5)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，DD(mg/L FEU)分別為4.59(2.43，7.53)和0.24(0.15，0.37)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

健康人對照組和DVT組PICI(%)分別為87.8±3.6和82.8±7.2，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。DVT組內(nèi)源性抗凝能力平均降低約5.7%；健康人對照組和DVT組PICI的最高值幾乎一致，分別為94.6%和94.8%，而最低值分別為75.9%和45.4%。見圖1。

注：長線表示平均值，短線表示標準差，虛線表示cut-off值。

圖1 健康組與血栓組內(nèi)源性凝血能力PICI比較

根據(jù)HemosIL Thrombopath試劑盒說明書推薦和文獻報道[9]，用100例健康人的PICI平均值減1個標準差得到cut-off值，為84.2%，以此cut-off值作列聯(lián)表進行卡方檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=27.1，P<0.01)。DVT組PICI陽性患者為48%(46/95)，約二分之一的DVT骨折后血栓患者存在內(nèi)源性抗凝功能異常，見表1。

表1 DVT組與健康人對照組的內(nèi)源性抗凝能力比較

2.2血栓患者中不同性別、年齡和骨折部位的內(nèi)源性抗凝能力評價 健康人對照組男性PICI(%)為87.6±3.6，女性為88.7±3.5，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.470)；≥65歲34人，<65歲66人，PICI(%)分別為87.6±3.6和88.1±3.5，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.651)。

DVT組不同性別、骨折部位患者PICI差異也無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但≥65歲患者較<65歲患者的PICI下降(P<0.05)，平均值下降約4.8%。見表2。

表2 DVT患者不同性別、年齡和骨折部位的內(nèi)源性抗凝能力評價

參數(shù)人數(shù)(百分比)PICI(%)P性別 男45(47.4%)82.1±8.70.376 女50(52.6%)83.4±5.5年齡 <65歲59(62.1%)84.3±7.2<0.05 ≥65歲36(37.9%)80.3±6.4骨折部位 股骨43(45.2%)80.7±8.30.515 脛腓骨24(25.3%)85.1±5.3 膝關節(jié)15(15.8%)83.5±6.7 踝關節(jié)10(10.5%)84.7±5.2 多發(fā)骨折3(3.2%)83.6±3.0

2.3PICI與FDP、DD、HDL-C的相關分析和logistic回歸分析 分析PICI與FDP和DD的相關性發(fā)現(xiàn)，PICI與FDP和DD存在負相關，相關系數(shù)分別為-0.318(95%CI：-0.439～-0.186)和-0.336(95%CI：-0.455～-0.205)，P均<0.01；分析PICI與HDL-C相關性發(fā)現(xiàn)，HDL-C與PICI呈正相關，相關系數(shù)0.284(95%CI：0.142～0.413)，P<0.01。

將健康人對照組和DVT患者組的性別、年齡和PICI進行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示僅PICI有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，OR值1.243(95%CI: 1.149～1.344)，PICI是DVT的危險因素。

3 討論

2009年，Toulon等[9]首次報道了用HemosIL Thrombopath試劑檢測內(nèi)源性抗凝能力的多中心研究。隨后數(shù)篇關于內(nèi)源性抗凝能力檢測的文獻主要集中在腫瘤研究領域[10-12]。本研究首次用PICI評價骨科血栓患者的內(nèi)源性抗凝能力，其在臨床凝血狀態(tài)評價中具有潛在應用價值。

研究發(fā)現(xiàn)，DVT組與健康人對照組FDP和DD差異有統(tǒng)計學意義，與文獻報道一致[8]；DVT患者PICI低于健康人對照組，約一半DVT患者存在內(nèi)源性抗凝缺陷；在DVT患者中，PICI最低值為45.4%，說明該患者的內(nèi)源性抗凝能力下降較嚴重，此類患者的PICI檢測可能具有重要意義。在分析年齡與PICI關系時發(fā)現(xiàn)，≥65歲老年患者PICI顯著下降，說明年齡對內(nèi)源性抗凝能力存在一定影響。將DVT患者按骨折部位分組，不同骨折類型的PICI差異無統(tǒng)計學意義，說明骨折部位不同對內(nèi)源性抗凝能力的變化影響不大。PICI與HDL-C呈正相關，HDL-C水平與內(nèi)源性抗凝能力可能存在聯(lián)系。HDL-C具有抗炎、保護血管內(nèi)皮等功能，可能是抗凝系統(tǒng)的保護因素[13]。

根據(jù)文獻報道，用HemosIL Thrombopath檢測內(nèi)源性抗凝能力，可以有效檢出蛋白C及蛋白S通路異常、狼瘡抗凝物和Ⅴ因子Leiden突變[9]。但PICI只能評價整體的內(nèi)源性抗凝能力，不能測出具體哪一類機制異常。如發(fā)現(xiàn)DVT患者PICI偏低，內(nèi)源性抗凝下降，還應檢測蛋白C、蛋白S、狼瘡抗凝物和Ⅴ因子Leiden等。PICI檢測無法明確內(nèi)源性抗凝能力異常的原因和機制，具有一定的局限性。

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Evaluationforendogenousanticoagulationpotentialofbonefracturepatientswithdeepvenousthrombosisformation

SUYu1,ZHAOJie2,WUJun1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,BeijingJishuitanHospital,Beijing100035; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,People′sHospital,PekingUniversity,Beijing100044,China)

ObjectiveTo evaluate the endogenous anticoagulation potential of bone fracture patients and its relationship with deep venous thrombosis formation (DVT).MethodsA total of 95 DVT patients after bone fracture and 100 healthy subjects as control from Beijing Jishuitan Hospital were included in this study. On the third day after orthopedic surgery, the citrated anticoagulant plasma samples were collected and fibrin degradation products (FDP) and D-dimer (DD) were measured. Protac-induced coagulation inhibition percentage (PICI) was measured with ThromboPath (ThP) chromogenic assay as the marker of endogenous anticoagulation potential. The serum samples from patients were collected to measure the concentration of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C).ResultsBoth FDP and DD values of DVT patient group were significantly higher than those of healthy control group (allP<0.01). The PICI (%) of DVT patients group was significantly lower than that of healthy control group (82.8±7.2 vs 87.8±3.6,P<0.01). The PICI of patients ≥65 years old was 4.8 percent lower than that of the patients <65 years old (P<0.05) in DVT group. When the cut-off value for PICI was set as 84.2%, a significant difference was showed between DVT and control group by Chi-Square test (P<0.01). PICI was negatively correlated with FDP and DD (r=-0.318,-0.336,bothP<0.01), but positively correlated with HDL-C (r=0.284,P<0.01). Logistic regression analysis suggested that PICI was a risk factor of DVT with odds ratio 1.243 (P<0.01).ConclusionThe endogenous anticoagulation potential may be severely impaired in DVT patient after bone fracture.

endogenous anticoagulation potential; deep venous thrombosis; bone fracture; Protac-induced coagulation inhibition percentage

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.10

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)第五批高層次人才培養(yǎng)計劃(2015-3-034)；人社部留學人員科技活動項目([2015]192)；首都特色臨床醫(yī)療研究(Z141107006614012)；教育部留學歸國人員科研啟動基金([2013]693)。

蘇玉，1987年生，女，技師，博士，主要從事血栓分子標志物研究;趙潔，1975年生，女，主管技師，大學本科，主要從事生物化學檢驗工作。蘇玉和趙潔對該研究具有同等貢獻，同為第一作者。

吳俊，主任醫(yī)師，博士，研究生導師，E-mail:wujunpostbox@sina.com。

R446.11;R619

A

2017-08-29)

王海燕)