稀釋凝血酶時(shí)間試驗(yàn)檢測(cè)血漿達(dá)比加群水平的性能評(píng)價(jià)

吳雪蓮，屈晨雪，戴菊華，李麗萍，龔巖，陸遙，袁家穎，倪蓮芳

(北京大學(xué)第一醫(yī)院a.檢驗(yàn)科,b.老年科，北京 100034)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

稀釋凝血酶時(shí)間試驗(yàn)檢測(cè)血漿達(dá)比加群水平的性能評(píng)價(jià)

吳雪蓮a，屈晨雪a，戴菊華a，李麗萍a，龔巖a，陸遙a，袁家穎a，倪蓮芳b

(北京大學(xué)第一醫(yī)院a.檢驗(yàn)科,b.老年科，北京 100034)

目的評(píng)價(jià)稀釋凝血酶時(shí)間(dTT)試驗(yàn)用于檢測(cè)血漿達(dá)比加群水平的性能，觀察其是否能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需求。方法參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP15-A2、EP6-A、EP7-A及C-24文件對(duì)dTT試驗(yàn)檢測(cè)血漿達(dá)比加群水平的精密度、正確度、分析測(cè)量范圍、攜帶污染率、抗生物干擾進(jìn)行評(píng)價(jià)，并觀察血漿樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果dTT試驗(yàn)檢測(cè)血漿達(dá)比加群水平的日內(nèi)、日間變異系數(shù)(CV)均符合廠家聲明的CV；3個(gè)水平美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)能力驗(yàn)證計(jì)劃物質(zhì)達(dá)比加群濃度與靶值的相對(duì)偏差均<10%；在30.92～249.13 ng/mL范圍內(nèi)dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群水平結(jié)果呈線性分布；攜帶污染率為-0.84%；Hb≤3 g/L、三酰甘油≤873 mg/dL、肝素≤2.2 IU/mL、FDP≤29 mg/L對(duì)dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群水平無(wú)影響；血漿樣品在常溫保存不宜超過(guò)4 h，4 ℃不宜超過(guò)4 d，-20 ℃不宜超過(guò)1個(gè)月，-80 ℃條件下可以存放半年。結(jié)論dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群濃度的精密度、正確度、分析測(cè)量范圍、攜帶污染率、抗生物干擾能力基本符合實(shí)驗(yàn)室要求。血漿樣品穩(wěn)定性滿足臨床要求。

達(dá)比加群；抗凝監(jiān)測(cè)；稀釋凝血酶時(shí)間；性能驗(yàn)證

達(dá)比加群是一種直接口服抗凝藥(direct oral anticoagulants，DOACs)，屬于凝血酶抑制劑。服用達(dá)比加群的患者無(wú)需常規(guī)監(jiān)測(cè)凝血功能。近年來(lái)的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，用藥期間出現(xiàn)血栓形成、大出血、急診手術(shù)、肝/腎功能不全等情況時(shí)需要監(jiān)測(cè)達(dá)比加群抗凝效果。因此，上述患者常規(guī)檢測(cè)血液達(dá)比加群濃度尤為重要。稀釋凝血酶時(shí)間(diluted thrombin time，dTT)是可用常規(guī)凝血儀檢測(cè)達(dá)比加群濃度的試驗(yàn)。為保證該項(xiàng)目結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]，本研究擬評(píng)價(jià)dTT試驗(yàn)檢測(cè)血漿達(dá)比加群濃度的精密度、正確度、分析測(cè)量范圍、攜帶污染率、抗生物干擾情況等主要性能指標(biāo)，并觀察穩(wěn)定性，為臨床實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2016年1至9月北京大學(xué)第一醫(yī)院門(mén)診或住院服用達(dá)比加群治療>4 d、年齡≥18 歲的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)應(yīng)用其他靜脈或直接口服抗凝藥；影響凝血功能的疾病史；妊娠。本研究經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集與處理 分別采集患者服藥前(谷濃度)和服藥后2～4 h(峰濃度)[2]靜脈血2.7 mL，用109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，2 000×g離心10 min，1 h內(nèi)分離血漿。

1.3主要儀器與試劑 ACL-TOP 700全自動(dòng)血凝儀(美國(guó)IL公司)；XS-800i血液分析儀(日本Sysmex公司)； 7600-110 全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司)；B320A離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械公司)；SSW-420-2S型電熱恒溫水槽(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Forma905超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

dTT試驗(yàn)試劑盒、定標(biāo)品和質(zhì)控品(美國(guó)IL公司)；干擾試劑盒(日本Sysmex公司)；力文(無(wú)錫華瑞制藥公司)；肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥公司)；枸櫞酸鈉抗凝管(美國(guó)BD公司)；2015年能力驗(yàn)證計(jì)劃樣品由美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(College of American Pathologists，CAP)提供。

1.4方法

1.4.2正確度 用dTT試驗(yàn)測(cè)定2015年3個(gè)不同水平的能力驗(yàn)證計(jì)劃樣品的達(dá)比加群濃度各1次，與靶值比較并計(jì)算相對(duì)偏差(%)。相對(duì)偏差(%)=[(測(cè)定值-靶值)/靶值]×100%，判定標(biāo)準(zhǔn)為相對(duì)偏差<10%。

1.4.3分析測(cè)量范圍 根據(jù)CLSI EP6-A文件[4]對(duì)線性范圍評(píng)價(jià)的要求，選取高濃度(以H表示)和低濃度(以L表示)達(dá)比加群血漿樣品各一份，高濃度及低濃度均接近該系統(tǒng)分析測(cè)量范圍的高限與低限。低濃度樣品為1號(hào)，高濃度樣品為5號(hào)，二者3∶1混合為2號(hào)，等份混合為3號(hào)，1∶3混合為4號(hào)，制成5個(gè)濃度梯度的樣品，每個(gè)濃度樣品隨機(jī)排列并重復(fù)測(cè)定2次，以各濃度實(shí)測(cè)均值和理論值進(jìn)行直線回歸分析，得出線性方程Y=bX+a，以相關(guān)系數(shù)(r)≥0.95為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.4攜帶污染率 根據(jù)CLSI C-24文件的要求[5]，選取高濃度和低濃度達(dá)比加群血漿樣品各1份，先連續(xù)測(cè)定高濃度樣品3次(H1、H2、H3)，后立即檢測(cè)低濃度樣品3次(L1、L2、L3)，計(jì)算攜帶污染率(%)。攜帶污染率(%)=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。

1.4.5抗生物干擾 (1)溶血干擾物(Hb=30 g/L)：紅細(xì)胞于-40 ℃冰凍8 h后再?gòu)?fù)融為血紅蛋白液，檢測(cè)該血紅蛋白液濃度(如果血紅蛋白液濃度超出檢測(cè)上限，則稀釋后再測(cè))。(2)黃疸干擾物(總膽紅素濃度為5 640 μmol/L，即330 mg/dL)：取膽紅素干擾物，按說(shuō)明書(shū)1/2溶解液的量配制，測(cè)定總膽紅素濃度為5 640 μmol/L，結(jié)果以總膽紅素濃度表示。(3)乳糜干擾物(三酰甘油濃度為98 mmol/L，即8 730 mg/dL)：因乳糜液干擾物濃度高，超出生化分析儀可報(bào)告范圍，故將乳糜液干擾物的配制調(diào)整為乳糜樣品配制，終濃度為9.8 mmol/L。制備方法如下：在494 μL待測(cè)血漿中加入力文6 μL，測(cè)定三酰甘油濃度為9.8 mmol/L，結(jié)果以三酰甘油濃度表示。(4)肝素干擾物(肝素濃度22 IU/mL)：用移液器取肝素鈉注射液1 μL加入284 μL待測(cè)血漿中，結(jié)果以肝素濃度表示。(5)FDP干擾物：選取高濃度FDP臨床標(biāo)本，用ACL-TOP 700全自動(dòng)凝血儀檢測(cè)FDP濃度。

根據(jù)CLSI EP7-A文件對(duì)干擾實(shí)驗(yàn)的相關(guān)要求[6]，向血漿中加入干擾物來(lái)評(píng)價(jià)該項(xiàng)目的抗生物干擾能力。干擾物體積與原樣品體積比例為1∶9。除乳糜樣品外，其他干擾樣品(溶血、黃疸、肝素、FDP)加樣量均為50 μL干擾物+450 μL待測(cè)血漿，形成溶血、黃疸、乳糜、肝素、FDP干擾樣品，測(cè)定達(dá)比加群濃度。根據(jù)加入干擾物質(zhì)前后的測(cè)定值計(jì)算相對(duì)偏差，相對(duì)偏差=[(加入干擾物后血漿測(cè)定值-未加干擾物血漿測(cè)定值)/未加干擾物血漿測(cè)定值]×100%，要求相對(duì)偏差<10%。

1.4.6樣品穩(wěn)定性 選擇6份患者血漿，將每份血漿樣品分裝成8管，每管100 μL，以即刻檢測(cè)的血漿達(dá)比加群水平作為對(duì)照值(0 h)。前3份患者的7管血漿分別室溫保存 4、8、24 h，冷藏(2～8 ℃)保存24 h、48 h、4 d、7 d，低溫冷凍(-20 ℃)保存7 d、1個(gè)月，后3份患者的7管血漿樣品分別低溫冷凍(-20 ℃) 3、6個(gè)月，超低溫冷凍(-80 ℃) 3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、1年。測(cè)定達(dá)比加群濃度，與0 h對(duì)照值比較并計(jì)算偏差，以相對(duì)偏差<10%作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1精密度 用dTT試驗(yàn)檢測(cè)2個(gè)不同濃度達(dá)比加群血漿樣品日內(nèi)CV分別為3.59%、2.51%；日間CV分別為2.29%及3.97%，見(jiàn)表1。廠家聲明的日內(nèi)CV為2.8%。水平2日內(nèi)CV為2.51%，小于廠家聲明，驗(yàn)證合格；水平1為3.59%，大于廠家聲明，驗(yàn)證值計(jì)算結(jié)果為3.66%，驗(yàn)證合格。

低、高濃度質(zhì)控品廠家聲明的日間CV分別為3.6%及4.1%，2個(gè)水平的日間CV均小于廠家聲明，驗(yàn)證合格。

2.2正確度 3個(gè)不同水平能力驗(yàn)證計(jì)劃樣品達(dá)比加群的實(shí)測(cè)值與理論值相對(duì)偏差均<10%，見(jiàn)表2。

2.3分析測(cè)量范圍 試劑說(shuō)明書(shū)提供的分析測(cè)量范圍為20～2 000 ng/mL。高濃度(249.13 ng/mL)及低濃度(30.92 ng/mL)血漿各1份按不同比例混合后，檢測(cè)達(dá)比加群濃度，見(jiàn)表3，最佳擬合方程為二元一次方程式，Y=0.98X+5.15，r=0.98，P<0.05，在30.92～249.13 ng/mL范圍內(nèi)呈線性分布。

表1 dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群的日內(nèi)及日間精密度

表2 dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群的正確度

表3 dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群的的分析測(cè)量范圍

2.4攜帶污染率 高濃度樣品H1、H2、H3連續(xù)3次檢測(cè)結(jié)果分別為249.13、253.4、277.75 ng/mL，低濃度樣品L1、L2、L3連續(xù)3次檢測(cè)結(jié)果分別為30.92、32.44、32.97 ng/ mL。攜帶污染率(%)計(jì)算結(jié)果為-0.84%，儀器清潔能力較好。

2.5抗生物干擾 當(dāng)溶血(血紅蛋白濃度=3 g/L)干擾存在時(shí)，相對(duì)偏差均<5%；當(dāng)黃疸(總膽紅素濃度=33 mg/dL)干擾存在時(shí)， 樣品易受影響，低濃度達(dá)比加群樣品受影響較??；當(dāng)乳糜(三酰甘油濃度=873 mg/dL)干擾存在時(shí)，偏差均<5%；當(dāng)肝素(肝素濃度=2.2 IU/L)干擾存在時(shí)，偏差均<5%；當(dāng)FDP(FDP濃度=29 mg/L)干擾存在時(shí)，偏差均<10%。dTT試驗(yàn)可抗溶血(3 g/L)、乳糜(三酰甘油690 mg/dL)、肝素(2.2 IU/L)、FDP(29 mg/L)干擾，而對(duì)于黃疸(33 mg/dL)干擾，則與樣品達(dá)比加群濃度高低有關(guān)，高濃度達(dá)比加群樣品易受影響。見(jiàn)表4。

表4 dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群(ng/mL)的抗生物干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.6標(biāo)本穩(wěn)定性 見(jiàn)圖1。檢測(cè)達(dá)比加群的血漿樣品，常溫放置不宜超過(guò)4 h，4 ℃不宜超過(guò)4 d，-20 ℃不宜超過(guò)1個(gè)月；-80 ℃條件下目前僅有6個(gè)月的數(shù)據(jù)，穩(wěn)定性良好。

注，A，室溫保存； B，-4 ℃保存；C，-20 ℃保存； D，-80 ℃保存。

圖1 不同保存條件下達(dá)比加群待測(cè)血漿樣品的穩(wěn)定性

3 討論

臨床研究證實(shí)，達(dá)比加群比華法林明顯降低心房顫動(dòng)(房顫)患者腦卒中風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)降低患者大出血風(fēng)險(xiǎn)[7]，因此其運(yùn)用越來(lái)越廣泛。達(dá)比加群的抗凝監(jiān)測(cè)包括篩查和定量檢測(cè)。篩查試驗(yàn)主要有活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶時(shí)間(TT)試驗(yàn)，定量試驗(yàn)主要有dTT試驗(yàn)、Hemoclot 凝血酶抑制試驗(yàn)(Hemoclot thrombin inhibitor，HTI)、Ecarin凝固時(shí)間(Ecarin clot time，ECT)、Ecarin發(fā)色試驗(yàn)(Ecarin chromogenic assay，ECA)，其中，dTT試驗(yàn)可以在很多實(shí)驗(yàn)室用常規(guī)血凝儀檢測(cè)，方便、快捷。故本研究評(píng)價(jià)dTT試驗(yàn)的性能指標(biāo)，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

dTT檢測(cè)原理為：待測(cè)血漿用健康人混合血漿(試劑盒提供)稀釋?zhuān)瑢⒐潭舛鹊呐Ｄ讣尤胍驯幌♂尩幕颊哐獫{樣品，激活凝血瀑布，血漿凝固，凝血儀測(cè)定并記錄凝固時(shí)間。如血漿樣品含有達(dá)比加群，因其抑制外源加入的凝血酶活性，會(huì)導(dǎo)致凝固時(shí)間延長(zhǎng)，將測(cè)定的凝固時(shí)間與事先繪制好的達(dá)比加群濃度與凝固時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即得出達(dá)比加群濃度(單位為ng/mL)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該方法與達(dá)比加群檢測(cè)的參考方法——高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)相關(guān)性好(r=0.979 9)[8]。本試劑盒中采用的校準(zhǔn)品溯源至參考方法HPLC-MS/MS。

本研究結(jié)果顯示，該方法日內(nèi)、日間CV均符合廠家聲明的CV，表明該項(xiàng)目具有較好的重復(fù)性。2015年共有21個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了CAP達(dá)比加群濃度檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃，其中，15個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群濃度，不同實(shí)驗(yàn)室dTT試驗(yàn)的室間CV為7.7%～10.3%，故本研究將相對(duì)偏差<10%作為判定標(biāo)準(zhǔn)。本研究檢測(cè)3個(gè)不同濃度水平能力驗(yàn)證計(jì)劃物質(zhì)的相對(duì)偏差均<10%，表明該方法具有較好的正確度。進(jìn)一步進(jìn)行分析測(cè)量范圍驗(yàn)證即線性范圍驗(yàn)證，結(jié)果顯示實(shí)測(cè)值與理論值的相關(guān)系數(shù)為0.98，表明在30.92～249.13 ng/mL范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。攜帶污染率為-0.84%，表明該儀器檢測(cè)此項(xiàng)目時(shí)高值標(biāo)本對(duì)低值標(biāo)本影響小，儀器清洗功能較好。

依據(jù)說(shuō)明書(shū)抗生物干擾能力(血紅蛋白≤300 mg/dL、三酰甘油≤873 mg/dL、膽紅素≤33 mg/dL、肝素≤2.2 IU/mL)配制濃度接近的相應(yīng)干擾樣品，在Hb≤300 mg/dL、三酰甘油≤873 mg/dL時(shí)，偏差均<5%，表明一般溶血、乳糜血對(duì)達(dá)比加群檢測(cè)干擾較小，可以滿足臨床需要。對(duì)于黃疸干擾，達(dá)比加群濃度較低的樣品(54.25～59.22 ng/mL)受黃疸影響較小(均<10%)，而濃度較高的樣品(81.15 ng/mL)受黃疸影響較大(偏差=-25.05%)。但由于樣品數(shù)量不足，本研究并沒(méi)有重復(fù)檢測(cè)高濃度樣品對(duì)抗黃疸干擾的能力。

普通肝素(unfractionated heparin，UFH)主要通過(guò)增加抗凝血酶的能力來(lái)滅活凝血因子Ⅱa、Ⅹa、Ⅸa、ⅩⅠa、ⅩⅡa[9]。服用達(dá)比加群患者血漿中若存在肝素，肝素與血漿樣品中的抗凝血酶結(jié)合，滅活外源性的凝血酶試劑，使凝固時(shí)間延長(zhǎng)。延長(zhǎng)的凝固時(shí)間對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)曲線上更高的“達(dá)比加群濃度”，即肝素會(huì)使達(dá)比加群檢測(cè)結(jié)果“假性升高”。為此，本研究評(píng)價(jià)dTT試驗(yàn)的抗UFH干擾能力。低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)由于分子量較小，滅活Ⅱa因子的能力明顯降低，抑制Ⅹa因子和Ⅱa因子的比值約為(2～4)∶1[7]，理論上，LMWH對(duì)dTT檢測(cè)的干擾應(yīng)小于UFH，故本研究沒(méi)有設(shè)計(jì)LMWH對(duì)dTT的干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明肝素濃度<2.2 IU/mL對(duì)dTT試驗(yàn)無(wú)顯著影響。此外，本研究還評(píng)價(jià)了FDP對(duì)dTT試驗(yàn)的影響。由于FDP中碎片X(X′)、E(E′)、 D(D′)的結(jié)構(gòu)與纖維蛋白原或纖維蛋白單體的結(jié)構(gòu)相似，故可與纖維蛋白原競(jìng)爭(zhēng)凝血酶而使血液凝固時(shí)間延長(zhǎng)，或與纖維蛋白單體形成復(fù)合物，阻止纖維蛋白單體的交聯(lián)，使凝固時(shí)間延長(zhǎng)[10-11]。當(dāng)FDP≥50 mg/L時(shí)會(huì)干擾TT檢測(cè)[12]。dTT試驗(yàn)的檢測(cè)原理如上所述是基于TT的檢測(cè)，故本研究增加了FDP對(duì)dTT試驗(yàn)的影響，采用臨床高濃度FDP樣品(290 mg/L)評(píng)價(jià)FDP對(duì)dTT的影響，結(jié)果顯示，相對(duì)偏差分別為-7.94%、-4.20%、3.95%，F(xiàn)DP<29 mg/L時(shí)對(duì)dTT試驗(yàn)無(wú)顯著影響。后續(xù)可繼續(xù)尋找臨床高FDP樣品，評(píng)價(jià)dTT抗FDP干擾能力。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果提示，待測(cè)達(dá)比加群的血漿樣品在常溫放置不宜超過(guò)4 h，4 ℃不宜超過(guò)4 d，-20 ℃不宜超過(guò)1個(gè)月，-80 ℃可以存放半年。

綜上，dTT試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)比加群的各項(xiàng)性能指標(biāo)基本滿足實(shí)驗(yàn)室要求，血漿樣品穩(wěn)定性結(jié)果為臨床送檢標(biāo)本要求提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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PerformanceverificationofdilutedthrombintimeassayfordetectingDabigatranlevelinplasma

WUXue-liana，QUChen-xuea，DAIJu-huaa，LILi-pinga，GONGYana,LUYaoa,YUANJia-yinga,NILian-fangb

(a.DepartmentofClinicalLaboratory,b.DepartmentofGeriatrics,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China)

ObjectiveTo evaluate the performance of diluted thrombin time (dTT) assay for detecting Dabigatran levels and observe whether this assay may meet the requirements of clinical laboratory.MethodsAccording to EP15-A2, EP6-A, EP7-A and C-24 documents of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), the precision, trueness, analytical measurement range, carryover rate and anti-biological interference of dTT assay were evaluated and the stability of specimen for dTT assay was observed.ResultsBoth the within-day and between-day coefficient of variation (CV) of dTT assay for detecting Dabigatran levels were consistent with manufacturer′s statedCV. Compared with target values of Dabigatran, the relative bias of 3 levels of proficiency test materials from College of American Pathologists (CAP) were less than 10%. The results meet linear verification when Dabigatran concentration was between 30.92 and 249.13 ng/mL. The carryover rate was -0.84%. There was no interference for Dabigatran levels by dTT assay for detecting Dabigatran when Hb≤3 g/L, triglyceride≤873 mg/dL, heparin≤2.2 IU/mL and FDP≤29 mg/L. The results of stability showed that plasma specimens for dTT could not be stored at room temperature more than 4 hours, at 4 ℃ more than 4 days, at -20 ℃ exceed 1 month, while at -80℃ the plasma specimens could be stored at least 6 months for dTT assay.ConclusionThe precision, trueness, analytical measurement range, carryover rate, anti-biological interference of dTT assay may meet the requirement of clinical laboratory. The stability of the specimen can fulfill the clinical requirements.

Dabigatran；anticoagulation monitoring；diluted thrombin time； performance verification

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.07

吳雪蓮，1989年生，女，技師，碩士，研究方向?yàn)檠翰〉暮Y查與診斷。

屈晨雪，副主任醫(yī)師，博士，E-mail:qucx2012@163.com。

R446.11

A

2017-10-24)

王海燕)