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    長春瑞濱誘導(dǎo)人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3凋亡及降低端粒酶活性

    2018-01-10 01:13:48申麗媛徐冬梅劉瀟涵文亞玲
    基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床 2018年1期
    關(guān)鍵詞:瑞濱端粒酶長春

    申麗媛,徐冬梅*,劉瀟涵,楊 玫,文亞玲

    (1.重慶市婦幼保健院 婦產(chǎn)科,重慶 400021; 2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,重慶 400016)

    研究論文

    長春瑞濱誘導(dǎo)人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3凋亡及降低端粒酶活性

    申麗媛1,徐冬梅1*,劉瀟涵2,楊 玫1,文亞玲1

    (1.重慶市婦幼保健院 婦產(chǎn)科,重慶 400021; 2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,重慶 400016)

    目的探討長春瑞濱對人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3細胞凋亡、端粒酶活性及亞單位人端粒酶反轉(zhuǎn)酶mRNA(hTERT mRNA)表達的影響。方法將不同濃度的長春瑞濱作用于SKOV3細胞后,用CCK- 8法檢測細胞增殖;流式細胞計量術(shù)檢測細胞凋亡;端粒重復(fù)序列擴增酶聯(lián)免疫吸附試驗(TRAP-ELISA)檢測端粒酶活性; RT-PCR檢測細胞中hTERT mRNA表達。結(jié)果長春瑞濱可抑制SKOV3細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡(P<0.01),降低SKOV3細胞中端粒酶活性及hTERT mRNA的表達(P<0.01),且存在濃度-時間依賴關(guān)系。結(jié)論檢測端粒酶的活性及hTERT mRNA表達,可能有助于判定長春瑞濱誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細胞凋亡的敏感性。

    上皮性卵巢癌;長春瑞濱;凋亡;端粒酶活性

    目前,腫瘤細胞減滅術(shù)和聯(lián)合化療是中晚期卵巢癌的主要治療策略,但因其廣泛的盆腹腔轉(zhuǎn)移,極大降低了手術(shù)的滿意率,因此,發(fā)現(xiàn)有效的化療藥物具有重要意義[1]。長春瑞濱是第3代長春花堿類藥物,在分子水平,它干擾細胞微管的動態(tài)平衡,與微管蛋白單體結(jié)合,抑制微管的形成,在有絲分裂中期阻斷細胞活動,進而使細胞停滯在有絲分裂中期或使細胞死亡,為細胞周期特異性藥物[2]。

    端粒位于真核細胞染色體的末端,在維持染色體的穩(wěn)定性、完整性和細胞活性有重要作用。端粒酶是由核苷酸和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體,能延長縮短的端粒,從而增強細胞的增殖能力,hTERT是端粒酶的催化亞基,其表達情況與端粒酶的活性相關(guān)[3]。近年研究表明,多數(shù)化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡與端粒酶的活性有關(guān)[4],長春瑞濱發(fā)揮抗癌作用的機制與端粒酶活性密切相關(guān)[5],本實驗觀察長春瑞濱對人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3凋亡的誘導(dǎo)作用及對細胞端粒酶活性的影響及其機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    卵巢癌細胞系SKOV3(中科院上海細胞庫);小牛血清(杭州四季青公司);長春瑞濱(Pierre Farmos公司);CCK- 8(上海生物公司);Annexin V-FITC(凱基公司);引物由上海生工合成,端粒酶活性檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司);將10 mg長春瑞濱溶于0.9%氯化鈉溶液,配成1 mmol/L液體,使用前稀釋成所需濃度。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞分組及處理:取對數(shù)增殖期卵巢癌細胞SKOV3,實驗設(shè)對照組、長春瑞濱組和調(diào)零組。對照組加入20 μL細胞培養(yǎng)液,長春瑞濱組加入等體積長春瑞濱藥物,使其濃度為1、5和10 μg/mL,調(diào)零組加入與長春瑞濱組等量的PBS。

    1.2.2 CCK- 8法檢測細胞增殖:以1×104個/ mL細胞接種于96孔板中,每孔200 μL,各組均設(shè)5個復(fù)孔,分別在24、48及72 h取樣,每孔加入CCK- 8 20 μL,37 ℃繼續(xù)孵育,2 h后酶標儀檢測吸光度(570 nm),計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率%=[1-(A給藥組-A空白組)/(A陰性對照組-A空白組)]×100%,實驗重復(fù)3次。

    1.2.3 流式細胞計量術(shù)檢測細胞凋亡:以5×105個/mL細胞接種于24孔板,分別在24、48及72 h用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化收集細胞,PBS洗滌2次,依次加入500 μL 結(jié)合緩沖液、5 μL Annexin V/FITC及5 μL PI溶液,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,實驗重復(fù)3次。

    1.2.4 端粒重復(fù)序列擴增酶聯(lián)免疫吸附試驗(TRAR-ELISA)檢測端粒酶活性:收集各實驗組細胞,用冷PBS洗滌2次,加入冰冷裂解緩沖液40 μL,4 ℃離心(600 r/min),收集上清,按試劑盒說明進行PCR擴增實驗。分別取陰性、陽性及待測樣本各2.5 μL,加入變性劑10 μL,靜置10 min后加入雜交緩沖液100 μL,吹打均勻,取100 μL混合液至親和素包被的微孔板中,37 ℃中孵育2 h。洗滌3次后加入抗體100 μL,靜置30 min,依次加入TMB顯色液及終止液。酶標儀檢測各孔在450 nm和690 nm處的吸光度值,依據(jù)公式:A=A450-A690計算端粒酶活性。

    1.2.5 RT-PCR檢測端粒酶hTERT mRNA水平:hTERT mRNA擴增引物序列:上游引物5′-CGGAAG AGTGTCTGGAGCAA-3′,下游引物5′-GGATGAAGCG GAGTCTGGA-3′。GAPDH作為內(nèi)參照:上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′,下游引物5′-CCTG GAAGATGGTGATGGGATT-3′。收集各實驗組細胞,按Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴增條件:94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共進行35個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié)果

    2.1 長春瑞濱對卵巢癌細胞SKOV3的抑制作用

    長春瑞濱可呈時間及劑量依賴性抑制SKOV3細胞增殖(圖1)。

    圖1 長春瑞濱對卵巢癌細胞SKOV3增殖抑制的影響Fig 1 Inhibition of SKOV3 by different concentration of vinorelbine

    2.2 長春瑞濱對細胞SKOV3凋亡的影響

    長春瑞濱呈時間-濃度依賴性誘導(dǎo)SKOV3凋亡(表1)。

    2.3 長春瑞濱對卵巢癌細胞端粒酶活性的影響

    1 μg/mL長春瑞濱作用48和72 h時,端粒酶活性明顯降低(P<0.01)。5和10 μg/mL長春瑞濱作用24、48及72 h后,端粒酶活性相比對照組明顯降低(P<0.01)(表2)。

    表1 長春瑞濱對卵巢癌細胞SKOV3凋亡率的影響

    *P<0.01 compared with control.

    表2 長春瑞濱對卵巢癌細胞SKOV3端粒酶活性的影響

    *P>0.05,**P<0.01 compared with control.

    2.4 長春瑞濱對卵巢癌細胞hTERT mRNA的影響

    長春瑞濱處理的卵巢癌細胞中hTERT mRNA表達隨時間延長及濃度升高而降低(圖2,表3)。

    表3 長春瑞濱對卵巢癌細胞SKOV3 hTERTmRNA的影響

    *P<0.01 compared with control.

    3 討論

    端粒酶是一種特殊核糖蛋白復(fù)合體,可將端粒重復(fù)序列整合到染色體末端,具有維持腫瘤細胞永生化的能力[6],抑制端粒酶的活性能夠通過誘導(dǎo)細胞凋亡從而抑制腫瘤形成[7- 8]。因此,研究端粒酶的表達和活性及其在腫瘤細胞藥物敏感性中的規(guī)律,為腫瘤的檢測和治療提供了新的臨床思路。長春瑞濱針對復(fù)發(fā)和難治性上皮性卵巢癌有顯著療效[9- 10]。目前與長春瑞濱治療上皮性卵巢癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究鮮有報道。

    hTERT mRNA是調(diào)控端粒酶活性的關(guān)鍵因子,與細胞凋亡密切相關(guān)[11]。研究表明,hTERT與端粒酶活性具有一致性[12- 13],本實驗在不同時間用不同濃度的長春瑞濱作用SKOV3細胞后,發(fā)現(xiàn)長春瑞濱與SKOV3細胞的凋亡及增殖抑制作用呈時間-濃度效應(yīng)關(guān)系。1 μg/mL長春瑞濱作用24 h即可顯著下調(diào)上皮性卵巢癌細胞中hTERT mRNA的表達,然而端粒酶活性未見明顯改變,1 μg/mL長春瑞濱作用48 h才見端粒酶活性的降低,5和10 μg/mL長春瑞濱在各時間點,均可見hTERT mRNA和端粒酶活性的下降,提示hTERT mRNA表達的改變比端粒酶活性更敏感,更有助于判定長春瑞濱治療上皮性卵巢癌的療效。

    M.marker;1.control;2.1 μg/mL vinorelbine;3.5 μg/mL vinorelbine;4.10 μg/mL vinorelbine圖2 1、5和10μg/mL長春瑞濱作用卵巢癌SKOV3細胞24、48和72 h時hTERT mRNA表達情況Fig 2 Expression of hTERT mRNA in SKOV3 by different concentration of vinorelbine in different time

    端粒酶是目前較廣泛、特異性強的腫瘤標志物,其活性與惡性腫瘤的生存預(yù)后顯著相關(guān),有報道端粒酶可能通過下調(diào)hTERT表達抑制其活性,從而誘導(dǎo)細胞凋亡[5],與本研究結(jié)果相符。研究顯示,hTERT mRNA和端粒酶在SKOV3細胞株及上皮性卵巢癌患者中顯著高表達[14],因此,通過檢測患者病理性滲出物、血液及腫瘤脫落細胞等臨床標本中hTERT mRNA表達和端粒酶活性,可能有助于上皮性卵巢癌的治療療效監(jiān)測及預(yù)后的判斷,亦可為上皮性卵巢癌的治療提供新的靶點。

    綜上所述,長春瑞濱在SKOV3細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡且下調(diào)hTERT的表達,其作用機制可能是通過下調(diào)hTERT mRNA抑制端粒酶活性,從而促使腫瘤細胞凋亡。與端粒酶活性相比較,hTERT表達更靈敏。因此,其可作為長春瑞濱治療上皮性卵巢癌的理想監(jiān)測指標,其具體作用機制待進一步研究。

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    Vinorelbine induces apotosis and decreases telomerase activity in human epithelial ovarian cancer cells line SKOV3

    SHEN Li-yuan1, XU Dong-mei1*, LIU Xiao-han2, YANG Mei1, WEN Ya-ling1

    (1.Dept. of Gynaecology and Obstetrics,Chongqing Health Cencer for Women and Children, Chongqing 400021;2.the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

    ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations of vinorelbine on apoptosis,telomerase activity and expression of human telomerase-reverse transcriptase gene (hTERT) in human epithelial ovarian cancer cells SKOV3.MethodsOvarian cancer cells SKOV3 were treated with vinorelbine under different concentrations. The cell proliferation was measured by cell counting kit- 8 (CCK- 8) assay, and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. The telomerase activity of SKOV3 cells was determined by TRAP-PAGE-silver staining; The mRNA expression of hTERT was performed by RT-PCR assay.ResultsVinorelbine could significantly inhibited the proliferation of SKOV3 cells,induce cell apoptosis(P<0.01),reduce the telomerase activity and expression of hTERT mRNA(P<0.01), in dependent of a concentration-time manner.ConclusionsThe detection of telomerase activity and the mRNA expression of hTERT might be vital for predicting the prognosis of patients with epithelial ovarian cancer.

    epithelial ovarian cancer; vinorelbine; apotosis;telomerase activity

    2017- 08- 24

    2017- 11- 17

    *通信作者(correspondingauthor):76548265@qq.com

    1001-6325(2018)01-0087-04

    R711.75

    A

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