超臨界CO2體系下酶法制備中碳鏈甘三酯的研究

姜 洋 李 丹 王 彤 齊曉芬 張博坤 于殿宇(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 50030) (哈爾濱普潤油脂有限公司，哈爾濱 5008)

超臨界CO2體系下酶法制備中碳鏈甘三酯的研究

姜 洋1李 丹1王 彤1齊曉芬1張博坤2于殿宇1
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030) (哈爾濱普潤油脂有限公司2，哈爾濱 150028)

中碳鏈甘三酯作為一種低能量的油脂因其特殊的生理功能和代謝途徑得到了廣泛的應(yīng)用，本文以甘油和辛酸、癸酸混合物為原料，研究在超臨界CO2體系下酶法制備中碳鏈甘三酯的工藝條件，并對酯化產(chǎn)物進(jìn)行分析。通過脂肪酶的比較，得出脂肪酶Novozyme 435優(yōu)于Lipozyme RM IM，因此，選用脂肪酶Novozyme 435為催化劑，以中碳鏈甘三酯得率為指標(biāo)，通過響應(yīng)面法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)壓力9.1 MPa、反應(yīng)溫度90 ℃、酶添加量4.2%、底物摩爾比3:1和反應(yīng)時(shí)間10.2 h。在此反應(yīng)條件下中碳鏈甘三酯的得率為95.1%，酯化率為98.62%。該方法有效的提高了脂肪酸的利用率及MCT得率，所得酯化產(chǎn)物色澤較淺。

超臨界CO2體系 酶法 中碳鏈甘三酯 響應(yīng)面優(yōu)化

中碳鏈甘三酯(MCT)是指由C6～C12飽和脂肪酸所構(gòu)成的甘油三酯，一般為辛酸甘三酯、癸酸甘三酯或辛酸-癸酸混酸組成的甘三酯[1,2]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，高脂肪膳食與肥胖癥、高血壓、高血脂、腦血栓等疾病及某些癌癥(乳腺癌、腸癌)發(fā)病率的上升存在著密切的關(guān)系[3-5]。因此，營養(yǎng)專家不斷提倡低油、低糖、低鹽、高纖維的“三低一高”飲食原則，而MCT因其特殊的理化功能和代謝途徑，作為一種低能量，既具有保健作用又不影響食品風(fēng)味的膳食脂肪引起了人們的廣泛關(guān)注[6-10]，且在制備MCT的過程中產(chǎn)生的甘一酯可用作類固醇的溶劑，治療人體膽結(jié)石，對膽汁酸的分泌也有抑制作用，甘二酯可用來制備一些藥物的前體及無毒副作用的藥物載體[11-12]。

中碳鏈甘三酯的制備方法主要分為化學(xué)法和酶法[13-14]，酶法催化反應(yīng)，有效避免了化學(xué)法中反應(yīng)過程煩瑣，時(shí)間長，污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)[15-16]，但是酶法制備中碳鏈甘三酯的產(chǎn)率較低，是目前急需解決的問題。在超臨界CO2條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，溶液有較大的溶解能力和較高傳遞特性，因此降低了反應(yīng)過程中的傳遞阻力，能夠提高酶反應(yīng)速率[17-19]；另外CO2是一種無毒、惰性、成本低、可循環(huán)使用、對環(huán)境相當(dāng)友好的反應(yīng)介質(zhì)[20]。

因此，本研究在超臨界CO2體系下制備中碳鏈甘三酯，探索不同脂肪酶對中碳鏈甘三酯得率的影響，并對酶法合成中碳鏈甘三酯進(jìn)行工藝優(yōu)化，提高中碳鏈甘三酯的得率，使其在工業(yè)上的具有廣闊的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脂肪酶Novozyme 435，Lipozyme RM IM：中國天津諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；CO2(純度≥99.9%)：哈爾濱黎明氣體有限公司；辛酸(純度≥99%)和癸酸(純度≥99%)：薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；甘油(分析純)：國藥集團(tuán)；正己烷：色譜純，脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

高壓反應(yīng)釜：江蘇太倉市醫(yī)器械廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪高科儀器廠；LD4-2A低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；MK-6S薄層色譜-氫火焰離子檢測器：日本三菱公司；GC-6890N型氣相色譜儀：美國安捷倫公司；羅維朋比色計(jì)：杭州大成光電儀器有限公司；WZS-I阿貝氏折射儀：上海玻璃儀器一廠。

1.2 MCT的合成方法

將辛酸和癸酸按摩爾質(zhì)量1:1混合，再與甘油按比例加入自制反應(yīng)釜中，并加入2%蒸餾水(甘油重)，適量的脂肪酶和轉(zhuǎn)子，輕微攪拌均勻后，將反應(yīng)釜擰緊密封，先向反應(yīng)釜中充入3～5 MPa CO2，重復(fù)2～3次，將釜內(nèi)的空氣置換出去并試漏，然后再充入設(shè)定壓力的CO2。將充好氣的反應(yīng)釜放入恒溫加熱磁力攪拌器中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為200 r/min，在一定的溫度下反應(yīng)一定時(shí)間后將產(chǎn)物與酶分離、干燥。

1.3 脂肪酶的篩選

按照1.2方法，選取酯化效果較好的兩種脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme RM IM[21]，分別在CO2的壓力為10 MPa，酶添加量為4%(占脂肪酸總質(zhì)量)，底物摩爾比3:1(辛酸、癸酸混合酸：甘油)，各自最適溫度下進(jìn)行酯化反應(yīng)，測其酯化率和MCT得率。

1.4 分析方法

1.4.1 產(chǎn)品組成測定

采用薄層色譜-氫火焰離子檢測(TLC-FID)，檢測產(chǎn)品中的甘三酯和脂肪酸、甘二酯、甘一酯的相對百分含量[22]。

將樣品配制成一定濃度的正己烷溶液，混合均勻，取1 μL溶液點(diǎn)樣于色譜柱上，在展開劑中展開，展開劑為正己烷(色譜純):無水乙醚:冰乙酸=55:15:1(體積比)。分析條件為：氫氣流速90 mL/min，空氣流速2.0 mL/min，掃柱速度30 s/柱。

1.4.2 脂肪酸含量的測定[23]

取1.2中的液體產(chǎn)物3～5滴，稱重，以1% H2SO4-甲醇甲酯化后溶于正己烷，供氣相色譜分析。

檢測器：FID；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：250 ℃；空氣壓力：50 kPa；氫氣壓力：60 kPa；氮?dú)鈮毫Γ?20 kPa；程序升溫：70 ℃時(shí)保持4 min，然后以13 ℃/min的升溫速率將溫度升至175 ℃，保持此溫度27 min，最后以4 ℃/min的升溫速率將溫度升至215 ℃，保持31 min。

1.4.3 MCT得率的計(jì)算

由于TLC-FID的譜圖中，甘三酯和游離脂肪酸為同一個(gè)峰，所以用譜圖中甘三酯和脂肪酸的百分含量減去游離脂肪酸的百分含量即為MCT得率。

1.4.4 MCT酯化率的計(jì)算[24]

酯化率是根據(jù)反應(yīng)前后脂肪酸含量的變化進(jìn)行計(jì)算的，能反映出脂肪酸的轉(zhuǎn)化率，計(jì)算公式如下所示：

式中：M0為反應(yīng)初始體系中酸的單位含量；Mt為反應(yīng)完畢后體系的游離酸的單位含量。

1.4.5 產(chǎn)品物理指標(biāo)測定

皂化值參照GB/T 5534—2008；酸值參照GB/T 5530—2005；折光指數(shù)參照GB/T 5527—2010；碘值參照GB/T 5532—2008；相對密度參照GB/T 5009.2—2003；色澤參照GB/T 5525—2008。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±偏差，采用oringe 7.5統(tǒng)計(jì)分析軟件、Design Expert 7.0.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶的選擇

由圖1可以看出，脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme RM IM催化合成MCT的酯化率和MCT得率都隨時(shí)間的延長而逐漸升高，最終趨于穩(wěn)定，但是在Novozyme 435的催化下，酯化率和MCT得率明顯高于Lipozyme RM IM，而且Novozyme 435催化的酯化反應(yīng)在10 h時(shí)達(dá)到平衡，酯化率和MCT得率都達(dá)到了最大，分別為97.3%和93.9%，Lipozyme RM IM達(dá)到平衡所需要的時(shí)間較長，在13 h時(shí)酯化率和MCT得率最大，分別為86.3%和81.7%，這可能是由于Lipozyme RM IM是1,3-位特異性脂肪酶，在酯化反應(yīng)初期，主要生成1,3-甘二酯，再進(jìn)一步酯化合成甘三酯，所以達(dá)到平衡所需的時(shí)間較長。綜合考慮，Novozyme 435的催化效果較好，因此，選擇Novozyme 435為酶法制備合成中碳鏈甘三酯的催化劑。

圖1 不同脂肪酶對合成中碳鏈甘三酯的影響

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 CO2壓力對酯化反應(yīng)的影響

按照1.2的方法，準(zhǔn)確稱取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸:甘油為3:1的比例加入脂肪酸，在反應(yīng)溫度為90 ℃，加酶量4%的條件下，反應(yīng)10 h，以MCT得率為指標(biāo)，CO2壓力對酯化反應(yīng)的影響見圖2。

圖2 CO2壓力、時(shí)間和溫度對酯化反應(yīng)的影響

壓力是超臨界酯化反應(yīng)的主要影響因素，壓力不同會(huì)影響底物濃度從而影響反應(yīng)速率及MCT得率。由圖2可以看出，隨著CO2壓力的升高，MCT的得率先上升，后趨于穩(wěn)定。在壓力為7～9 MPa時(shí)MCT的得率上升比較明顯，而在9～11 MPa時(shí)MCT得率上升的幅度比較小，為使MCT得率高，同時(shí)又能節(jié)約能源，因此，選擇CO2壓力為10 MPa。

2.2.2 時(shí)間對酯化反應(yīng)的影響

按照1.2的方法，準(zhǔn)確稱取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸:甘油為3:1的比例加入脂肪酸，在CO2壓力為10 MPa，反應(yīng)溫度為90 ℃，加酶量4%的條件下，以MCT得率為指標(biāo)，研究反應(yīng)時(shí)間對酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，MCT得率先逐漸升高，10 h后趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)榉磻?yīng)底物與酶的接觸時(shí)間越長，反應(yīng)越充分，所以MCT得率越高，在10 h時(shí)，MCT得率幾乎達(dá)到最大，為了節(jié)省時(shí)間和節(jié)約能量，因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為10 h。

2.2.3 溫度對酯化反應(yīng)的影響

按照1.2的方法，準(zhǔn)確稱取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸：甘油為3:1的比例加入脂肪酸，在CO2壓力為10 MPa，加酶量4%的條件下反應(yīng)10 h，以MCT得率為指標(biāo)，研究溫度對酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著溫度升高，MCT得率先逐漸升高，90 ℃時(shí)MCT得率最高為94.4%，當(dāng)溫度高于90 ℃時(shí)，MCT得率呈下降的趨勢。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，催化劑得以充分還原和活化，且反應(yīng)物在超臨界流體中的溶解度會(huì)有很大提高，當(dāng)溫度為90 ℃時(shí)，MCT得率達(dá)到最大，當(dāng)溫度超過90 ℃時(shí)，酶的活性降低，導(dǎo)致MCT得率降低，因此，選擇反應(yīng)溫度為90 ℃。

2.2.4 酶添加量對酯化反應(yīng)的影響

按照1.2的方法，準(zhǔn)確稱取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸:甘油為3:1的比例加入脂肪酸，在CO2壓力為10 MPa，反應(yīng)溫度為90 ℃的條件下反應(yīng)10 h，以MCT得率為指標(biāo)，研究酶添加量對酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶添加量、底物摩爾比對酯化反應(yīng)的影響

由圖3可以看出，隨著酶添加量的增加，MCT的得率逐漸升高，在添加量為4%時(shí)達(dá)到最大，酶添加量超過4%反而有下降的趨勢，原因是隨著酶用量的增加，酶分子與底物接觸的機(jī)會(huì)增加，反應(yīng)速度加快，酯化反應(yīng)程度提高，MCT得率升高，而酶添加量較多時(shí)，所需的水分不足，限制了酯化反應(yīng)的進(jìn)行，從而使MCT得率有所下降，因此，選擇酶添加量為4%。

2.2.5 底物摩爾比對酯化反應(yīng)的影響

按照1.2的方法，準(zhǔn)確稱取甘油5 g，按照不同比例加入脂肪酸，在CO2壓力為10 MPa，加酶量4%，反應(yīng)溫度為90 ℃的條件下反應(yīng)10 h，以MCT得率為指標(biāo)，研究底物摩爾比對酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖3所示。

底物比是影響中碳鏈甘三酯含量的主要因素，由圖3可以看出，隨著底物摩爾比增加，MCT得率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)混合脂肪酸:甘油比例為3:1時(shí)，MCT得率最大，這可能是因?yàn)樵诘孜锬柋鹊陀?:1時(shí)，甘油過量，酯化過程中會(huì)生成較多的甘二酯及甘一酯，導(dǎo)致MCT得率較低；在底物摩爾比超過3:1時(shí)，有過量脂肪酸存在，甘油幾乎被全部酯化，剩余部分脂肪酸留在酯化產(chǎn)物中，也會(huì)導(dǎo)致MCT得率降低。因此，在底物摩爾比為3:1時(shí)，正好符合合成甘三酯的摩爾比，選擇底物摩爾比為3:1。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝參數(shù)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在溫度為90 ℃的條件下，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法，以MCT得率為主要的考察指標(biāo)，利用Design Expert 7.0.0軟件在三因素三水平上對超臨界CO2體系下酶法制備中碳鏈甘三酯的影響因素：CO2壓力、時(shí)間、酶添加量和底物摩爾比進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的酯化條件。因素水平及編碼見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平編碼表

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果表

表3(續(xù))

注：*顯著(P<0.05)，**極顯著(P<0.01)。

通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到MCT得率(R1)對壓力(A)、酶添加量(B)、時(shí)間(C)和底物摩爾比(D)的回歸方程為:

R1=95.10-0.86A+0.54B+0.31C+0.36D+0.38AB-0.5AC+0.4AD+1.2BC-0.2BD-0.43CD-2.04A2-1.31B2-2.34C2-1.61D2

對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，當(dāng)響應(yīng)值MCT得率(R1)取最大值時(shí)，所得四因素最佳水平分別為：壓力9.13 MPa，酶添加量4.18%，時(shí)間10.21 h，底物摩爾比2.98:1，對應(yīng)MCT得率最大值為94.406%。

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

為了檢驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面方法分析所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到MCT得率為95.1%。預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，從而證實(shí)了模型的有效性。馬傳國等[25]采用Lipozyme 435為催化劑，對無溶劑體系中酶促合成中碳鏈甘三酯進(jìn)行了研究，得出最適反應(yīng)時(shí)間為16 h，最終MCT得率為92.10%，所以本研究方法反應(yīng)時(shí)間縮短了5.8 h，MCT得率提高了3%。本研究對酯化產(chǎn)物中各組分含量和酯化產(chǎn)物的理化指標(biāo)進(jìn)行了分析，結(jié)果見表5、表6。

表5 酯化產(chǎn)物中各組分含量

表6 酯化產(chǎn)物的理化指標(biāo)

由表5、表6可以看出，脂肪酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了98.62%，MCT得率為95.10%，產(chǎn)品的顏色較淺，說明該方法有效的提高了脂肪酸的利用率及MCT得率，且所得產(chǎn)品具有良好的應(yīng)用潛能。

3 結(jié)論

分別將2種脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme RM IM應(yīng)用于超臨界CO2體系中制備中碳鏈甘油三酯，通過對比酯化率和MCT得率，得出Novozyme 435催化的酯化反應(yīng)在10 h時(shí)達(dá)到平衡，酯化率和MCT得率都達(dá)到了最大，分別為97.3%和93.9%，而Lipozyme RM IM達(dá)到平衡所需要的時(shí)間較長，在13 h時(shí)酯化率和MCT得率最大，分別為86.3%和81.7%。因此，選用Novozyme 435作為催化劑，對超臨界CO2體系下酶法制備中碳鏈甘三酯的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)壓力9.1 MPa、反應(yīng)溫度90 ℃、酶添加量4.2%、底物摩爾比3:1和反應(yīng)時(shí)間10.2 h，在此條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到MCT得率為95.1%，酯化率為98.62%。酯化產(chǎn)物中甘二酯、甘一脂和游離脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.48%、2.04%和1.38%，且酯化產(chǎn)物的色澤較淺。與在無溶劑體系反應(yīng)相比[25]，本研究中脂肪酸的利用率提高了0.36%，MCT得率提高了3%，反應(yīng)時(shí)間縮短了5.8 h。

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Enzymatic Preparation of Medium-Chain Triglycerids in Supercritical CO2System

Jiang Yang1Li Dan1Wang Tong1Qi Xiaofen1Zhang Bokun2Yu Dianyu1
(College of Food Science and Technology Northeast Agricultural University1,Haerbin 150030) (Harbin Purun Oil and Fat Co.,Ltd.2,Haerbin 150028)

The medium-chain triglycerids as a low-energy fat have been widely used for their special physiological functions and metabolic pathways.In this paper,glycerin and the mixture of caprylic acid,and capric acid were used as raw materials to study the process conditions of enzymatic preparation of medium-chain triglycerids in supercritical CO2system and the esterification products were analyzed.Through the comparison of lipase,Novozym 435 was superior to Lipozyme RM IM.therefore,withlipase Novozym 435 selected as catalyst and medium-chain triglycerids yield as indicators,the response surface method was used to optimize the process conditions.It turned out that the optimal reaction conditions:reactionpressure，9.1 MPa,reaction temperature，90 ℃,enzyme addition,4.2%,substrate molar ratio,3:1;time,10.2 h.Under the reaction conditions,the medium-chain triglycerids yield was 95.1%,and esterification rate was 98.62%.The method effectively improved the utilization rate of fatty acids and MCT yield and the esterification product is light in color.

supercritical CO2system,enzymatic,medium-chain triglycerids,response surface optimization

TS224.8

A

1003-0174(2017)12-0075-06

“十三五”國家科技支撐計(jì)劃(2016YFD0401402)，國家自然科學(xué)基金(31571880)

2017-01-20

姜洋，女，1992年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，糧食、油脂與植物蛋白工程