大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在獸用生物制品的研究進(jìn)展

韓興?秦紅剛?熊亮?鄭江濤

動物細(xì)胞培養(yǎng)開始于本世紀(jì)初 1962 年， 其規(guī)模不斷的擴(kuò)大， 發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，， 而大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為生物技術(shù)制藥中非常重要的環(huán)節(jié)。目前， 大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在獸用生物制品上面，也已經(jīng)開始了一些大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)作為行業(yè)技術(shù)升級改革的重要內(nèi)容，農(nóng)業(yè)部自2012年2月1日起，停止受理轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線項目獸藥GMP驗收申請。因此，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝的應(yīng)用越來越受到限制使用。自從20世紀(jì)60年代微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)建立以來，國外許多國家對其在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛研究，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)已是當(dāng)前國際上生物制品生產(chǎn)的主流模式。動物細(xì)胞有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩種，技術(shù)水平的提高主要集中在培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、細(xì)胞特性的改變、不斷提高產(chǎn)品的產(chǎn)量及保證其質(zhì)量上。本文就大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，分析了其在獸用生物制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢。

一、動物細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞貼附在某種載體上，載體懸浮在反應(yīng)器里的培養(yǎng)方法，一切貼壁型細(xì)胞都能夠適用于貼壁培養(yǎng)。在實際生產(chǎn)中具有貼壁生長特性的細(xì)胞種類較多，如CHO細(xì)胞、PK—15細(xì)胞、ST細(xì)胞和Vero細(xì)胞等。由于貼壁細(xì)胞具有貼壁的要求，提高細(xì)胞的密度就是使細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模最大化的有效方法。傳統(tǒng)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)包括方瓶、扁瓶、轉(zhuǎn)瓶等。但是由于其不能有效監(jiān)控細(xì)胞的生長，操作比較復(fù)雜，所占空間大，勞動量也大，貼附面積具有限制性，在實際生產(chǎn)使用中受到極大的限制。目前，貼壁細(xì)胞的微載體培養(yǎng)在細(xì)胞生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用。

2.懸浮培養(yǎng)

懸浮生長的細(xì)胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡便，細(xì)胞經(jīng)過一定程度的馴化培養(yǎng)后，直接懸浮在適宜的液體培養(yǎng)基中，置于特定的培養(yǎng)條件下即可良好的生長。傳代時也不需要再進(jìn)行分散，只需要添加一定比例的培養(yǎng)基即可繼續(xù)生長。目前用于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也在逐漸增加，以前主要有昆蟲細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞等，現(xiàn)在發(fā)展到BHK-21和sk6細(xì)胞等，懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)的規(guī)模大，操作工藝也簡單，培養(yǎng)的細(xì)胞增殖快，而且產(chǎn)量高，是大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的首選模式之一。

3.動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，參考了早期的流式細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)、融合了固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、填充床培養(yǎng)技術(shù)、更是匯合了人工灌流和攪拌系統(tǒng)等生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來的，目前已廣泛用于生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。目前較成熟且有應(yīng)用價值的規(guī)模化培養(yǎng)方法主要包括：中空纖維法、微囊法和微載體法等。

空心纖維法：空心纖維培養(yǎng)法是Richard krrcazek等在1972年創(chuàng)建的，最初使用的空心纖維是由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性濾膜，外徑約為1/3～3/4mm，表面具有海綿多孔結(jié)構(gòu)，能水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體透過，也能讓細(xì)胞貼附在上面生長。這種培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分是由3～6層這樣的空心纖維組成的，培養(yǎng)時將待培養(yǎng)細(xì)胞接種于空心纖維的外腔，培養(yǎng)一段時間后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定密度時，細(xì)胞不再增殖，但能正常維持并繼續(xù)分泌所需的蛋白質(zhì)或其他生物物質(zhì)。這種培養(yǎng)方式在分離和純化細(xì)胞分泌物時很方便，因而在生產(chǎn)激素和單抗時被廣泛應(yīng)用。

微囊法：微囊細(xì)胞培養(yǎng)法是美國Damon Biotech公司創(chuàng)建的一種比較理想的大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其基本技術(shù)是先將要培養(yǎng)的動物細(xì)胞懸浮于海藻酸鈉溶液中，之后使其通過成滴裝置（微囊發(fā)生器）逐滴滴入CaCl2溶液中，海藻酸鈉一進(jìn)入CaCl2溶液后即形成半透膜微囊，從而將細(xì)胞封閉在內(nèi)，然后將包含有細(xì)胞的微囊懸浮于培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)可通過半透膜進(jìn)入微囊提供給細(xì)胞，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物也可透過半透膜被排出，而細(xì)胞分泌的大分子物質(zhì)則被阻攔而積累與囊內(nèi)。當(dāng)培養(yǎng)一段時間后，在細(xì)胞密度達(dá)到107/ml時，分離收集微囊，最后破開微囊就可獲得高度純化的大分子產(chǎn)物。

微載體法：微載體培養(yǎng)法是Wezel在1967年創(chuàng)建的。采用的微載體是由天然的葡聚糖、纖維素或膠原等物質(zhì)制成固體小球，直徑在60—250微米。其原理是將對細(xì)胞無害的微載體加入到培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞貼附于載體表面生長，同時通過持續(xù)攪拌使將載體均勻懸浮于培養(yǎng)液中，微載體方法不但能使細(xì)胞均勻分布，也提供了極大的培養(yǎng)表面積/體積比，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高，將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩則的特點，適用于各種細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，收獲過程簡單，而且放大生產(chǎn)也較容易。因而是一種比較理想的培養(yǎng)方法，只是此法對載體要求較高。

4.用于病毒生產(chǎn)的細(xì)胞系的選擇

目前，用于培養(yǎng)病毒的細(xì)胞系包括Vero細(xì)胞、BHK—21細(xì)胞、MDCK、PK—15、ST及Marc—145細(xì)胞等。Vero細(xì)胞是用來生產(chǎn)禽傳染性法氏囊病毒、狂犬病毒等；MDCK用來制備禽流感病毒；PK—15用來培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒；Marc—145細(xì)胞用來培養(yǎng)豬藍(lán)耳病病毒；ST細(xì)胞用來培養(yǎng)豬瘟病毒等。目前，這些病毒生產(chǎn)基本上都采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，所占場地大，操作復(fù)雜，批次間差異較大。目前國內(nèi)已有一些單位采用生物反應(yīng)器來優(yōu)化培養(yǎng)細(xì)胞、病毒的培養(yǎng)條件，并取得了一定的進(jìn)展，如利用生物反應(yīng)器純懸浮培養(yǎng)sf-9細(xì)胞生產(chǎn)桿狀病毒基因重組疫苗，應(yīng)用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng) BHK—21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒也成為了較成熟的口蹄疫疫苗生產(chǎn)方式，應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗。

二、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器

動物細(xì)胞生物反應(yīng)器作為細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備，目前較為常用的反應(yīng)器有：攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、固定床和流化床生物反應(yīng)器、一次性生物反應(yīng)器。

根據(jù)動物細(xì)胞培養(yǎng)類型不同，我們通常選用的的生物反應(yīng)器一般分為三類：懸浮培養(yǎng)用生物反應(yīng)器、貼壁培養(yǎng)用生物反應(yīng)器、包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器。endprint

1.懸浮培養(yǎng)用生物反應(yīng)器

懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器不需要使用微載體，細(xì)胞在生物反應(yīng)器中無需忒比，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中生長，如攪拌式生物反應(yīng)器。氣升式生物反應(yīng)器等，其中，攪拌式生物反應(yīng)器相比較氣升式而言，操作簡單，規(guī)模較容易放大。

2.貼壁培養(yǎng)用生物反應(yīng)器

貼壁用生物反應(yīng)器要使用微載體，細(xì)胞貼附在微載體上，懸浮于反應(yīng)器中的營養(yǎng)液中生長。如攪拌式生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器等。其中，攪拌式生物反應(yīng)器相比而言，放大較為容易。

3.包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器

包埋用生物反應(yīng)器使用多空載體或者微囊，細(xì)胞被截留在載體中或者包埋于微囊中，可以使用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。如流化床生物反應(yīng)器、固定床生物反應(yīng)器等，主要優(yōu)點在于可以最大程度降低攪拌式產(chǎn)生的剪切力對細(xì)胞的傷害。但是不容易放大培養(yǎng)。

三、生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)工藝的選擇

無論是貼壁細(xì)胞還是純懸浮細(xì)胞，按照其培養(yǎng)工藝都可以分為批次培養(yǎng)，流加培養(yǎng)以及灌注培養(yǎng)三種。

1.批次培養(yǎng)

批次培養(yǎng)主要采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，和培養(yǎng)基一次性加入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中除了調(diào)節(jié)pH和溶氧外，不添加其它成分，其體積不變，直至培養(yǎng)結(jié)束。

這種培養(yǎng)工藝操作簡單易學(xué)，可直觀的反應(yīng)細(xì)胞生長代謝的過程，主要應(yīng)用于生產(chǎn)抗體和蛋白方面。

但是批次培養(yǎng)，初始營養(yǎng)物質(zhì)豐富，易造成細(xì)胞過量使用，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，使細(xì)胞生長受到抑制。應(yīng)對措施在培養(yǎng)過程，尤其是在培養(yǎng)后期補(bǔ)充添加營養(yǎng)物質(zhì)。

2.流加培養(yǎng)

流加培養(yǎng)是在批次培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞等，細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基不適一次性地加入到反應(yīng)器中，而是在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞生長代謝的情況逐漸補(bǔ)加，維持葡萄糖、谷氨酰胺等營養(yǎng)物質(zhì)，從而使細(xì)胞持續(xù)生長至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平，流加培養(yǎng)由于其操作的簡易行、易放大性和靈活性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種生物制品的生產(chǎn)，如動物細(xì)胞表達(dá)的獸用生物制品的生產(chǎn)。

3.灌注培養(yǎng)

灌注培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地灌注新的培養(yǎng)基，同時地將部分培養(yǎng)基取出。

灌注培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用具有細(xì)胞截流裝置的攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物；近年來中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。另外一種形式是固定床和流化床生物反應(yīng)器，固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。

灌注培養(yǎng)的優(yōu)點是：①細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高細(xì)胞密度，一般可達(dá)107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；②連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；③反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；④產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。

不足之處在于操作繁瑣，培養(yǎng)基利用率低，工藝放大較困難。在生產(chǎn)中灌注培養(yǎng)主要應(yīng)用于貼壁細(xì)胞的懸浮微載體培養(yǎng)。

四、生物反應(yīng)器動物細(xì)胞培養(yǎng)放大工藝

反應(yīng)器的規(guī)模放大通常有兩種方法：增加反應(yīng)器的體積和增加反應(yīng)器的數(shù)量。目前在生產(chǎn)中一般將兩者結(jié)合起來。無論是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞，放大工藝都是采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶和反應(yīng)器不斷進(jìn)行逐級放大。根據(jù)細(xì)胞的兩種培養(yǎng)方法，培養(yǎng)放大工藝也份額外純懸浮放大工藝和微載體培養(yǎng)放大工藝。

1.純懸浮培養(yǎng)放大工藝

純懸浮培養(yǎng)方式生長環(huán)境均一，規(guī)模放大簡單，可直接實現(xiàn)反應(yīng)器到反應(yīng)器之間的放大，目前，此項技術(shù)較為成熟。

2.微載體培養(yǎng)放大工藝

微載體放大工藝較復(fù)雜，大規(guī)模生產(chǎn)中放大較為困難，細(xì)胞貼附在為載體上生長，要實現(xiàn)放大，需要將細(xì)胞從微載體上消化收獲下來，再接種到下一級的反應(yīng)器中，在實際生產(chǎn)中，細(xì)胞經(jīng)過消化，活性會受到傷害，影響其再次貼壁生長，因此目前國內(nèi)應(yīng)用微載體培養(yǎng)的反應(yīng)器體積一般較小，通常直接將轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞放大到反應(yīng)器中，對于進(jìn)一步放大還有一定的難度。

生物反應(yīng)器為主題的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝是提升我們生物制品企業(yè)生產(chǎn)效率、生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)。為了提高產(chǎn)能，降低成本，提升產(chǎn)品質(zhì)量，很多企業(yè)都加大研發(fā)和建立疫苗懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)線，但是在建立之前就需要明確上述前提條件：打算生產(chǎn)的疫苗品種以及預(yù)計所需要的產(chǎn)能大?。哼x擇生產(chǎn)所需要的細(xì)胞類型，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)特點，選擇細(xì)胞培養(yǎng)工藝，根據(jù)細(xì)胞和病毒的關(guān)系，選擇反應(yīng)器培養(yǎng)操作方式， 最后選取合適的生物反應(yīng)器和反應(yīng)器工藝。endprint