提高小麥葉枯菌篩選敏感度的方法

張志剛+王開梅+楊自文+萬中義+張遵霞

摘要：為了提高先導化合物殺菌活性篩選敏感度，選用小麥葉枯菌（Mycosphaerella graminicola）作為供試靶標，比較了半固體法殺菌活性篩選中的不同單孢子純培養(yǎng)對標準樣品殺菌活性的敏感度。結(jié)果表明，小麥葉枯菌不同單孢子純培養(yǎng)，對標準樣品的敏感度差異顯著?；谝陨辖Y(jié)果，使用微生物源發(fā)酵提取物對敏感的單孢子純培養(yǎng)和對照培養(yǎng)物進行了驗證篩選。結(jié)果表明，對1 920個樣品的篩選中，敏感的單孢子純培養(yǎng)比對照培養(yǎng)物的活性樣品檢出率提高2.24%，活性樣品檢出數(shù)量增加54.43%。

關(guān)鍵詞：小麥葉枯菌（Mycosphaerella graminicola）；先導化合物；篩選敏感度；半固體法；單孢子

中圖分類號：S482.2；S435.121.4+8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4510-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.022

Abstract： To improve sensitivity for fungicidal activity screening of lead compounds，Mycosphaerella graminicola was selected as test target to compare the sensitivity of different pure cultures from single spore to fungicidal activity of standard samples in semisolid fungicide screening. The results showed that sensitivity was significant different between different pure cultures. Based on above results， the sensitive pure culture and the reference culture were verified and screened with microbial fermentation extracts， it was concluded that in screening of 1 920 samples， the hits rate of sensitive pure culture rose by 2.24% and the number of hits increased 54.43% comparing with the reference culture.

Key words： Mycosphaerella graminicola； lead compound； sensitivity of screening； semisolid screening； single spore

在殺菌劑的先導化合物篩選中，樣品的殺菌活性強度是化合物和供試靶標菌在特定環(huán)境條件下的協(xié)同表現(xiàn)，因此，它不僅與化合物自身的殺菌特性有關(guān)，同時也受供試靶標菌的敏感性、測試培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度以及化合物在培養(yǎng)過程中的降解等因素的影響。在微生物源先導化合物高通量篩選體系中，篩選敏感性的提高就等同于提高了整個篩選流程的篩選效率，提高樣品的利用率，也減少了新化合物的漏篩。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 小麥葉枯菌（Mycosphaerella graminicola） 本試驗中使用的小麥葉枯菌，是以ATCC 62714為原始菌株，菌種保存溫度為-70 ℃，經(jīng)過彈土法活化，再進行單孢子分離純化。

1.1.2 殺菌劑標準樣品 嘧菌酯（Azoxystrobin 95%）、咪鮮胺（Prochloraz 98%）。

1.1.3 試劑 無水乙醇，PDA、PDB培養(yǎng)基，瓊脂粉，以上試劑均為市售生化試劑。

1.1.4 微生物源提取物 由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物資源研究室提供。

1.1.5 主要儀器、設(shè)備 血球計數(shù)板、光學顯微鏡、高壓滅菌鍋、超聲波振蕩器、電子移液器（MCE8k）、Intega 96通道移液機、96孔組織培養(yǎng)板（深孔）、96孔組織培養(yǎng)板（淺孔）、人工氣候箱（光、溫可調(diào)）、超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥葉枯菌單孢子純培養(yǎng)制備[1] 原始菌株凍干粉（ATCC 62714）以彈土法在PDA培養(yǎng)基上進行單菌落分離培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后，選取分界清晰的菌落7個，進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)3周備用。小麥葉枯菌（Mycosphaerella graminicola）孢子懸浮液制備：取上述7個培養(yǎng)物（直徑9 cm培養(yǎng)皿），分別在培養(yǎng)皿中加入10 mL無菌水，洗下孢子，制成孢子母液。以滅菌的醫(yī)用紗布過濾掉菌絲，用無菌水稀釋，制成孢子懸浮液。每毫升孢子懸浮液含孢子20～30個。移取1 mL孢子懸浮液，均勻涂布在PDA培養(yǎng)基表面。每個培養(yǎng)物使用4個分離培養(yǎng)皿。培養(yǎng)2周后，從每組純培養(yǎng)中選取菌落分布均勻的培養(yǎng)皿，每組選擇3個分界清晰的菌落編號。把選出的單孢子菌落接種于斜面培養(yǎng)基，制成菌種，編號保存。同時，各單孢子菌落接種于PDB液體培養(yǎng)基，在250 mL三角燒瓶中進行搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后，移取1 mL搖瓶發(fā)酵液作為菌種，涂布在培養(yǎng)皿培養(yǎng)基表面，繼續(xù)培養(yǎng)2周后，即獲得單孢子純培養(yǎng)。21個單孢子均重復制備5份，備用。

1.2.2 小麥葉枯菌對照培養(yǎng)物準備 直接取少量原始菌株凍干粉，接種于PDB液體培養(yǎng)基，在250 mL三角燒瓶中進行搖瓶發(fā)酵活化。培養(yǎng)2周后，移取 1 mL搖瓶發(fā)酵液作為種子，涂布在培養(yǎng)皿培養(yǎng)基表面，進行擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后，作為對照培養(yǎng)物。重復制備對照培養(yǎng)物5份。

1.2.3 小麥葉枯菌單孢子純培養(yǎng)及對照培養(yǎng)物對標準樣品的敏感性試驗[2]

1）感染培養(yǎng)基的制備：以標準PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0.7%瓊脂，配制成半固體感染培養(yǎng)基。分別在各純培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中加入10 mL無菌水，洗下孢子，過濾，制成孢子懸浮液，計數(shù)后備用。根據(jù)孢子懸浮液的孢子濃度，以培養(yǎng)基（接種溫度55 ℃左右）進行稀釋，備用。孢子在感染培養(yǎng)基中的濃度為104個/mL。

2）把兩個標準品配制成母液，濃度為0.2 mg/mL，以無菌水稀釋成12個不同的濃度梯度。把樣品稀釋液加入96孔組織培養(yǎng)板（淺孔）中，加入量為0.01 mL/孔。每個濃度設(shè)2個重復。重復試驗3次。

3）把上述1）中的感染培養(yǎng)基分裝到2）的96孔組織培養(yǎng)板中，每孔加入0.09 mL[3]。以上述相同方法處理對照培養(yǎng)物，作為單孢子純培養(yǎng)的參照。培養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度70%～80%，遮光培養(yǎng)。4 d后檢查并記錄結(jié)果。根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用分級指標數(shù)（0、3、5、7、9）標記殺菌活性[4]，計算LC50。

4）小麥葉枯菌的單孢子純培養(yǎng)及對照培養(yǎng)物對微生物源提取物的篩選試驗[5]隨機選擇提取物樣品480個，把提取物配制成母液，濃度為4 mg/mL，以無菌水稀釋到0.8 mg/mL。預(yù)先把提取物樣品稀釋液加入96孔組織培養(yǎng)板（淺孔）中，加入量為0.01 mL/孔。根據(jù)“1.2.3”的試驗結(jié)果，選擇最敏感的單孢子純培養(yǎng)制備感染培養(yǎng)基，向已加入了提取物樣品稀釋液的組織培養(yǎng)板中注入感染培養(yǎng)基，感染培養(yǎng)基加入量0.09 mL/孔。至此，提取物終濃度為0.08 mg/mL，感染培養(yǎng)基孢子終濃度為9×103個/mL。每個樣品只用1個濃度進行篩選，每個濃度設(shè)2個重復。以上述相同方法處理對照培養(yǎng)物，作為單孢子純培養(yǎng)的篩選敏感性試驗的參照。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度70%～80%，遮光培養(yǎng)。根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用分級指標數(shù)（0、3、5、7、9）標記殺菌活性。4 d后檢查并記錄結(jié)果。分4周完成四批樣品的對比篩選，每批樣品均為480個，篩選樣品總量為1 920個。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥葉枯菌不同單孢子純培養(yǎng)對標準樣品的敏感性試驗結(jié)果

以彈土法分離出的7個菌落，編號為A、B、C、D、E、F、G。進一步對7個培養(yǎng)物進行重復分離純化，每個培養(yǎng)物中分選出3個單孢子，編號為1、2、3。擴大培養(yǎng)，獲得單孢子純培養(yǎng)21個。測定21個單孢子純培養(yǎng)及對照培養(yǎng)物對兩個標準樣品的敏感性。由表1可知， C組單孢子純培養(yǎng)對嘧菌酯最敏感，LC50平均值為0.336 μg/mL，G組單孢子純培養(yǎng)對嘧菌酯最不敏感，LC50平均值為2.712 μg/mL，后者為前者的8.079倍； C組單孢子純培養(yǎng)對咪鮮胺最敏感，LC50平均值為0.016 μg/mL，G組單孢子純培養(yǎng)對咪鮮胺最不敏感，LC50平均值為0.065 μg/mL，后者為前者的4.083倍。

2.2 小麥葉枯敏感菌株與對照菌株對微生物源提取物的對比篩選結(jié)果

根據(jù)“2.1”的試驗結(jié)果，選擇C-3號菌株進行擴大培養(yǎng)，按照“1.2.3”的方法1）制備單孢子純培養(yǎng)和對照菌株的感染培養(yǎng)基。為了簡化數(shù)據(jù)處理，篩選結(jié)果無論活性強弱，均都統(tǒng)計為有活性。由表2可知，單孢子純培養(yǎng)組的活性樣品檢出率提高了2.24%，活性樣品檢出數(shù)量增加了54.43%。可見單孢子純培養(yǎng)提高了篩選的敏感度。

3 小結(jié)與討論

殺菌劑先導化合物篩選的目標是具有殺菌活性的新化合物，這些新化合物的活性通常較弱，活性和結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定。為了提高新藥篩選的效率，一方面通過優(yōu)化篩選方法，使用快速、微型化的生物測定方法來提高篩選的靈敏度和篩選通量；另一方面是選擇敏感的篩選靶標提高篩選敏感度。使用合適的敏感菌株，可以讓新藥篩選事半功倍。通常從田間分離或者經(jīng)過長期保藏的菌株，由于菌株分離的地域、氣候、環(huán)境等差異，菌株敏感性差異較大，并不適用于新藥篩選。小麥葉枯菌是Dothideales科的模式真菌，其孢子產(chǎn)量大，非常適合高通量篩選，但國內(nèi)還沒有找到適用的敏感菌株。本次對ACTT 62714菌株凍干樣品進行的單孢子分離純化，獲得的不同單孢子純培養(yǎng)對標準樣品的敏感性差異較大。在對敏感菌株進行的驗證篩選中，檢出的活性樣品量比對照菌株也有顯著提高。對于大多數(shù)病原真菌，以單孢子分離純化的方法來篩選更敏感的供試菌，敏感度提升的空間不太大。但這種方法的優(yōu)點在于，既提高了篩選的敏感度，又保證了供試菌品系的延續(xù)性。小麥殼針孢葉枯病在中國多為無性世代，在新西蘭、澳大利亞、英國等國家多為有性世代，品系間差異性大，要找到一個合適的敏感菌株，還需要收集更多的菌株樣本進行篩選和馴化。

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