黃赭色鏈霉菌固體菌劑的研制及其對小麥幼苗生長的影響

何文 劉金龍 寇娟妮 湯正帥 劉麗英 孫中濤

（1. 山東農業(yè)大學泉林黃腐酸肥料工程實驗室，泰安 271018；2. 山東農業(yè)大學生命科學學院，泰安 271018）

黃赭色鏈霉菌固體菌劑的研制及其對小麥幼苗生長的影響

何文1，2劉金龍2寇娟妮2湯正帥2劉麗英2孫中濤1，2

（1. 山東農業(yè)大學泉林黃腐酸肥料工程實驗室，泰安 271018；2. 山東農業(yè)大學生命科學學院，泰安 271018）

為了提高黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的生物穩(wěn)定性，通過對其載體、保護劑和分散劑等助劑的用量進行優(yōu)化，確定最佳配方，并采用盆栽試驗研究其對小麥幼苗生長的影響。結果表明，黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的最佳配方以重量百分比計為：黃赭色鏈霉菌SN16原粉20%，海藻酸鈉溶液（1 mg/mL）24%，羧甲基纖維素鈉溶液（10 mg/mL）24%，硅藻土32%。在此條件下，在4℃保存60 d后菌劑的生物量為2.45×108CFU/g，常溫保存下60 d后其生物量能達0.94×108CFU/g。盆栽實驗結果表明，與對照相比，施用1%濃度的黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的小麥幼苗的株高、株鮮重和株干重分別提高了9.85%、57.90%、66.67%，均達到了顯著水平（P＜0.05）；但對根長的促生作用未達到顯著水平（P＞0.05）。研究結果為農業(yè)生產提供一種新型的黃赭色鏈霉菌菌劑。

黃赭色鏈霉菌；微生物菌劑；助劑；小麥；幼苗生長

為了實現(xiàn)農產品的高產和穩(wěn)產，農業(yè)生產過程往往會大量的施用化學肥料和農藥，致使生態(tài)環(huán)境日趨嚴重［1］。為了農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，現(xiàn)代農業(yè)向綠色農業(yè)、生態(tài)農業(yè)方向轉變已成為必然，微生物菌劑在其中的作用也日趨突出［2］。近年來，微生物菌劑被廣泛的應用于生物防治中，迄今已有木霉菌［3］、枯草芽孢桿菌［4］和哈茨木霉［5］等微生物菌劑的相關報道，但關于黃赭色鏈霉菌菌劑的研制尚屬空白。

由于微生物菌劑對外界環(huán)境因素（濕度、溫度和光照等）比較敏感，容易導致菌劑儲存的穩(wěn)定性差［6］，因此在實際生產微生物菌劑的過程中，可通過添加一些助劑來提高菌劑的穩(wěn)定性，延長菌劑的保存期限［7］。目前國內外已有關于助劑對假單胞菌菌劑［8-9］、解淀粉芽孢桿菌BA-12可濕性粉劑［10］等的相關報道，而關于助劑對黃赭色鏈霉菌菌劑的影響鮮有報道。黃赭色鏈霉菌SN16為本實驗室分離篩選并保藏的放線菌，對水稻惡苗病菌、層出鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等有較好的拮抗作用。

因此，本試驗將在前期研究工作的基礎上，根據(jù)黃赭色鏈霉菌SN16的特性，對載體、保護劑和分散劑等進行篩選，旨在研發(fā)出一種便于貯藏的黃赭色鏈霉菌SN16菌劑，并探究其對小麥幼苗生長的影響，為新型的黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的工業(yè)化生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為黃赭色鏈霉菌SN16，由山東農業(yè)大學微生物工程實驗室提供；供試小麥品種：“優(yōu)麥2號”，購自購自泰安市泰山區(qū)農大種業(yè)。

供試試劑：小米粉、麥麩、硅藻土、非耕作層黃土、高嶺土、碳酸鈣、碳酸鎂、幾丁質、羧甲基纖維素鈉（CMC）、海藻酸鈉、腐植酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tween-80。培養(yǎng)基：高氏 1 號培養(yǎng)基［11］，固體培養(yǎng)基（小米粉麥麩培養(yǎng)基）。

1.2 方法

1.2.1 黃赭色鏈霉菌SN16種子液的制備 將保藏的黃赭色鏈霉菌SN16接入高氏1號培養(yǎng)基平板上活化，28℃培養(yǎng)3 d。然后將菌株SN16接種于裝有

100 mL高氏1號液體培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，于28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.2 黃赭色鏈霉菌SN16原粉的制備 以黃赭色鏈霉菌SN16固態(tài)發(fā)酵制備原粉，即80%小米粉與20%麥麩混勻，加入蒸餾水，使初始含水量達到50%，接種量10%，pH自然，28℃培養(yǎng)7 d。待發(fā)酵完成后取出培養(yǎng)物，于35℃恒溫鼓風干燥。粉碎后即為黃赭色鏈霉菌SN16原粉，備用。

1.2.3 不同載體對黃赭色鏈霉菌SN16生長的影響 選用硅藻土、非耕作層黃土、高嶺土、碳酸鈣、幾丁質和碳酸鎂等6種材料作為載體，分別以5%的量添加到含該菌的液體高氏1號培養(yǎng)基中，于28℃，180 r/min培養(yǎng)48 h。采用平板菌落計數(shù)法［11］，并觀察不同載體下SN16菌落生長情況。

1.2.4 載體對黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的影響 在1.2.3的基礎上，將對菌株SN16生長具有促進作用的載體以5∶8的比例與黃赭色鏈霉菌SN16原粉混合，分別包裹于牛皮紙中，以不添加載體的處理組為對照（CK），置于54℃培養(yǎng)7 d，采用平板菌落計數(shù)法測定各處理的存活率。每個處理重復3次。

1.2.5 保護劑的篩選 以腐植酸、海藻酸鈉作為保護劑，根據(jù)其化學性質，分別配制成0.1%、0.5%和1%濃度的溶液，以5∶6的比例與黃赭色鏈霉菌SN16原粉混合，并于54℃培養(yǎng)7 d。采用平板菌落計數(shù)法測定各處理的存活率，每個處理重復3次。

1.2.6 分散劑的篩選 以十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tween-80和羧甲基纖維素鈉（CMC）為分散劑，分別配制成0.1%、0.5%和1%濃度的溶液，以5∶6的比例與黃赭色鏈霉菌SN16原粉混合，并于54℃培養(yǎng)7 d。采用平板菌落計數(shù)法測定各處理的存活率，每個處理重復3次。

1.2.7 貯存時間對黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的影響 將優(yōu)化后的載體、保護劑和分散劑按比例與黃赭色鏈霉菌SN16原粉混合，分別置于28℃和4℃的環(huán)境中儲存，以不添加任何物質的原粉為對照組（CK），于1、7、15、30、45和60 d時定期取樣，采用平板菌落計數(shù)法測定各處理的活菌數(shù)。每個處理重復3次。

1.2.8 黃赭色鏈霉菌SN16菌劑對小麥幼苗生長的影響 精選大小一致、無病害的小麥種子，經5%的次氯酸鈉表面消毒后，播種于含有310 g無菌土的花盆中（下直徑10 cm，上直徑15.5 cm，高度12.5 cm），每盆10粒種子。待小麥出芽后對其進行根灌處理，分別取5 mL 1%、2%和3%濃度的SN16菌劑澆于小麥根部，對照組施用等量無菌水，采用完全隨機排列。培養(yǎng)期間澆灌清水保持土壤濕潤，于培養(yǎng)45 d后測定相關指標。

1.2.9 測定項目及方法 采用平板菌落計數(shù)法測定相關活菌數(shù)，存活率（%）=第n天活菌數(shù)/初始活菌數(shù)×100%。

從各個處理組隨機選取5株小麥幼苗，采用卷尺測定小麥幼苗的株高和根長；采用分析天平測定幼苗的株鮮重；將幼苗于105℃殺青15 min，80℃烘干至恒重后，采用分析天平測定其株干重。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22軟件分析處理，采用Excel 2010作圖，以LSD法做多重比較分析。

2 結果

2.1 黃赭色鏈霉菌SN16菌粉的助劑優(yōu)化結果

2.1.1 載體對黃赭色鏈霉菌菌株SN16活性的影響 由表1所可知，添加硅藻土和非耕作土的處理，SN16菌株的生物量均顯著高于對照（P＜0.05），添加碳酸鈣和高嶺土的處理與CK間的差異不顯著（P＞0.05），而添加幾丁質和碳酸鎂的處理，SN16菌株的生物量均顯著低于對照（P＜0.05）。這說明硅藻土與非耕作土對SN16菌株的生長具有促進作用，碳酸鈣和高嶺土對SN16菌株的生長沒有顯著影響，而幾丁質和碳酸鎂對SN16菌株的生長具有抑制作用。因此，硅藻土、非耕作土、碳酸鈣和高嶺土均可作為載體，而幾丁質和碳酸鎂不適合作為載體。

表1 不同載體對黃赭色鏈霉菌SN16生長的影響

2.1.2 不同載體對黃赭色鏈霉菌SN16菌粉熱貯穩(wěn)定性的影響 硅藻土、非耕作土、碳酸鈣和高嶺土等4種載體分別和菌粉混勻，于54℃的環(huán)境下貯存7 d，發(fā)現(xiàn)不同處理的活菌數(shù)出現(xiàn)了顯著變化（圖1）。平均值多重比較結果（α=0.05），以硅藻土、碳酸鈣為載體的菌粉與非耕作土、高嶺土和空白對照的差異顯著。表明硅藻土和碳酸鈣對菌株的保護作用較好，7 d后菌劑的活菌數(shù)分別是CK的3.04倍和2.08倍；非耕作土和高嶺土對菌株的保護作用較差，但活菌數(shù)也均高于CK。

圖1 不同載體對黃赭色鏈霉菌SN16菌粉熱貯穩(wěn)定性的影響

2.1.3 保護劑對黃赭色鏈霉菌SN16菌粉熱貯穩(wěn)定性的影響 由表2可知，腐植酸可以提高菌粉的熱穩(wěn)定性，當腐植酸添加量為0.1%時，黃赭色鏈霉菌SN16的存活率達36.54%，與CK相比提高了29.73%，但繼續(xù)增大腐植酸的添加量，黃赭色鏈霉菌SN16的活菌數(shù)減少，存活率降低。從表3可知，在熱貯存的條件下，隨著海藻酸鈉濃度的增加，黃赭色鏈霉菌SN16的活菌數(shù)不斷減少，存活率也不斷降低，其中0.1%濃度的海藻酸鈉對黃赭色鏈霉菌SN16的保護作用最好，存活率達到64.35%，與CK相比提高了58.00%。這表明適宜添加量的腐植酸和海藻酸鈉對SN16菌粉具有保護作用。在熱貯存7 d后，添加0.1%海藻酸鈉的菌粉的存活率比添加了0.1%腐植酸的菌粉高出27.81%，說明添加0.1%海藻酸鈉更利于SN16菌粉的貯藏。因此，本研究選取0.1%的海藻酸鈉作為保護劑。

表2 不同濃度的腐植酸對黃赭色鏈霉菌SN16菌粉的保護作用

表3 不同濃度的海藻酸鈉對菌株的保護作用

2.1.4 分散劑對黃赭色鏈霉菌SN16菌粉熱貯穩(wěn)定性的影響 由表4-6可知，在熱貯存條件下，添加CMC、SDS和Tween-80后的菌劑存活率明顯高于CK。其中，添加1%的CMC的菌粉的存活率為15.70%，添加1%的SDS菌粉存活率為13.62%，添加1%的Tween-80菌粉存活率為14.31%，均與CK差異顯著（P＜0.05）。其中以添加1% CMC的菌粉存活率和活菌數(shù)最高，分別比CK提高了9.17%、2.45×108CFU/g，這可能是CMC對孢子的分散和活力的提高都有促進作用。因此，本研究選取1%的CMC為最佳分散劑。

2.1.5 黃赭色鏈霉菌SN16菌劑有效活菌數(shù)的測定 由圖2可知，黃赭色鏈霉菌SN16在添加的助劑中存活情況隨著培養(yǎng)時間的延長而發(fā)生改變，添加助劑的菌劑的活菌數(shù)均高于CK。添加助劑的菌劑在常溫（25℃）下，其活菌數(shù)下降迅速，但在15 d后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，到60 d時，活菌數(shù)為0.94×108CFU/g，存活率達到10.00%。添加助劑的菌劑在4℃的貯存條件下，活菌數(shù)下降較為緩慢，到60 d時，其活菌數(shù)是2.45×108CFU/g，存活率為24.90%，與不添加任何助劑的CK的存活率相比，高17.34%。說明加入助劑的菌劑比未加入助劑的菌劑更利于貯藏，生物活性更穩(wěn)定。

表4 不同濃度的CMC對菌株的分散作用

表5 不同濃度的SDS對菌株的分散作用

表6 不同濃度的Tween-80對菌株的分散作用

圖2 菌劑有效活菌數(shù)測定結果

2.2 黃赭色鏈霉菌SN16菌劑對小麥幼苗生長的影響

黃赭色鏈霉菌SN16菌劑對小麥幼苗生長的影響如表7所示。施用1%黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的處理（T1），小麥幼苗的株高比對照提高了9.85%，達到了顯著水平（P＜0.05），而施用2%和3%的處理（T2和T3），小麥幼苗的株高與對照差異不顯著（P＞0.05）。與對照相比，T1和T2 的根鮮重與根干重均顯著增大（P＜0.05）；T1和T2之間，雖然根鮮重差異顯著（P＜0.05），但根干重差異并不顯著（P＞0.05）；T3的根鮮重與根干重與對照差異不顯著（P＜0.05）。綜合考慮應用效果和使用成本，宜選擇1%為黃赭色鏈霉菌SN16菌劑最佳施用量。

表7 不同濃度的菌劑對小麥幼苗生長的影響

3 討論

微生物菌劑的貯存穩(wěn)定性直接影響其產品質量與應用效果。選擇合適的載體和添加保護劑可以提高微生物菌劑的貯存穩(wěn)定性。硅藻土的主要成分為SiO2，其結構呈微孔狀，孔隙度較寬、孔洞排列整齊、吸收性好、比表面積大、耐磨、熱穩(wěn)定好，附著力強，對微生物有保護作用，是生產微生物菌劑常用的載體之一［12-13］。本研究證實硅藻土作為黃赭色鏈霉菌SN16的載體，其應用效果優(yōu)于高嶺土、碳酸鈣、幾丁質等常用載體，這與騫天佑［16］報道一致。

放線菌具有適應環(huán)境的能力強，能夠在植物根系和根周圍的土壤中定殖，并產生多種抗生素和分泌多種胞外水解酶［14］，能產生存活時間長的孢子等優(yōu)點，有利于工業(yè)化生產及應用，但放線菌必須與合適的助劑混合到一起，才能發(fā)揮更好的作用［15］。許多性狀優(yōu)良的放線菌制劑已經應用于農業(yè)生產中，騫天佑等［16］采用添加非耕作層黃土的生防放線菌153活菌劑明顯提高了茄子的防病能力；申光輝等［17］研究表明，硅酸鉀與密旋鏈霉菌Act12菌劑配施可顯著促進連作草莓生長，提高果實產量及品質。然而目前國內尚無黃赭色鏈霉菌菌劑的相關報道。本研究盆栽試驗表明，施用一定濃度的黃赭色鏈霉菌SN16菌劑能夠有效促進小麥的根長、株鮮重、株干重，這與田琴［18］的研究結果相一致。本研究初步確定了黃赭色鏈霉菌SN16菌劑的各項組分，并探討了其對小麥幼苗生長的影響，而對于黃赭色鏈霉菌SN16菌劑在田間的應用效果如何，后續(xù)試驗對此將進一步深入研究。

4 結論

通過單因素實驗確定了菌劑的最佳配方：黃赭色鏈霉菌SN16原粉20%，海藻酸鈉溶液（1 mg/mL）24%，CMC溶液（10 mg/mL）24%，硅藻土32%。添加這3種助劑后，黃赭色鏈霉菌SN16活體粉劑于4℃保存60 d后其生物量為2.45×108CFU/g，存活率達到24.90%，常溫保存60 d后能達到0.94×108CFU/g。盆栽實驗結果表明，1%濃度的黃赭色鏈霉菌SN16菌劑能夠對小麥幼苗的株高、鮮重、株干重具有顯著的促進作用，分別比對照組提高了9.85%、57.90%和66.67%。

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Development of Microbial Inoculum of Streptomyces silaceus and Its Effect on Wheat Seedling Growth

HE Wen1，2LIU Jin-long2KOU Juan-ni2TANG Zheng-shuai2LIU Li-ying2SUN Zhong-tao1，2
（1. Shandong Agricultural University，Quan Lin Humic Acid Fertilizer Engineering Laboratory，Tai’an 271018 ；2. College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018）

In order to improve the stability of microbial agents with Streptomyces silaceus SN16，the amounts of carriers，protectants and dispersants were optimized and the optimal formula of them was determined，and the influence of which on wheat seedling growth was studied by pot experiment. Results showed that the optimal formula of the microbial agent was Streptomyces SN16 20%，sodium alginate solution（1 mg/mL）24%，sodium carboxymethyl cellulose（CMC）solution（10 mg/mL）24%，and diatomaceous earth 32%. By this formula，the biomass of microbial inoculum was 2.45×108CFU/g while conserved at 4℃ and 0.94×108CFU/g at room temperature after 60 d. Pot experiment demonstrated that the plant height，fresh weight and dry weight of wheat seedlings applied with microbial agent of 1% Streptomyces silaceus SN16 increased by 9.85%，57.90% and 66.67% compared to the CK，respectively，which reached significant level（P＜0.05）. However，its promoting effect on root was insignificant（P＞0.05）. This research provides a new type of Streptomyces silaceus agent for agricultural production.

Streptomyces silaceus；microbial agents；additives；wheat；seedling growth

2017-05-17

山東農業(yè)大學泉林黃腐酸肥料工程實驗室開放研發(fā)基金項目（QL2016-6），山東省科技重大專項（2015ZDXX0502B04），山東省農業(yè)重大應用技術創(chuàng)新項目（2015年）

何文，女，碩士研究生，研究方向：微生物工程；E- mail：wenhehw11@163.com

孫中濤，男，博士，研究方向：農業(yè)微生物工程，E-mail：zhtsun@sdau.edu.cn；劉麗英，女，博士，研究方向：農業(yè)微生物工程，E-mail：llylxy@163.com

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0402

（責任編輯 朱琳峰）