小麥和綠豆根形態(tài)及細胞結構對喜馬拉雅紫茉莉根水浸提液的化感作用響應

劉勝利 馬世堯 吳曉飛 史軍娜 周曉陽 蘭小中 盧存福

（1. 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院 林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2. 西藏農牧學院食品科學學院，林芝 860000）

小麥和綠豆根形態(tài)及細胞結構對喜馬拉雅紫茉莉根水浸提液的化感作用響應

劉勝利1馬世堯1吳曉飛1史軍娜1周曉陽1蘭小中2盧存福1

（1. 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院 林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2. 西藏農牧學院食品科學學院，林芝 860000）

為了探究喜馬拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica）根部水浸提液的化感作用，以小麥和綠豆作為供試材料進行了研究，結果表明這兩種植物在經過喜馬拉雅紫茉莉根部的水浸提液處理8 d后，細胞和組織形態(tài)結構受到了明顯的化感抑制作用影響。利用透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡分別觀察和分析兩種作物在水浸提液處理后的根系形態(tài)和細胞結構，結果發(fā)現(xiàn)小麥和綠豆的根尖結構已不完整，部分表皮細胞脫落，細胞間的空隙加大，組織間出現(xiàn)了斷層和空腔，細胞間緊密排列的結構也被打亂，有內含物滲出；細胞膜萎縮，逐漸發(fā)生了質壁分離，細胞質中液泡變大，細胞核出現(xiàn)了消融現(xiàn)象，一些主要的細胞器如內質網、線粒體、高爾基體等結構遭受了破壞或解體，數量減少，植物生命活動受到了嚴重的抑制。以上結果反映了喜馬拉雅紫茉莉根部的水浸提液對兩種常見作物都具有較強的化感抑制作用。

喜馬拉雅紫茉莉；化感作用；植物形態(tài)；細胞結構

喜馬拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica）主要分布于我國甘肅、陜西、云南、四川及西藏等地，生長在海拔700-3 300 m的草地或者山坡路旁，為外來入侵種植物［1-2］。作為西藏地區(qū)傳統(tǒng)的藏藥植物［3-4］，近年來，已經有一些文獻報道了喜馬拉雅紫茉莉種子和根提取物中含有大量的化感作用抑制物質［5-6］，這也是其產生連作障礙的主要因素之一［7-8］。

受化感抑制作用影響的植物，多表現(xiàn)為種子萌發(fā)率下降，幼苗的鮮重、根長和苗高受到明顯抑制［9-12］。這些表觀形態(tài)上的變化，究其本質，是這些植物在細胞和分子水平上受化感作用影響所產生的綜合效應［13-17］。植物的根長期固著于土壤中，為植株的生長提供必需的水分和礦物質營養(yǎng)，其細胞結構及功能的完整性對植株的生長和發(fā)育起到至關重要的作用，利用化感物質提取物處理幼苗，會使得幼苗根部的組織細胞及細胞器均受到不同程度的影響并做出相應的改變［18］。因此，對這些受化感作用影響的植物形態(tài)及細胞顯微結構變化的研究，將有利于深入探討化感作用的微觀機制，也是近年來研究的熱點［19］。目前，對于藏藥植物喜馬拉雅紫茉莉的研究，尤其是在其化感抑制作用方面的研究和報道還相對較少，且主要集中在生理和生態(tài)學的宏觀層面上，對于植物化感抑制作用導致的目標植物細胞水平上的結構變化和損傷情況還未見報道。本研究依托透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡技術［20］對喜馬拉雅紫茉莉根部的水浸提液處理后的小麥和綠豆的根尖細胞的超微結構、細胞分裂及幼苗初期的生理形態(tài)的變化進行了比較和研究，旨為揭示喜馬拉雅紫茉莉根部化感物質在細胞水平上的作用機制提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

喜馬拉雅紫茉莉 自海拔3 000 m左右的西藏林芝地區(qū)，以常見的小麥、綠豆作為供試實驗材料。本研究中所使用到的主要試劑有：雙蒸水，3%的戊二醛溶液，1.5%的高錳酸鉀溶液，30%、50%、70%、80%、90%以及100%的無水乙醇，磷酸緩沖液，醋酸異戊酯，導電膠，丙酮，包埋劑，醋酸鈾；儀器：超高速萬能粉碎機，100目篩，恒溫震蕩搖床，0.22 μm濾膜，離子濺射儀，萊卡IJC-6型超薄切片機（德國萊卡公司），日立S4800掃描電鏡以及透射電鏡。

1.2 方法

1.2.1 喜馬拉雅紫茉莉根部水浸提液制備 將喜馬拉雅紫茉莉根部用清水洗凈，室溫自然干燥，用超高速萬能粉碎機磨成粉狀，過100目篩，稱取100 g干燥粉末于試劑瓶中，加入1L雙蒸水，置于搖床震蕩提取24 h，溫度設置成室溫22℃，將轉速調高至200 r/min，以保證充分提取。將粗提液經兩層紗布過濾后，再用兩層濾紙過濾，將過濾后的浸提液過0.22 μm濾膜除菌，配制成0.1 g/mL的浸提液母液，用無菌蒸餾水分別配制成濃度為0.012 5、0.025、0.05、0.1 g/mL的處理液，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 實驗材料的處理 選取小麥、綠豆萌發(fā)狀態(tài)一致的種子，處理液為喜馬拉雅紫茉莉根部的水浸提液，整株形態(tài)變化比較試驗中將濃度設置為：0.012 5 g/mL、0.025 g/mL、0.05 g/mL、0.l g/mL，以蒸餾水作為空白對照，每組設置3個平行重復，于處理后8 d進行拍照比較［21］。掃描電鏡以及透射電鏡比較實驗中，設定兩個濃度的處理液：0.025 g/mL、0.l g/mL，同樣以蒸餾水作為空白對照，以小麥和綠豆作為實驗材料，于處理后8 d取根尖，進行制樣和拍照比較。

1.2.3 掃描電鏡樣品的制備 取材：切取0.2-0.4 cm的植物樣品的根尖；前固定：把切好的根尖樣品置于洗凈的青霉素的小瓶中，加入3%的戊二醛溶液，4℃低溫下處理4 h；后固定：常溫下，倒掉磷酸緩沖液，加入1.5%的高錳酸鉀溶液固定2-3 h，吸出固定液，再用磷酸緩沖液沖洗3-4次，每次10-15 min；脫水：吸去緩沖液，依次加入梯度濃度的乙醇溶液，30%乙醇15 min，50%乙醇15 min，70%乙醇（可過夜），80%乙醇30 min，90%乙醇30 min，100%乙醇4次，每次30 min；置換乙醇：吸出小瓶中的乙醇溶液，將醋酸異戊酯加入，并完全沒過材料，過夜處理；樣品干燥：采用CO2臨界點進行干燥；粘貼樣品：在樣品臺上涂少量導電膠，然后用鑷子夾起樣品，輕輕放到樣品臺上，調整位置，使材料觀察面向上；樣品表面噴金：用離子濺射儀對粘貼好的樣品表面噴金。

1.2.4 掃描電鏡觀察：將做好的樣品置于日立S4800電鏡下掃描并照相［22］。

1.2.5 透射電鏡樣品的制備和觀察

1.2.5.1 樣品的制備 取材：把材料統(tǒng)一擺放整齊，切取0.5 cm左右的根尖進行處理；前固定：同1.2.3；后固定：同1.2.3；脫水：同1.2.3；過渡：乙醇逐級脫水后，倒掉乙醇，加入丙酮溶液2次，每次20 min；滲透：按照Epon-812包埋劑的配方，將4種成分準確量取并充分攪拌混勻，靜置片刻后按下列步驟加入瓶中，丙酮：包埋劑=2∶1，浸1 h；丙酮：包埋劑=1∶2，浸2 h；純包埋劑2 d；包埋：用解剖針挑取材料，小心加入PCR小管中，使材料垂直靜置，加入純包埋劑，每個小管放一個材料，標明樣品名稱；聚合：樣品包埋后，將其放入烘箱中，45℃下聚合6-7 h，60℃下聚合24 h。

1.2.5.2 超薄切片制作和透射電鏡觀察 包埋好的材料，經修塊后置于萊卡IJC-6型超薄切片機（德國萊卡公司）切片，厚度約為70 nm，之后銅網載片。醋酸鈾染液染色后在透射電鏡下觀察并拍照［23-24］。

2 結果

2.1 喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液對植物幼苗形態(tài)的影響

經不同濃度喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液處理8 d后，小麥、綠豆幼苗與對照相比，整株、根和葉片的形態(tài)均發(fā)生了明顯的變化（圖1）。隨著水浸提液濃度的升高，幼苗葉片生長遲緩，葉片偏小、柔軟且出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。對照幼苗根部生長狀態(tài)良好，根尖發(fā)育正常且顏色為白色或乳白色，側根較多，而經過處理的幼苗側根數明顯減少，根的生長受到明顯的抑制，根長短于對照組，且根的顏色變黃，出現(xiàn)褐化。

圖1 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對植物幼苗生長形態(tài)的影響

2.2 喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液對小麥、綠豆根尖細胞形態(tài)結構的影響

通過掃描電鏡的觀察可以發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液處理后的小麥和綠豆根尖組織結構發(fā)生了明顯的變化（圖2，圖3），用蒸餾水作對照培養(yǎng)的小麥和綠豆，根尖部位結構完整，根尖的4個區(qū)緊密有序排列，根冠頂部細胞生長良好，伸長區(qū)和成熟區(qū)細胞很規(guī)則的排列，形態(tài)飽滿，呈長圓形（圖2-A，圖3-A）。用0.025 g/mL濃度的水浸提液處理后，小麥和綠豆的根尖結構松動，伸長區(qū)和成熟區(qū)細胞部分脫落，細胞間出現(xiàn)空隙，尤其在綠豆中，根尖表皮細胞脫落現(xiàn)象嚴重（圖2-B，圖3-B）。當處理濃度達到0.1 g/mL時，植物的根尖部位嚴重變形，大量細胞開始脫落、破裂，細胞間出現(xiàn)較大的空隙，失去連續(xù)性，在小麥中，細胞皺縮嚴重，伸長區(qū)和成熟區(qū)細胞脫水萎蔫，組織中出現(xiàn)溝壑狀空腔（圖2-C，圖3-C）。

圖2 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對小麥根尖表面的影響

圖3 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對綠豆根尖表面的影響

根部的成熟區(qū)是由根尖頂端的分生細胞通過分裂分化而來，由外到內主要包括表皮、皮層和中柱。利用SEM電鏡對植物橫切面進行觀察，可以較好地顯示各部分的組織形態(tài)和特征。如圖4-A、圖5-A中所示，小麥和綠豆在正常生長狀態(tài)下，橫切面呈規(guī)則的圓形，各部分組織完整，表皮細胞、皮層細胞及中柱細胞排列緊密，細胞形態(tài)飽滿、規(guī)則，而經浸提液處理后，植物的根尖橫切結構破損，不再呈正常的圓形，組織間出現(xiàn)斷層，細胞內開始出現(xiàn)空洞（圖4-B，圖5-B），當水浸提液濃度升高到0.1 g/mL的時候，小麥和綠豆根尖受損更加嚴重，脫水干癟，失去組織結構和特征，橫切面出現(xiàn)較大的組織斷層和空腔，細胞空洞化，內含物消失（圖4-C，圖 5-C）。

圖4 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對小麥根尖橫切面的影響

圖5 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對綠豆根尖橫切面的影響

對縱切面、橫切面的細胞進行觀察發(fā)現(xiàn)，對照細胞形態(tài)結構規(guī)則，呈長圓形，彼此排列較緊密，細胞內胞質完整（圖6-A、圖7-A），經喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液處理過的小麥、綠豆根尖細胞，細胞形態(tài)出現(xiàn)扭曲，部分細胞的內含物滲出，細胞空泡化，細胞排列變得疏松，結構受到嚴重破壞（圖6-B、6-C，圖 7-B、7-C）。

2.3 喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液對根尖細胞超微結構的影響

與對照組相比，經喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液處理后的小麥、綠豆根尖細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，這些變化主要體現(xiàn)在細胞與細胞間的聯(lián)系、細胞膜系統(tǒng)與結構、細胞超微結構及各細胞器的結構等方面（圖8，圖9）。

圖6 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對小麥根尖縱切面的影響

圖7 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對綠豆根尖橫切面的影響

圖8 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對小麥根尖細胞結構的影響（Bar=2 μm）

正常生長的小麥、綠豆細胞間排列緊密（圖10-A、圖11-A），形狀呈規(guī)則的圓形或橢圓形，細胞結構完整，細胞核結構清晰，胞質均一，內含大量的細胞器：線粒體、內質網、高爾基體、質體等，它們含量豐富，顯示出良好結構與功能狀態(tài)，分工合作完成細胞復雜的生理代謝活動（圖12-A、13-A、14-A和15-A）；而經濃度為0.025 g/mL的浸提液處理后，小麥和綠豆根尖細胞膜皺縮，細胞失水，細胞之中出現(xiàn)了部分空泡，細胞質不再呈均一性（圖10-B、11-B），細胞器的數量和種類減少，線粒體數量降低且結構發(fā)生改變，有些細胞器解體消失（圖12-B、14-B和15-B）。綠豆的根尖細胞則開始出現(xiàn)質壁分離現(xiàn)象，細胞間的空隙增大，彼此失去了聯(lián)系（圖9-B），細胞核開始消融，胞內細胞器數量也急劇下降，有些結構遭到了一定程度的破壞，線粒體雙層膜內的脊的結構開始解體，高爾基體形態(tài)卷曲，喪失其順序性，各質體變得空泡化，結構和功能均受到損傷（圖13-B）；當浸提液濃度達到0.1 g/mL時，兩種植物細胞遭破壞程度更加嚴重，小麥根尖細胞普遍發(fā)生質壁分離，細胞形態(tài)不正常，胞內含有很大的液泡，細胞質被擠到一邊（圖8-C、10-C），核仁已經消失，胞內的細胞器只殘存其外部的膜，膜內結構幾乎消融，已無法分辨各細胞器形態(tài)。在小麥和綠豆根尖細胞中，細胞整體形態(tài)受損，除細胞核外，其他細胞器結構均已嚴重改變和破壞（圖11-C、12-C），線粒體和內質網與高爾基體幾乎全部消失，結構模糊不清（圖13-C、14-C和15-C）。

圖10 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對小麥根尖細胞的影響。（Bar=2 μm）

圖11 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對綠豆根尖細胞的影響（Bar=2 μm）

圖12 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對小麥根尖細胞器的影響（Bar=500 nm）

圖13 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對綠豆根尖細胞器的影響（Bar=1 μm）

圖14 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對小麥根尖細胞超微結構的影響（Bar=500 nm）

圖15 喜馬拉雅紫茉莉根的水提液對綠豆根尖細胞超微結構的影響（Bar=500 nm）

3 討論

近年來，植物化感作用［25］在農作物生產和實踐中的影響和作用越來越多的受到了人們的關注與重視，尤其是在藥用植物的培育和種植方面，學者們對化感作用的作用機理以及發(fā)揮作用的主要化感物質做了大量的探索和研究，并且得到了一定的結果，但在更深層次，更加微觀的分子和細胞學水平上的研究還比較少。本文在前期研究的基礎上［26-31］，觀察并分析了小麥、綠豆在經過喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液處理后，生理形態(tài)上受到的較強的化感抑制作用的影響情況。本研究發(fā)現(xiàn)隨著水浸提液濃度的升高，抑制效應會越發(fā)明顯。通過整株比較可以看出，水浸提液處理過的植物幼苗長勢減弱，植株的長勢要明顯的弱于對照組，且隨著處理濃度的增加，幼苗長勢越來越弱，說明化感抑制作用越明顯，具有濃度效應。這兩種植物受到化感作用后，其地上部分生長緩慢，葉片黃化，植株出現(xiàn)萎蔫等現(xiàn)象，而地下部分主要是根部的側根數明顯減少，根長變短，脫水并發(fā)生褐化，植物的生長發(fā)育受到了嚴重的抑制。植物的根從土壤中吸收大量的水分和礦物質營養(yǎng)，為地上部分提供生長所需的能量和物質，它的吸收作用主要依靠位于頂端的根尖來完成，根據形態(tài)和功能的差異，可將根尖分為四個區(qū)，分別是最前端的根冠、其后分生區(qū)、最末端的伸長區(qū)和成熟區(qū)。與地上部分相比，植物的地下部分更易受到化感作用的抑制，這是因為喜馬拉雅紫茉莉根部產生的化感物質主要分布和滲透在土壤中，而化感作用的部位也主要是植物的根部，且通過依靠植物根部的吸收和滲透作用使化感物質作用于鄰近植物。這與多數文獻所報道的結果相一致［21，25，32-33］。根作為植物生長發(fā)育必不可少的器官，起到吸收和運輸水分、礦物質的重要作用，也具有其他多種重要的生理功能［15，26］。以小麥和綠豆兩種典型作物為研究材料，我們發(fā)現(xiàn)處理后的植物形態(tài)受損，葉片萎蔫黃化，根部蜷縮褐化，根細胞的生理功能遭到破壞，進而抑制根的發(fā)育，進一步影響植物整株的生命活動［34-35］。利用透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，對照組根尖的4部分結構相對較為完整，細胞排列緊密，結構規(guī)則，而經浸提液處理后的根部橫切面細胞排列混亂，出現(xiàn)了斷裂面和大量空隙，根尖的根冠細胞、表皮細胞明顯脫落，使根系不能正常吸收水分和營養(yǎng)物質，生長發(fā)育受到嚴重干擾和抑制，這表明喜馬拉雅紫茉莉在發(fā)揮化感抑制作用時，會破壞和損傷植物的根系細胞，導致細胞死亡，抑制其生命活動。喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液處理后，小麥和綠豆的根尖細胞、細胞內各細胞器的數量及形態(tài)都較對照發(fā)生了明顯的改變，處理后的細胞間隙增大，細胞與細胞間的聯(lián)系減少，細胞中出現(xiàn)質壁分離現(xiàn)象，細胞核漸漸解體，胞質中的細胞器數量減少，形態(tài)變得不規(guī)則，線粒體變得空泡化，內部的脊消失，數量也急劇下降，高爾基體形態(tài)扭曲，不再具備正反面的結構特征，并隨著浸提液濃度的升高而解體、消融。這些主要細胞器是細胞正常生長必不可少的，它們形態(tài)和功能的改變或是損傷都會影響到整個細胞的功能。細胞超微形態(tài)與結構的變化導致受體根尖細胞生理代謝功能紊亂，生長發(fā)育受到嚴重抑制，這說明喜馬拉雅紫茉莉主要是通過破壞植物根系細胞結構、干擾其生理功能的方式來發(fā)揮化感抑制作用［36-37］。入侵植物紫莖澤蘭化感物質對旱稻根也能產生與本研究類似的形態(tài)及細胞結構的負面影響，表明不同植物化感作用在作用機理上可能存在一定的共性。本研究為解釋化感作用在細胞水平上的作用機理研究提供新的實驗證據，為藥用植物種植及農業(yè)生產也有一定的指導作用。

4 結論

本實驗利用掃描電鏡和透射電鏡技術，對小麥和綠豆兩種農作物的根部形態(tài)和細胞結構在喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液處理后的化感作用響應做了初步的探索和研究。通過與對照組相比，發(fā)現(xiàn)處理后的受體植物，無論是在植物形態(tài)上還是在細胞學水平上都受到了不同程度的破壞和損傷，且不同濃度的喜馬拉雅紫茉莉根的水浸提液對綠豆和小麥均存在不同程度的化感作用，具有濃度效應。

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Allelopathy Effects of Aquatic Extracts from Mirabilis himalaica Roots on Morphology and Cell Structure of Wheat and Mung Bean Root

LIU Sheng-li1MA Shi-yao1WU Xiao-fei1SHI Jun-na1ZHOU Xiao-yang1LAN Xiao-zhong2LU Cun-fu1
（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. Agricultural and Animal Husbandry College，Tibet University，Linzhi 860000）

To figure out the allelopathy effects of aquatic extracts from Mirabilis himalaica roots，we used wheat and mung bean as target plants for this study. Results showed that the cell and tissue morphologies of the two target plants were in significantly allelopathy and inhibitory effects after the treatment by the aquatic extracts from M. himalaica roots for 8 d. We observed and analyzed the root morphology and cell structure of the two crops treated with the aquatic extracts using transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. The root tip structure in wheat and mung bean were incomplete，part of the epidermis cell felled off，the space between the cells turned larger，interstitial faulting and cavity appeared，and tightly structure between cells were disrupted. In the cell of wheat and mung bean root，membrane shrank，plasmolysis appeared，vacuoles in the cytoplasm turned bigger，nucleus ablated，and the structure of main organelles such as endoplasmic reticulum，mitochondria and Golgi apparatus varied or collapsed and depleted in numbers；i.e.，plant life severely restrained. These results imply that the aquatic extracts from M. himalaica roots presented the strong allelopathic inhibition on two common crops.

Mirabilis himalaica；allelopathy effect；plant morphology；cell structure

2017-05-15

國家科技支撐項目（2011BAI13B06）

劉勝利，男，博士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：liushengli_smile@163.com

盧存福，男，教授，研究方向：細胞生物學，分子生物學；E-mail：lucunfu@bjfu.edu.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0389

（責任編輯 朱琳峰）