轉(zhuǎn)Bt棉主莖葉Cry1Ab/c蛋白含量的時空分布分析

肖海兵 王鵬軍 李先鋒 董紅強 楊明祿

（1. 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；2. 農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測站，阿拉爾 843300；3. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第一師阿拉爾農(nóng)場，阿拉爾 843300）

轉(zhuǎn)Bt棉主莖葉Cry1Ab/c蛋白含量的時空分布分析

肖海兵1，2王鵬軍1李先鋒3董紅強1，2楊明祿1，2

（1. 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；2. 農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測站，阿拉爾 843300；3. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第一師阿拉爾農(nóng)場，阿拉爾 843300）

為明確M-49和X-37轉(zhuǎn)基因棉Cry1Ab/c蛋白在主莖葉片的時空分布，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）對主莖葉片的Cry1Ab/c蛋白含量進行檢測，并利用考馬斯亮藍法檢測葉片水溶性總蛋白含量。結(jié)果表明：X-37主莖葉片Cry1Ab/c蛋白整體含量高于M-49；兩種轉(zhuǎn)Bt棉主莖葉的Cry1Ab/c蛋白含量由頂端向底層逐漸增加，現(xiàn)蕾期（6月3日）和初花期（6月27日）底層葉片Cry1Ab/c蛋白含量顯著高于頂端葉片；花鈴期（8月6日）和鈴期（8月26日）中上部葉片Cry1Ab/c蛋白含量均無明顯差異。另外，在初花期（6月27日）主莖上部葉片的Cry1Ab/c蛋白與水溶性總蛋白比顯著高于中下部葉片?？傮w上，兩種轉(zhuǎn)Bt棉主莖葉片Cry1Ab/c蛋白葉片含量分布由下至上逐漸減少，隨生育期的推進呈先增后降，在初花期的上部葉片Cry1Ab/c蛋白與水溶總性蛋白比變化較其他生育期明顯。

轉(zhuǎn)Bt棉；Cry1Ab/c蛋白；酶聯(lián)免疫；時空分布；水溶性總蛋白

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在我國種植已有20多年歷史［1］，轉(zhuǎn)Bt棉可降低棉田蟲害程度，減輕農(nóng)藥污染，已成為我國棉花主栽類型［2-3］。然而，隨抗蟲棉種植時間推移，其對棉鈴蟲的防治效果有下降趨勢，棉鈴蟲室內(nèi)生測也發(fā)現(xiàn)2代發(fā)生期的轉(zhuǎn)Bt棉葉致死率高于3、4代發(fā)生期［4］，這種轉(zhuǎn)Bt棉抗蟲性波動與棉花生育期Bt毒蛋白表達呈前期強、中后期弱有關(guān)［7］，在空間分布上葉片殺蟲蛋白含量高于生殖器官［5-6］。另外，外部環(huán)境對Bt蛋白表達也有較大影響，極端低溫與濕度互作使Bt棉開花后的抗蟲性有明顯下降［8］，38℃以上，棉蕾的 Bt蛋白表達量均顯著下降［9］。施氮肥能明顯促進棉葉Bt蛋白的表達，其Bt蛋白表達量與可溶性蛋白、游離氨基酸及全氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系［10］。轉(zhuǎn)Bt棉開花后用赤霉酸或縮節(jié)胺處理可促進Bt蛋白表達［11］。利用表油菜素內(nèi)酯、甲哌嗡和水楊酸混合處理能提高轉(zhuǎn)Bt棉在盛蕾期上部葉片、花鈴期下部葉片及果枝葉的毒蛋白含量［12］。因而Bt蛋白表達含量波動較大，既與植株內(nèi)在因素有關(guān)，又受外部環(huán)境等因素影響。本文以當(dāng)?shù)剌^為常見的種植品種為研究對象，通過檢測主莖不同葉序棉葉Cry1Ab/c蛋白和總水溶性蛋白含量，分析Cry1Ab/c蛋白含量的時空變化規(guī)律，為棉花生產(chǎn)中構(gòu)建棉鈴蟲防控體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 抗蟲棉X-37和M-49，采自阿拉爾墾區(qū)棉田。隨機選擇5株生長一致、葉片大小相近棉花，采集主莖由下往上的第2、4、6、8、10、12、14葉片，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２蓸訒r期分別為現(xiàn)蕾期（6月3日）、初花期（6月27日）、花鈴期（8月6日）和鈴期（8月26日）。

1.1.2 儀器 電子分析天平（AL204，梅特勒-托利多儀器有限公司）、高通量組織研磨器（SCIENTZ-48，寧波新芝生物科技股份有限公司）、酶標儀（Multiskan FC，Thermo）、 紫 外 可 見 分 光 光 度 計（E220，Thermo）、冷凍離心機（X1R，Thermo）、Cry1Ab/c試劑盒（AP003，EnviroLogix公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品液的提取 用打孔器取轉(zhuǎn)Bt棉葉片直徑1 cm，并萬分之一天平稱重后放入2 mL離心管中，加入PH7.4磷酸-吐溫（PBS-T）提取液1.2 mL，置于高通量組織研磨器65 HZ研磨勻漿，在4℃，5 000 r/min離心15 min，取上清液為待測樣品液。

1.2.2 水溶性總蛋白質(zhì)含量測定 參考考馬斯亮藍（G-250）染色法［13］：取待測樣品液 0.1 mL，稀釋 10 倍，分別加入2.5 mL考馬斯亮藍（G-250）、混勻，放置5 min后，于波長595 nm處比色，測定吸光度，并通過標準曲線查的蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 Cry1Ab/c蛋白含量的測定 采用EnviroLogix公司Cry1Ab/c的抗體夾心ELISA定量檢測試劑盒（AP003）進行Bt蛋白含量測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 以Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理及作圖，利用SPSS17.0進行多重比較（Duncan氏新復(fù)極差檢測）相關(guān)統(tǒng)計分析。

Cry1Ab/c蛋白含量（ng/g）=Cry1Ab/c蛋白含量（ng）/樣品葉片鮮重（g）；

Cry1Ab/c蛋白比=Cry1Ab/c蛋白含量（ng/g）/水溶性總蛋白含量（μg/g）

2 結(jié)果

2.1 兩種轉(zhuǎn)Bt棉Cry1Ab/c蛋白葉片含量的時空分布

M-49轉(zhuǎn)Bt棉主莖葉片的Cry1Ab/c蛋白含量由頂端葉片向底層葉片逐漸增加趨勢（圖1），其中現(xiàn)蕾期（6月3日）第2、4葉Cry1Ab/c蛋白含量顯著（P＜0.05）高于第6、8葉；第2、4葉和6葉極顯著（P＜0.01）高于第8葉。在初花期（6月27日）第2葉Cry1Ab/c蛋白明顯高于其他葉片，達極顯著水平（P＜0.01）；除第12葉外，其他葉片Cry1Ab/c蛋白含量無明顯差異?；ㄢ徠冢?月6日）和鈴期（8月26日）中上部葉片第8、10、12和14葉Cry1Ab/c蛋白均無明顯差異。

X-37轉(zhuǎn)Bt棉主莖葉的Cry1Ab/c蛋白含量由上至下也呈逐漸增加趨勢（圖2）。但不同在于現(xiàn)蕾期（6月3日）第2葉Cry1Ab/c蛋白含量顯著（P＜0.05）高于第4、6和8葉，其中第6、8葉達極顯著水平（P＜0.01）。在初花期（6月27日）第2、4葉的Cry1Ab/c蛋白含量極顯著（P＜0.01）高于其他葉片；第6葉Cry1Ab/c蛋白含量也極顯著（P＜0.01）高于第8、10、12和14葉。花鈴期（8月6日）第14葉Cry1Ab/c蛋白顯著（P＜0.05）低于第8、10和12葉。鈴期（8月26日）中上部葉片第10、12和14葉Cry1Ab/c蛋白均無明顯差異。Cry1Ab/c蛋白含量分布均由下至上逐漸減少，隨生育期的推進呈先增后降，現(xiàn)蕾期的Cry1Ab/c蛋白含量較高，初花期、花期、花鈴期逐漸降低。整體上，X-37主莖葉Cry1Ab/c蛋白含量較高于M-49。

圖1 M-49轉(zhuǎn)Bt棉Cry1Ab/c蛋白葉片含量的時空分布

圖2 X-37轉(zhuǎn)Bt棉Cry1Ab/c蛋白葉片含量的時空分布

2.2 兩種轉(zhuǎn)Bt棉Cry1Ab/c蛋白的總蛋白比分析

M-49和X-37兩種抗蟲棉主莖底層葉片第2、4和6葉Cry1Ab/c蛋白與總蛋白比均無顯著差異，花鈴期（8月6日）和鈴期（8月26日）的第10、12葉Cry1Ab/c蛋白比呈穩(wěn)定減少趨勢（表1）。但在初花期（6月27日）第10、12和14葉的Cry1Ab/c蛋白比顯著（P＜0.05）高于花鈴期和鈴期。

3 討論

因此，這兩種轉(zhuǎn)Bt棉主莖不同葉序棉葉轉(zhuǎn)Bt基因棉M-49和X-37在時空分布上存在明顯差異，主莖葉片Cry1Ab/c蛋白含量由下至上逐漸減少，這與 Rochester［14］、余恩等［15］報道一致，如浙大13-1轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉的主莖下部葉Bt蛋白含量顯著高于上部葉，但不同于轉(zhuǎn)Bt新棉33B和GK3上部棉葉Bt蛋白含量顯著高于老葉［16］，以及浙大13-2和其親本的兩部位葉片Bt蛋白含量差異并不明顯［15］。這可能與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種有關(guān)系。另外，轉(zhuǎn)Bt棉M-49和X-37生育前期的葉片Cry1Ab/c蛋白含量明顯高于生育中后期，這與邢朝柱等［16］和王冬梅等［17］研究結(jié)果相近。這種時空分布將會導(dǎo)致新疆南疆棉區(qū)的棉鈴蟲能較好的防治2代棉鈴蟲，但3、4代棉鈴蟲防治效果會整體呈現(xiàn)下降趨勢［18］。因此，為了避免加速棉鈴蟲對轉(zhuǎn)Bt棉產(chǎn)生抗性，有必要篩選抗蟲表現(xiàn)更好的棉花品種，結(jié)合常規(guī)棉花布局建立庇護所［19］，更有利于棉鈴蟲的治理。

轉(zhuǎn)基因棉M-49和X-37主莖上部葉片在生育期后期Cry1Ab/c蛋白含量明顯下降。這可能與棉株的外部環(huán)境和內(nèi)在因素的影響較大有關(guān)，極端溫度、氮肥、鹽堿等不良外界因素對Bt殺蟲蛋白表達存在影響［8，10，14，20］，在前期棉株體內(nèi)代謝旺盛，Cry1Ab/c蛋白積累較多，而后期棉花由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)為生殖生長，Cry1Ab/c基因表達受到一定影響［17］。研究表明GPT、GOT等活性與Cry1Ab/c蛋白含量存在極顯著的正相關(guān)［21］?？傮w上，組織中Bt殺蟲蛋白與總可溶性蛋白含量呈正相關(guān)［9，21］，但不同時期和部位葉片表現(xiàn)有一定差異，而主莖中上部葉片第8、10、12和14葉在初花期的殺蟲蛋白比值變化顯著較大。此外，棉花生長后期的Bt蛋白含量下降的內(nèi)因可能由于棉花生長前期Bt基因過量表達，而使后期基因沉默或啟動子甲基化［22］；或因某種降解蛋白酶降解，單寧的結(jié)合使其失活［23］。因此，還需進一步明確Bt殺蟲蛋白的下降主因，分析初花期后的Cry1Ab/c蛋白比變化內(nèi)在因素，為更好地指導(dǎo)轉(zhuǎn)Bt基因棉的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

表1 兩種不同轉(zhuǎn)Bt棉Cry1Ab/c蛋白的總蛋白比分析（ng/μg-1）

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因棉M-49和X-37品種主莖葉片Cry1Ab/c蛋白含量存在時空差異，時間上隨棉花生育期的推進呈先增后降，同時期由下部至上部葉片逐漸減少，但葉片中的水溶性總蛋白比值有上升趨勢。

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Tempo-spatial Distribution of Cry1Ab/c Protein in the Main Stem Leaves of Transgenic Bt Cotton

XIAO Hai-bing1，2WANG Peng-jun1LI Xian-feng3DONG Hong-qiang1，2YANG Ming-lu1，2
（1. College of Plant Science，Tarim University，Alar 843300；2. Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar，Ministry of Agriculture，Alar 843300 ；3. Alar Farm of the First Planners in Xinjiang Production and Construction Corps，Alar 843300）

The objective of this study is to reveal the tempo-spatial distribution of Cry1Ab/c protein in main stem leaves of transgenic cotton variety M-49 and X-37. The Cry1Ab/c protein content and the water-soluble protein in the main stem leaves from transgenic Bt cotton were detected by enzyme linked immunoassay（ELISA）and Coomassie brilliant blue method，respectively. The results showed that the content of Cry1Ab/c protein in the main stem leaves of the cotton variety X-37 were greatly higher than that in M-49. The contents of Cry1Ab/c protein in both varieties increased gradually from the top leaves to the bottom leaves. The Cry1Ab/c protein content of the bottom leaves were greatly higher than that of the top leaves at squaring period（3 June 2016）and initial flowering stage（27 June 2016）（P ＜ 0.05），but there were no significant differences on the content of Cry1Ab/c protein between the upper and middle parts of the main stems at blossoming and boll forming stage（6 August 2016）and boll period（26 August 26 2016）. Besides，the proportion of the Cry1Ab/c protein content to the watersoluble protein content in the upper leaves were greatly higher than that in the middle and lower leaves in main stem of transgenic Bt cotton（27 June 2016）. In summary，the content of Cry1Ab/c protein in the main stem leaves of both varieties decreased gradually from the bottom leaves to the top leaves，and the trend of the content of Cry1Ab/c protein lowered after increased with its growth period going on，and the ratio of the Cry1Ab/c protein to the water-soluble protein content from the upper leaves changed more significantly at initial flowering stage than other developmental stages.

transgenic Bt cotton；Cry1Ab/c protein；ELISA；temporal and spatial distribution；water-soluble protein

2017-06-05

科技支疆計劃項目（2014AB009），塔里木大學(xué)校長基金青年項目（TDZKQN201601）

肖海兵，男，碩士，講師，研究方向：轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險評估；E-mail：xiaohaibing11@126.com

楊明祿，男，碩士，副教授，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治；E-mail：ymlzkytd@163.com

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0462

（責(zé)任編輯 朱琳峰）