一種快速檢測含tst基因的金黃色葡萄球菌的納米生物傳感器

李明陽 賀氣志 馬春霞 俞建昆

（1. 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所 中心實驗室，昆明 650118；2. 長沙醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院 應用生物學教研室，長沙 410219）

一種快速檢測含tst基因的金黃色葡萄球菌的納米生物傳感器

李明陽1賀氣志2馬春霞1俞建昆1

（1. 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所 中心實驗室，昆明 650118；2. 長沙醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院 應用生物學教研室，長沙 410219）

基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence energy resonance transfer，F(xiàn)RET）原理利用單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）構建一種操作簡單、成本低、靈敏度高和選擇性強的納米生物傳感器快速檢測含有tst基因金黃色葡萄球菌。將tst基因互補序列設計為探針，利用單壁碳納米管聯(lián)合羧基熒光素（FAM）標記的DNA分子探針（FAM-P）構建出FAM-P/SWCNTs復合檢測體系?？疾煸擉w系對靶標序列和靶標菌的靈敏度和特異性。結果表明，該生物傳感器對靶標序列的檢測下限低至10 nmol/L，并在10-100 nmol/L 范圍內(nèi)具有較好的線性關系（R2= 0.994），對靶標菌的檢測下限低至102，且在102-107CFU/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關系（R2= 0.999）。此外，在錯配實驗和對非靶標菌檢測時，該傳感器呈現(xiàn)了較高的特異性。本研究構建的FAM-P/SWCNTs體系能快速檢測含tst基因金黃色葡萄球菌，并具有操作簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，為食品檢測、臨床診斷等領域開辟了新途徑。

單壁碳納米管；熒光標記的核酸探針；tst 基因；金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分布極廣，主要存在于各類熟肉制品、乳及乳制品、蛋及蛋制品［1］，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染的致病菌［2］。金黃色葡萄球菌合成分泌的毒素和侵襲性酶類可引起食物中毒，如腸毒素、溶血毒素、毒性休克綜合征毒素（Toxic shock syndrom toxin-1，TSST-1）和脫氧核糖核酸酶等［3］。其中S.aureus 分泌的TSST-1能夠引起毒性休克綜合征（Toxic shock syndrome，TSS），并且可能使患者并發(fā)心內(nèi)膜炎與肌肉轉(zhuǎn)移性膿腫等疾?。?-5］。從患者體內(nèi)分離出的金黃色葡萄球菌中，高達70%的菌株都攜帶毒性休克綜合征毒素基因（tst）。TSST-1作為金黃色葡萄球菌重要的標志性污染物之一，對其基因tst進行檢測不僅可以用于微生物實驗室致病菌株的篩選，也可用來研究金黃色葡萄球菌對機體的感染致病機制。

目前，可通過免疫學［6］、聚合酶鏈反應［7］、及反向被動乳膠凝集［8］等方法檢測含tst基因金黃色葡萄球菌，但是這些方法存在操作繁瑣、設備昂貴、靈敏度不高，特異性不強等缺點［9-12］。因此，建立一種更為穩(wěn)定、操作簡單、成本低廉、靈敏度和特異性高的方法來實現(xiàn)對產(chǎn)TSST-1金黃色葡萄球菌的快速檢測顯得尤為重要。隨著材料科學的快速發(fā)展，納米材料被廣泛應用于各個領域［13］，其中碳納米管具有生物低毒性，生物分子親和性等特點，在化學、材料學、生命科學及生物醫(yī)藥等領域都具有廣泛的應用前景［14-15］。本研究利用單壁碳納米管（Single -walled carbon nanotubes，SWCNTs）聯(lián)合熒光標記探針（FAM-P）作為復合檢測體系對含有tst基因的金黃色葡萄球菌進行檢測，以驗證該體系的靈敏度和特異性。

1 材料與方法

1.1 材料

稱取0.1g SWCNTs溶于100 mL 超純水，低溫條件下超聲波震蕩3 h使其均勻分散，制備成1 mg/mL SWCNTs儲備液，室溫保存。

菌種為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌K88（E.coli K88）、腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）、志賀氏菌（S.castellani）均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所中心實驗室提供。

LS55型熒光分光光度計（購自RerkinElmer公司）、PL203 型電子天平（購自于METTLER TOLEDO公司）、單壁碳納米管（購自于南京先鋒材料科技有限公司）。PBS 溶液（購自于SIGMA公司，pH7.4）高壓滅菌后4℃ 保存?zhèn)溆?。熒光探針、靶標序列，靶標?個和12個堿基錯配序列［16］（表1）均由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 實驗所需DNA序列

1.2 方法

1.2.1 FAM-P/SWCNTs反應體系優(yōu)化 由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移受熒光供體和受體的比例影響很大，因此探討體系中FAM-P /SWCNs的最佳比例［8］：設定體系中 FAM-P 終濃度恒定為50 nmol/L，設置SWCNT終濃度分別0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和1.0 mg/mL。設置激發(fā)波長為 480 nmol/L，發(fā)射波長 516 nmol/L，測定復合溶液熒光值（F）和原始熒光值（F0）。

1.2.2 靶標和錯配DNA序列的檢測試驗 激發(fā)波長設置為 480 nmol/L，發(fā)射波長設置為 516 nmol/L；反應體系中 FAM-P 終濃度恒定為50 nmol/Lol / L，加入最適宜濃度的SWCNT，制備成FAM-P/SWCNTs復合工作液；設置體系反應中靶標序列DNA濃度梯度 10、20、30、40、50、60、80和 100 nmol/L，另外兩種錯配DNA序列只測定100 nmol/L的濃度，并設置空白對照以此來驗證實驗體系的特異性程度，37℃恒溫孵育45 min。測定復合溶液熒光值（F）和原始熒光值（F0）。

1.2.3 S.aureus基因組中靶標序列的檢測試驗 使用涂布平板法在普通培養(yǎng)基上，37℃需氧條件下培養(yǎng)S.aureus 24 h后，制備成不同濃度的菌液：102、103、104、105、106和 107CFU/mL。95℃水浴 15 min 后置于冰上10 min得到菌體的單鏈DNA（ssDNA），將獲得的ssDNA加入最優(yōu)FAM-P /SWCNTs復合液中，孵育45 min后測定熒光值（F）。

1.2.4 FAM-P/SWCNTs 定量測定反應體系準確度驗證 取102、104和106三種濃度的S.aureus樣品，按上述方法獲得ssDNA 并測定熒光值（F）后，對照樣品標準曲線，以驗證該反應體系定量測定的準確度。

1.2.5 菌種特異性檢測 為進一步證明 FAM-P /SWCNTs復合檢測體系的特異性，故而選取大腸桿菌K88、腸炎沙門氏菌、志賀氏菌3種菌進行檢測。以上3種菌分別制備成濃度為5×106CFU/mL的菌液，相同方法獲得ssDNA進行檢測。

2 結果

2.1 FAM-P/SWCNTs復合反應體系原理

本體系以SWCNTs為平臺，聯(lián)合熒光標記的S.aureus 毒力島基因tst的互補鏈作為探針，基于SWCNT與DNA分子非共價偶聯(lián)后可淬滅熒光的特性，構建 FAM-P /SWCNTs復合檢測體系（圖1）。當體系中不存在靶標序DNA時，F(xiàn)AM-P結合在SWCNT表面，此時探針上的FAM熒光基團被淬滅。在靶標DNA存在的情況下，F(xiàn)AM-P與靶序列互補配對形成雙鏈從SWCNT表面解離下來而恢復熒光。檢測體系中的靶標序列的含量與熒光強度呈正相關，因此可以通過檢測體系中的熒光值實現(xiàn)對攜帶tst基因金黃色葡萄球菌的定量檢測。

圖1 FAM-P/SWCNTs復合反應體系原理

2.2 FAM-P/SWCNTs反應體系優(yōu)化

FAM-P/SWCNTs之間的比例是檢測體系的一個非常關鍵的因素，本實驗通過8個不同比例的考察結果得到圖2。SWCNT濃度與熒光值的增加量呈負相關，當SWCNT濃度達到0.06 mg/mL 以上時熒光相對值F/ F0-1并無明顯變化并趨近與1.0。

圖2 FAM-P/SWCNTs比例優(yōu)化

2.3 靶標和錯配DNA序列的檢測試驗

8個不同濃度的靶標序列測定結果顯示：體系中的熒光值隨著靶標序列濃度的增大而顯著增大，以靶標DNA濃度為X軸，熒光值為Y軸，通過Origin8.0 軟件繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y = 2.414x + 11.90，R2= 0.994說明靶標基因濃度在0.05-1.0 nmol/L范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關系，顯示出該體系的高靈敏度，見圖3。

在錯配試驗中，將未加入任何測定序列的試驗作為空白對照，將同種濃度的靶標序列與2種錯配序列分別用相同體積的FAM-P/SWCNTs復合檢測體系中測定熒光值。結果（圖4）顯示加入靶標序列后熒光值顯著增加，而2種錯配堿基序列的實驗經(jīng)過測定顯示的熒光值與空白組并無差異，說明FAMP/SWCNTs復合檢測體系的特異性很強。

2.4 S.aureus基因組中靶標序列的檢測試驗

金黃色葡萄球菌基因組DNA在單鏈狀態(tài)下，tst基因可與探針特異性結合并使探針脫離SWCNTs，從而恢復熒光。結果（圖5）顯示，隨著菌體濃度的上升熒光值顯著增大，在該濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系（R2= 0.999）。

2.5 FAM-P/SWCNTs定量測定準確度驗證

為驗證該反應體系對于定量測定的準確度，故選取102、104和106三個濃度的S.aureus樣品進行試驗。結果（圖6）顯示，102、104和106三種濃度的S.aureus樣品熒光值測定后，對照上述標準曲線，能夠得到相應濃度，說明FAM-P/SWCNTs復合檢測體系對于含tst基因的S.aureus樣品定量測定具有較高的準確度。

圖3 FAM-P/SWCNTs復合檢測體系對不同濃度靶標序列的檢測

圖4 錯配試驗結果

2.6 菌種特異性檢測

選取大腸桿菌K88、腸炎沙門氏菌、志賀氏菌3種菌檢測該反應體系的特異性，結果（圖7）顯示加入靶標菌的熒光值顯著高于其它菌的熒光值，說明FAM-P/SWCNTs復合檢測體系有很強的特異性。

3 討論

圖5 含tst基因序列的S.aureus檢測結果

圖6 FAM-P/SWCNTs定量復合檢測體系準確度檢測

圖7 FAM-P/SWCNTs復合檢測體系的特異性檢測

金黃色葡萄球菌是一種分布性極廣的食源性微生物污染源，存在于空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中，可以分泌多種致病的毒素和酶［17］。因為其廣泛的分布性，食品極易受到污染，導致腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)，人類及其它動物感染金黃色葡萄球菌可導致壞死性肺炎、乳房炎、食物中毒及毒性休克綜合征等。美國CDC報告指出，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。在美國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，中國金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時有發(fā)生。

在經(jīng)濟快速發(fā)展的今天，人類更加重視食品安全，大力推動對致病菌，如金黃色葡萄球菌檢測方法的研究步伐。目前已有多種技術手段可對金黃色葡萄球菌進行快速檢測。利用快速測試片法可依據(jù)微生物在測試片上的生長和顯色程度來判斷樣品中微生物的存在情況，這種方法操作步驟較為簡單，但在定量分析方面效果有所欠缺［18］；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前對金黃色葡萄球菌進行快速檢測應用最為廣泛的方法之一，將酶與特定的抗體耦聯(lián)，抗體與樣品中的靶標抗原發(fā)生特異性結合反應后通過顯色反應，利用酶標儀對目標微生物進行定性或定量分析，ELISA檢測方法靈敏度高，特異性強，但耗費的成本也較高［19］；此外，快速發(fā)展的基因芯片技術也被用于微生物檢測領域，通過檢測雜交信號強弱可達到對目標微生物的定性和定量檢測，但成本過高［20］。

隨著現(xiàn)代生物技術的不斷創(chuàng)新，不同學科之間相互借鑒，共同發(fā)展，將會產(chǎn)生更多的微生物快速檢測技術手段［21-22］。本實驗利用單壁碳納米管聯(lián)合熒光素標記探針構建出操作簡便、成本低廉、靈敏度和特異性高的納米生物傳感器。根據(jù)熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理，熒光標記的探針與SWCNT非共價結合后兩種分子間距離＜10 nmol/L，此時即會發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移效應使得熒光淬滅。當在靶標序列存在下，靶標序列通過競爭結合與探針序列堿基互補配對形成雙鏈，探針可從SWCNT表面解離下來，F(xiàn)AM基團恢復熒光。隨著靶標序列濃度升高，熒光值逐漸增強，可以通過檢測該復合體系的熒光值對含tst基因的金黃色葡萄球菌實現(xiàn)定量檢測。該體系對靶標序列濃度僅為0.05 μmol/L時仍能準確的檢測出，說明其靈敏度較高；在錯配試驗和對不同菌液樣品的檢測結果也說明該體系的特異性較強。

4 結論

本實驗利用單壁碳納米管聯(lián)合熒光標記探針構建出復合檢測體系對含tst基因的金黃色葡萄球菌進行檢測，結果顯示該復合檢測體系靈敏度高，在靶標序列濃度0.05-1.0 nmol/L和目標菌液濃度102-107CFU/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關系（R2= 0.994；R2= 0.999）；在錯配試驗和對不同菌液樣品的檢測結果也說明了該體系的特異性很強。

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A Nano Biosensor for Rapid Detecting Staphylococcus aureus Containing tst Gene

LI Ming-yang1HE Qi-zhi2MA Chun-xia1YU Jian-kun1
（1. Central Laboratory，Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science ＆ Peking Union Medical College，Kunming 650118；2.Department of Applied Biology，School of Basic Medical Science，Changsha Medical University，Changsha 410219）

This work is to construct a nano biosensor of simple operation，low cost，high sensitivity and specificity to rapid detect Staphylococcus aureus containing tst gene with single-walled carbon nanotubes（SWCNTs）based on the principle of fluorescence energy resonance transfer（FRET）. SWCNTs combined with carboxyfluorescein（FAM）-labeled DNA molecule probes（FAM-P）were used to construct FAM-P/SWCNTs composite detection system，and the probe was complementary molecular sequence of tst gene. The sensitivity and specificity of the system to the target sequence and the target strain were investigated. As results，the lower detection limit of target sequence was 10 nmol/L and presented a fine linear relationship（R2was 0.994）in the range of 10-100 nmol/L. The detection limit of the target strain was as low as 102and in the range of 102-107CFU/mL（R2was 0.999）. In addition，the sensor exhibited a high specificity in mismatch experiments and for non-target bacteria detection. In conclusion，the composite detection system by FAM-P/SWCNTs has the advantages of rapid detection，simple operation，high sensitivity and strong specificity，which opens up a new approach for food detection and clinical diagnosis.

single-walled carbon nanotubes；carboxyfluorescein-labeled nucleic acid probes；tst gene；Staphylococcus aureus

2017-04-12

高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（20111106120056）

李明陽，男，碩士研究生，研究方向：RNA甲基化；E-mail：403124921@qq.com；賀氣志，女，碩士研究生，研究方向：生物傳感器技術及致病菌的耐藥干預；E-mail：314190831@qq.com，賀氣志為共同第一作者

俞建昆，男，博士，研究方向：癌癥相關pre-mRNA選擇性剪接變化與調(diào)節(jié)機制；E-mail：yjk@imbcams.com.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0291

（責任編輯 朱琳峰）