高通量基因型分型技術(shù)及其在水稻中的應(yīng)用

張先文 賀治洲 江南 鄧華鳳 李繼明

（1. 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南雜交水稻研究中心 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長(zhǎng)沙 410125；2. 華智水稻生物技術(shù)有限公司，長(zhǎng)沙 410125；3.湖南農(nóng) 業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

高通量基因型分型技術(shù)及其在水稻中的應(yīng)用

張先文1，2，3賀治洲2江南2鄧華鳳1李繼明2

（1. 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南雜交水稻研究中心 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長(zhǎng)沙 410125；2. 華智水稻生物技術(shù)有限公司，長(zhǎng)沙 410125；3.湖南農(nóng) 業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

作物種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的深入認(rèn)識(shí)與高效利用，對(duì)于品種改良和糧食安全具有重要意義。傳統(tǒng)系譜考察的方法對(duì)指導(dǎo)育種實(shí)踐發(fā)揮了重要作用，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因組學(xué)和高通量SNP分子標(biāo)記等基因型分型方法可以更便捷地對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定。就基因型分型的主要方法進(jìn)行了總結(jié)，重點(diǎn)論述了以SNP為核心的下一代高通量測(cè)序（NGS）分型方法、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）和SNP芯片系統(tǒng)，以及當(dāng)前主流的SNP分析工具和數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)，介紹了高通量SNP分型技術(shù)在水稻研究中的進(jìn)展，并就分型技術(shù)在作物育種等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

系譜；SNP；分型；下一代高通量測(cè)序；競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR

對(duì)野生動(dòng)植物的馴化和利用極大地推動(dòng)了人類社會(huì)文明的進(jìn)步，對(duì)植物種質(zhì)資源遺傳背景和多樣性的認(rèn)識(shí)與利用加速了植物育種技術(shù)的革命，從而為人類提供更多更優(yōu)質(zhì)的糧食和其他植物類產(chǎn)品。隨著人口的增加、環(huán)境的惡化以及社會(huì)的發(fā)展，未來(lái)的糧食需求對(duì)包括水稻、麥類和玉米等主要糧食作物的育種提出了更高的要求，不僅要求穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)，還要優(yōu)質(zhì)。在這種背景下，對(duì)優(yōu)良種質(zhì)資源的挖掘、培育和高效利用就成為現(xiàn)代育種的重要目標(biāo)。因此，了解種質(zhì)資源的進(jìn)化、遺傳背景和親緣關(guān)系就成為雜種優(yōu)勢(shì)利用和品種改良的重要基礎(chǔ)［1，2］。

早期育種過程中對(duì)親本遺傳背景和親緣關(guān)系的分析主要基于對(duì)其系譜和性狀的考察，通過取長(zhǎng)補(bǔ)短，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在雜交后代中篩選符合預(yù)期的表型性狀，經(jīng)過連續(xù)多代的選擇以獲得穩(wěn)定的純合系。我國(guó)育種學(xué)家開展了大量基于資料歸納和親本調(diào)查的系譜分析工作［3-4］，對(duì)促進(jìn)我國(guó)主要作物的育種工作發(fā)揮了重要作用。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)主要作物基因組的認(rèn)識(shí)也日益全面和深入，人們開發(fā)了包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、多態(tài)性DNA隨機(jī)擴(kuò)增（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、微衛(wèi)星 DNA（Simple sequence repeats，SSR）和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）等在內(nèi)的多種DNA水平的分子標(biāo)記，并由此建立了多種基因型分型的方法，在指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定和新等位基因的挖掘等方面得到了廣泛應(yīng)用［5，6］。尤其是下一代高通量測(cè)序（Next generation sequencing，NGS）［7］和SNP分型技術(shù)［8］的發(fā)展，極大促進(jìn)了對(duì)種質(zhì)資源和重要性狀相關(guān)等位基因的挖掘與鑒定，對(duì)提高育種過程中親本選擇與利用以及目標(biāo)表型的篩選效率具有重要意義。

1 基因型分型的主要方法

1.1 傳統(tǒng)的基因型分型方法

傳統(tǒng)的基因型分型方法主要基于早期開發(fā)的DNA水平的分子標(biāo)記，如第一代以Southern雜交為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的RFLP分子標(biāo)記和第二代以PCR為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的RAPD、AFLP和SSR等分子標(biāo)記［9］。由于這些DNA分子標(biāo)記具有與特定農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于挖掘和克隆與特定農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的位點(diǎn)和基因組區(qū)段，使之在目標(biāo)基因定位、標(biāo)記輔助育種和基于圖位克隆策略克隆新基因等研究中發(fā)揮著重要作用［10］。在這些分子標(biāo)記中，SSR標(biāo)記最早被用于植物育種。并且，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和分子標(biāo)記的開發(fā)利用，SSR等分子標(biāo)記也被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系、遺傳距離和遺傳多樣性分析等。但由于第一代RFLP分子標(biāo)記的檢測(cè)成本高和實(shí)驗(yàn)操作繁瑣等特點(diǎn)而影響了其在實(shí)際使用中的推廣。第二代分子標(biāo)記中的RAPD標(biāo)記技術(shù)的可靠性較差，AFLP標(biāo)記則由于其技術(shù)的專利保護(hù)及操作程序長(zhǎng)、步驟多、并要求很高的實(shí)驗(yàn)技能和精密的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，而難以被普及使用［9］。而且由于第一代和包括SSR等在內(nèi)的第二代分子標(biāo)記大多是在非編碼區(qū)擴(kuò)增或是在基因組中隨機(jī)擴(kuò)增，因此獲得的多態(tài)性位點(diǎn)通常與目標(biāo)性狀基因的遺傳距離較遠(yuǎn)，這就限制了這些標(biāo)記在重要農(nóng)藝性狀基因的定位、圖位克隆以及分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用［11］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用［7］，推動(dòng)了標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使得SNP等第三代分子標(biāo)記逐漸居于主流地位［8］。

1.2 高通量的基因型分型方法

近年來(lái)，隨著群體遺傳學(xué)和NGS技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的植物品種和品系的基因組重測(cè)序使SNP標(biāo)記日益豐富，以其共顯性、數(shù)量多、分布廣和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等特點(diǎn)得到了日益廣泛的研究和應(yīng)用。為了進(jìn)一步提高已有SNP的使用效率和分析通量，人們建立了競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR［12］（Competitive allele-specific PCR，KASP）技術(shù)和SNP芯片技術(shù)平臺(tái)［13］，促進(jìn)了以SNP為核心的高通量基因型分型技術(shù)的發(fā)展，從而極大地推動(dòng)了水稻、玉米、小麥等作物在遺傳、種質(zhì)鑒定和功能基因的克隆與鑒定、分子育種等方面的研究。

1.2.1 高通量測(cè)序技術(shù) 利用NGS對(duì)作物種質(zhì)資源的廣泛重測(cè)序所獲得的基因組數(shù)據(jù)，有助于深入挖掘SNP標(biāo)記，從而全面分析不同品種之間的遺傳差異，為在全基因組水平了解物種的進(jìn)化、親緣關(guān)系以及挖掘功能相關(guān)標(biāo)記和基因提供了重要工具。深圳華大基因研究院較早開展了基于水稻高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的SNP分析工作［14］。Yamamoto等［15］對(duì)水稻日本晴的近緣種越光進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并利用1 917個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)151個(gè)代表性的日本水稻材料進(jìn)行了基因型分析。結(jié)果表明，60.9%的越光基因組具有原始祖先的單倍型，還發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代育種技術(shù)降低了水稻的遺傳多樣性。Xu等［16］利用對(duì)40個(gè)栽培稻和10個(gè)野生稻的重測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得了650萬(wàn)個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，并在栽培稻中鑒定了大量低多樣性的基因，可能位于馴化過程中受到人工選擇的候選區(qū)域。

1.2.2 基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）的高通量SNP分型 熒光染料EvaGreen等因?yàn)槟芤燥柡偷姆绞浇Y(jié)合到雙鏈DNA分子上，而且價(jià)格便宜，從而被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）［17］。隨后，利用該熒光報(bào)告系統(tǒng)開發(fā)出了可以高通量檢測(cè)SNP和InDel（Insertion-deletion）分子標(biāo)記的 KASP技術(shù)［12］。其原理是利用兩條3’-末端堿基不同的等位基因正向引物分別對(duì)應(yīng)檢測(cè)位點(diǎn)的不同堿基狀態(tài)，帶有不同熒光的兩條檢測(cè)引物可以分別檢測(cè)兩條正向引物5’端的互補(bǔ)序列，經(jīng)過與同一條反向引物PCR擴(kuò)增以后，待測(cè)位點(diǎn)的多態(tài)性即可通過不同的熒光信號(hào)得以檢測(cè)出來(lái)。該技術(shù)適用于高通量分析平臺(tái)，可同時(shí)對(duì)大批量的SNP標(biāo)記和樣品進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因驗(yàn)證和檢測(cè)［18-19］。由于其通量高、穩(wěn)定性好和價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人、動(dòng)物和植物遺傳學(xué)研究與群體分型［20］。目前，英國(guó)LGC公司開發(fā)了最先進(jìn)的基于KASP技術(shù)的SNPline分析平臺(tái)。國(guó)內(nèi)已有包括中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、中種集團(tuán)和華智水稻生物技術(shù)有限公司等多家單位引進(jìn)了這套系統(tǒng)。

1.2.3 基于SNP芯片的分型技術(shù) 由于NGS的發(fā)展和成本的下降，更多物種資源被測(cè)序和重測(cè)序，這為高質(zhì)量全基因組水平SNP的挖掘提供了便利，使得開發(fā)SNP芯片用于SNP的高通量檢測(cè)成為一種趨勢(shì)［13］，并獲得快速發(fā)展（表1）。SNP芯片的工藝原理是在玻璃基片上通過光蝕刻的方式形成微米級(jí)的小孔，用以容納微珠，每個(gè)微珠偶聯(lián)上幾十萬(wàn)個(gè)具有相同序列的DNA片段，該DNA片段游離的3’-端約50 bp的序列可與特定的SNP或InDel位點(diǎn)結(jié)合，芯片經(jīng)過與待測(cè)樣品的基因組DNA雜交以后檢測(cè)雜交信號(hào)，即可在全基因組水平快速分析材料的遺傳背景［21］。較早的全基因組SNP芯片開發(fā)是在櫻桃上進(jìn)行的［22］。隨后，多個(gè)針對(duì)蘋果、小麥和玉米等物種的芯片系統(tǒng)被陸續(xù)開發(fā)并廣泛應(yīng)用［23-26］。

在水稻高通量檢測(cè)和分型方面，鄧興旺［27］課題組曾指出基于組學(xué)如NGS和芯片技術(shù)的基因型分型平臺(tái)的發(fā)展和應(yīng)用將在分子設(shè)計(jì)育種實(shí)踐中發(fā)揮重要作用。隨后，人們又開發(fā)了多款水稻全基因組SNP芯片［28-30］。最近，華智水稻生物技術(shù)有限公司聯(lián)合中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院開發(fā)了一款整合了56 897個(gè)SNP標(biāo)記的56 K SNP芯片（未發(fā)表的數(shù)據(jù)），該芯片基于全球3 024份水稻樣本的重測(cè)序數(shù)據(jù)［31］。

表1 商業(yè)化的SNP芯片

1.3 SNP分析工具和數(shù)據(jù)庫(kù)

隨著越來(lái)越多作物品種被測(cè)序，SNP標(biāo)記也日益豐富，為方便SNP數(shù)據(jù)的高效管理和有效利用，人們開始SNP分析工具和數(shù)據(jù)庫(kù)的開發(fā)與研究（表2）。較早期的AutoSNPdb數(shù)據(jù)庫(kù)主要基于EST數(shù)據(jù)而開發(fā)，它包含了水稻、大麥和花椰菜等的SNP數(shù)據(jù)［32］。隨后，一批通用性好、具有交互功能的SNP分析工具陸續(xù)得到了開發(fā)和應(yīng)用［33-35］。近年來(lái)比較重要的水稻SNP分析平臺(tái)主要有HapRice［36］、RiceVarMap［37］和 IC4R［38］。HapRice 主要提供 SNP信息和檢索功能。RiceVarMap提供基于標(biāo)記名稱、基因組區(qū)域、基因名稱和基因注釋等方式的標(biāo)記查詢。IC4R整合了來(lái)源于多個(gè)平臺(tái)的水稻表達(dá)譜數(shù)據(jù)、同源檢索數(shù)據(jù)庫(kù)、水稻遺傳多樣性數(shù)據(jù)庫(kù)和水稻相關(guān)文獻(xiàn)挖掘等。CerealsDB是一款針對(duì)小麥（Triticum aestivum）SNP標(biāo)記鑒定和分型的數(shù)據(jù)庫(kù)［39］。

表2 SNP分析工具和數(shù)據(jù)庫(kù)

2 高通量基因型分型技術(shù)在水稻中的應(yīng)用

水稻作為我國(guó)最重要的糧食作物，對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有不可替代的重要性。在新形勢(shì)下，保障水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)就成為水稻育種刻不容緩的目標(biāo)。為此，近年來(lái)，人們利用NGS和水稻全基因組SNP芯片等高通量基因型分型技術(shù)結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS），在水稻種質(zhì)資源進(jìn)化、重要農(nóng)藝性狀、抗病和耐逆相關(guān)位點(diǎn)的挖掘與鑒定方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，極大促進(jìn)了水稻功能基因組學(xué)的發(fā)展，為水稻育種提供了重要的參考信息。

2.1 水稻進(jìn)化與人工選擇研究

在水稻人工選擇和馴化方面，He等［40］對(duì)來(lái)自秈稻、粳稻和野生稻的66個(gè)水稻材料進(jìn)行了重測(cè)序。結(jié)果顯示，秈稻和粳稻有獨(dú)立的起源祖先，且許多低多樣性區(qū)域（LDRs）僅僅包含有一個(gè)已知的馴化基因，并鑒定出13個(gè)新的馴化相關(guān)基因。Lestari等［41］克隆了43個(gè)水稻品種的254條編碼蔗糖合成酶3（RSUS3）的序列，通過SNP和InDel標(biāo)記的分析最終鑒定了11個(gè)單倍型，發(fā)現(xiàn)了至少11個(gè)重組事件，且主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄區(qū)，為今后的遺傳相關(guān)性研究建立了一種新的分類學(xué)方法。Yonemaru等［42］對(duì)177個(gè)日本水稻品種的遺傳背景分析顯示，由于育種選擇導(dǎo)致在多個(gè)染色體區(qū)段的單倍型多樣性下降，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)由于人工選擇而出現(xiàn)了新的單倍型多樣性。這為通過基因聚合和人工選擇來(lái)形成新的單倍型提供了理論基礎(chǔ)。人們通常認(rèn)為，現(xiàn)代野生稻是野生稻祖先群體的后代，野生稻的祖先群體衍生出現(xiàn)代馴化水稻。基于對(duì)203個(gè)馴化水稻和435個(gè)亞洲野生稻重測(cè)序數(shù)據(jù)的最新研究結(jié)果，Wang等［43］發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代野生稻是一個(gè)雜合群體，這與野生稻和馴化水稻之間持續(xù)而廣泛的通過花粉或種子介導(dǎo)的基因漂移有關(guān)。

2.2 水稻重要農(nóng)藝性狀相關(guān)位點(diǎn)分析

近年來(lái)，利用GWAS策略挖掘水稻重要農(nóng)藝性狀的相關(guān)位點(diǎn)取得了重要進(jìn)展。基于533份地方品種和雜交水稻的SNP標(biāo)記，Yang等［44］進(jìn)行了15個(gè)性狀的GWAS分析，鑒定了一批與谷粒緊實(shí)度、谷粒投射面積等性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)。對(duì)來(lái)自73個(gè)國(guó)家和地區(qū)的1 479個(gè)水稻品種的GWAS分析發(fā)現(xiàn)，大量與株高、葉夾角、開花時(shí)間、每株分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒重等性狀相關(guān)的基因和位點(diǎn)在育種過程中受到了強(qiáng)烈選擇［45］。Biscarini等［46］利用57 000個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)391個(gè)溫帶粳稻品種進(jìn)行了GWAS分析，最終檢測(cè)到42個(gè)基因型與表型之間的顯著關(guān)聯(lián)，其中控制劍葉寬度和株高的最顯著關(guān)聯(lián)分別位于4號(hào)和6號(hào)染色體。這些強(qiáng)關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)將可能應(yīng)用于水稻的人工選擇。最近，中科院植物生理生態(tài)研究所韓斌［47］課題組在雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理研究方面取得了重要進(jìn)展。他們對(duì)17個(gè)代表性雜交水稻的F2代群體進(jìn)行了重測(cè)序，獲得了170萬(wàn)個(gè)SNP。隨后的GWAS分析顯示，盡管沒有找到在所有材料中都存在的雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)位點(diǎn)，但在每個(gè)組內(nèi)，有一些來(lái)自母本的基因組位點(diǎn)具有比父本更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)量相關(guān)的雜合位點(diǎn)和超親雜種優(yōu)勢(shì)具有部分顯性特征的證據(jù)。水稻早期生長(zhǎng)勢(shì)與積累、儲(chǔ)藏和利用非結(jié)構(gòu)性糖從而產(chǎn)生更大或更多葉片的基因型有關(guān)。Rebolledo等［48］利用12 221個(gè)SNP對(duì)123個(gè)日本水稻品種的早期生長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行了GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)與株高、營(yíng)養(yǎng)器官的細(xì)胞大小或數(shù)目等相關(guān)的關(guān)聯(lián)。

2.3 水稻耐逆和抗病相關(guān)研究

挖掘?qū)γ{迫耐受的水稻相關(guān)基因和資源是目前水稻功能基因組學(xué)研究和育種的重要任務(wù)。Kumar等［49］利用SNP芯片對(duì)220個(gè)水稻品種的12個(gè)性狀進(jìn)行了GWAS分析，最終鑒定了20個(gè)與Na+/K+比值高度相關(guān)的SNP位點(diǎn)。Rahman等［50］利用376個(gè)SNP標(biāo)記從107份水稻中最終鑒定出一批與已知耐鹽品種不同的耐鹽水稻資源。水稻對(duì)稻瘟病（Magnaporthe oryzae）的抗性是由許多主效基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait locus，QTL）來(lái)決定的。為了在全基因組水平探究水稻抗稻瘟病的分子機(jī)制，Kang等［51］利用水稻44K全基因組SNP芯片對(duì)420份水稻品種進(jìn)行了稻瘟病抗性的GWAS分析，并利用含7萬(wàn)個(gè)SNP標(biāo)記的芯片進(jìn)行了驗(yàn)證，最終鑒定了97個(gè)稻瘟病抗性相關(guān)位點(diǎn)（LABRs）。其中82個(gè)為新位點(diǎn)，15個(gè)位點(diǎn)與已知抗性位點(diǎn)在同一區(qū)域。在LABRs區(qū)域的所有候選基因中，LABR_64與水稻對(duì)5個(gè)稻瘟病菌的抗性顯著相關(guān)。

3 結(jié)語(yǔ)

通過系譜法了解作物品種的遺傳基礎(chǔ)，追溯親本來(lái)源，對(duì)于縮短作物育種進(jìn)程，提高育種效率，充分利用雜種優(yōu)勢(shì)，具有重要意義。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因組學(xué)與高通量分子標(biāo)記技術(shù)的興起，人們對(duì)作物遺傳背景的分析有了更便捷的工具，如基于重測(cè)序數(shù)據(jù)的基因型分型方法（Genotyping-based Squencing，GBS）［7］和 基 于 KASP［18-19］和 SNP 芯片［13］的高通量SNP分析技術(shù)，對(duì)育種群體目標(biāo)性狀的篩選和鑒定也有了更高效而科學(xué)的手段，而不再只依賴人工的田間性狀觀察和分析。但是重測(cè)序、KASP和SNP芯片的測(cè)試和數(shù)據(jù)分析成本比較高，而且對(duì)儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)員的專業(yè)技術(shù)水平均有較高的要求，因此，此類實(shí)驗(yàn)需要有較大的項(xiàng)目支持，而且一般都由專業(yè)公司來(lái)完成。目前，國(guó)內(nèi)已有多家公司和單位可以承擔(dān)重測(cè)序和SNP高通量測(cè)試和分析任務(wù)，如華大科技的Illumina SNP芯片分型平臺(tái)和Affymetrix基因分型平臺(tái)，華智和中玉金標(biāo)記的高通量分子育種平臺(tái)，北京百邁克和上海歐易的全基因組重測(cè)序分析平臺(tái)等。這些高通量分型技術(shù)的應(yīng)用和專業(yè)技術(shù)平臺(tái)的建立極大地推動(dòng)了國(guó)內(nèi)分子標(biāo)記輔助選擇［52］和基因組選擇（Genomic selection，GS）［53］在動(dòng)植物育種方面的應(yīng)用，提升了種質(zhì)資源多樣性的利用水平，提高了育種效率。

同時(shí)，由于作物很多重要的經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀往往受多基因或多位點(diǎn)影響，因此通過單個(gè)或者多個(gè)SNP對(duì)性狀進(jìn)行研究并不能取得理想的效果。而在進(jìn)化和選擇過程中有可能出現(xiàn)由多個(gè)功能相關(guān)SNP緊密連鎖形成的單倍型，由于單倍型含有更多的連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）信息可以挖掘，更有利于在關(guān)聯(lián)分析（GWAS）中尋找和定位性狀相關(guān)基因位點(diǎn)。利用GBS和高通量SNP分析技術(shù)，可以在全基因組水平獲得自然群體進(jìn)化、遺傳多樣性和單倍型等信息。因此，在全基因組水平上的基因型分型和單倍型分析與挖掘?qū)蚓酆虾妥魑锲贩N改良具有重要的指導(dǎo)意義［42］。

［1］Buckler ES, Gaut BS, McMullen MD. Molecular and functional diversity of maize［J］. Curr Opin Plant Biol, 2006, 9（2）：172-176.

［2］Collard BC, Mackill DJ. Marker-assisted selection：an approach for precision plant breeding in the twenty-first century［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2008, 363（1491）：557-572.

［3］蓋鈞鎰, 趙團(tuán)結(jié). 中國(guó)大豆育種的核心祖先親本分析［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 24（2）：20-23.

［4］孫琦, 李文才, 于彥麗, 等. 美國(guó)商業(yè)玉米種質(zhì)來(lái)源及系譜分析［J］. 玉米科學(xué) , 2016, 24（1）：8-13.

［5］McCouch S. Diversifying selection in plant breeding［J］. PLoS Biol, 2004, 2（10）：e347.

［6］Slade AJ, Fuerstenberg SI, Loeffler D, et al. A reverse genetic,nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING［J］. Nat Biotechnol, 2005, 23（1）：75-81.

［7］Uitdewilligen J, Wolters AMA, D’hoop BB, et al. A next-generation sequencing method for genotyping-by-sequencing of highly heterozygous autotetraploid potato［J］. PLoS One, 2013, 8（5）：e62355.

［8］Munoz-Amatriain M, Cuesta-Marcos A, Hayes PM, et al. Barley genetic variation ：implications for crop improvement［J］.Briefings in Functional Genomics, 2014, 13（4）：341-350.

［9］匡猛, 楊偉華, 許紅霞, 等. 分子標(biāo)記技術(shù)在棉花品種鑒定上的研究進(jìn)展［J］. 棉花學(xué)報(bào), 2009, 21（4）：330-334.

［10］Hayashi K, Hashimoto N, Daigen M, et al. Development of PCR-based SNP markers for rice blast resistance genes at the Piz locus［J］. Theor Appl Genet, 2004, 108（7）：1212-1220.

［11］王昊龍, 韓俊杰, 李淼淼, 等. 功能標(biāo)記的開發(fā)及在禾谷類作物中的應(yīng)用［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2014, 28（11）：1963-1971.

［12］He C, Holme J, Anthony J. SNP genotyping：the KASP assay［J］. Methods Mol Biol, 2014, 1145：75-86.

［13］ Ganal MW, Durstewitz G, Polley A, et al. A large maize（Zea mays L.）SNP genotyping array：development and germplasm genotyping, and genetic mapping to compare with the B73 reference genome［J］, PLoS One, 2011, 6（12）：e28334.

［14］Li R, Li Y, Fang X, et al. SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing［J］. Genome Res, 2009, 19（6）：1124-1132.

［15］Yamamoto T, Nagasaki H, Yonemaru J, et al. Fine definition of the pedigree haplotypes of closely related rice cultivars by means of genome-wide discovery of single-nucleotide polymorphisms［J］.BMC Genomics, 2010, 11：267.

［16］Xu X, Liu X, Ge S, et al. Resequencing 50 accessions of cultivated and wild rice yields markers for identifying agronomically important genes［J］. Nat Biotechnol, 2012, 30（1）：105-111.

［17］Li YD, Chu ZZ, Liu XG, et al. A cost-effective high-resolution melting approach using the EvaGreen dye for DNA polymorphism detection and genotyping in plants［J］. J Integr Plant Biol, 2010,52（12）：1036-1042.

［18］He C, Holme J, Anthony J. SNP genotyping：the KASP assay［J］. Methods Mol Biol, 2014, 1145：75-86.

［19］Zhou G, Zhang Q, Tan C, et al. Development of genome-wide InDel markers and their integration with SSR, DArT and SNP markers in single barley map［J］. BMC Genomics, 2015, 16（1）：804.

［20］Graves H, Rayburn AL, Gonzalez-Hernandez JL, et al. Validating DNA polymorphisms using KASP assay in prairie cordgrass（Spartina pectinata Link）Populations in the U. S［J］. Front Plant Sci, 2015, 6：1271.

［21］張小燕, 左明雪, 張占軍, 等. 用基因芯片檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理［J］. 中國(guó)生物工程雜志, 2005, 25（11）：52-56.

［22］Peace C, Bassil N, Main D, et al. Development and evaluation of a genome-wide 6K SNP array for diploid sweet cherry and tetraploid sour cherry［J］. PLoS One, 2012, 7（12）：e48305.

［23］Chagne D, Crowhurst RN, Troggio M, et al. Genome-wide SNP detection, validation, and development of an 8K SNP array for apple［J］. PLoS One, 2012, 7（2）：e31745.

［24］Cavanagh CR, Chao S, Wang S, et al. Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targets of selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars［J］. PNAS, 2013, 110（20）：8057-8062.

［25］Wang S, Wong D, Forrest K, et al. Characterization of polyploid wheat genomic diversity using a high-density 90, 000 single nucleotide polymorphism array［J］. Plant Biotechnol J, 2014, 12（6）：787-796.

［26］Unterseer S, Bauer E, Haberer G, et al. A powerful tool for genome analysis in maize：development and evaluation of the high density 600 k SNP genotyping array［J］. BMC Genomics, 2014, 15 ：823.

［27］Chen H, He H, Zhou F, et al. Development of genomics-based genotyping platforms and their applications in rice breeding［J］.Curr Opin Plant Biol, 2013, 16（2）：247-254.

［28］Yu H, Xie W, Li J, et al. A whole-genome SNP array（RICE6K）for genomic breeding in rice［J］. Plant Biotechnol J, 2014, 12（1）：28-37.

［29］Singh N, Jayaswal PK, Panda K, et al. Single-copy gene based 50 K SNP chip for genetic studies and molecular breeding in rice［J］.Sci Rep, 2015, 5：11600.

［30］McCouch SR, Wright MH, Tung CW, et al. Open access resources for genome-wide association mapping in rice［J］. Nat Commun,2016, 7：10532.

［31］Li JY, Wang J and Zeigler RS. The 3, 000 rice genomes project：new opportunities and challenges for future rice research［J］.Gigascience, 2014, 3：8.

［32］Duran C, Appleby N, Clark T, et al. AutoSNPdb：an annotated single nucleotide polymorphism database for crop plants［J］.Nucleic Acids Res, 2009, 37（suppl_1）：D951-953.

［33］Nijveen H, van Kaauwen M, Esselink DG, et al. QualitySNPng：a user-friendly SNP detection and visualization tool［J］. Nucleic Acids Res, 2013, 41（W1）：W587-590.

［34］Azam S, Rathore A, Shah T M, Telluri M, et al. An integrated SNP mining and utilization（ISMU）pipeline for next generation sequencing data［J］. PLoS One, 2014, 9（7）：e101754.

［35］Dereeper A, Homa F, Andres G, et al. SNiPlay3：a web-based application for exploration and large scale analyses of genomic variations［J］. Nucleic Acids Res, 2015, 43（W1）：W295-300.

［36］Yonemaru J-i, Ebana K, Yano M. HapRice, an SNP Haplotype Database and a Web Tool for Rice［J］, Plant Cell Physiol, 2014,55（1）：e9.

［37］Zhao H, Yao W, Ouyang Y, et al. RiceVarMap：a comprehensive database of rice genomic variations［J］. Nucleic Acids Res,2015, 43（D1）：D1018-1022.

［38］Consortium IRP. Information Commons for Rice（IC4R）［J］.Nucleic Acids Res, 2016, 44（D1）：D1172-1180.

［39］Wilkinson PA, Winfield MO, Barker GL, et al. CerealsDB 3.0：expansion of resources and data integration［J］. BMC Bioinformatics, 2016, 17：256.

［40］He Z, Zhai W, Wen H, et al. Two evolutionary histories in the genome of rice：the roles of domestication genes［J］. PLoS Genet, 2011, 7（6）：e1002100.

［41］Lestari P, Lee G, Ham TH, et al. Single nucleotide polymorphisms and haplotype diversity in rice sucrose synthase 3［J］. J Hered,2011, 102（6）：735-746.

［42］Yonemaru J, Yamamoto T, Ebana K, et al. Genome-wide haplotype changes produced by artificial selection during modern rice breeding in Japan［J］. PLoS One, 2012, 7（3）：e32982.

［43］Wang H, Vieira FG, Crawford JE, et al. Asian wild rice is a hybrid swarm with extensive gene flow and feralization from domesticated rice［J］. Genome Res, 2017, 27：1-10.

［44］Yang W, Guo Z, Huang C, et al. 15 genetic variation in rice［J］.Nat Commun, 2014, 5：5087.

［45］Xie W, Wang G, Yuan M, et al. Breeding signatures of rice improvement revealed by a genomic variation map from a large germplasm collection［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112（39）：E5411-5419.

［46］Biscarini F, Cozzi P, Casella L, et al. Genome-Wide Association Study for Traits Related to Plant and Grain Morphology, and Root Architecture in Temperate Rice Accessions［J］. PLoS One, 2016,11（5）：e0155425.

［47］Huang X, Yang S, Gong J, et al. Genomic architecture of heterosis for yield traits in rice［J］. Nature. 2016, 537（7622）：629-633.

［48］Rebolledo M C, Dingkuhn M, Courtois B, et al. Phenotypic and genetic dissection of component traits for early vigour in rice using plant growth modelling, sugar content analyses and association mapping［J］. J Exp Bot, 2015, 66（18）：5555-5566.

［49］Kumar V, Singh A, Mithra SV, et al. Genome-wide association mapping of salinity tolerance in rice（Oryza sativa）［J］. DNA Res, 2015, 22（2）：133-145.

［50］Rahman MA, Thomson MJ, Shah EAM, et al. Exploring novel genetic sources of salinity tolerance in rice through molecular and physiological characterization［J］. Ann Bot, 2016, 117（6）：1083-1097.

［51］Kang H, Wang Y, Peng S, et al. Dissection of the genetic architecture of rice resistance to the blast fungus Magnaporthe oryzae［J］. Mol Plant Pathol, 2016, 17（6）：959-972.

［52］寧洽, 劉文國(guó), 楊偉光, 等. SNP 標(biāo)記在玉米研究上的應(yīng)用進(jìn)展［J］. 玉米科學(xué) , 2017, 25（1）：57-61.

［53］呂銳玲, 周強(qiáng). 植物基因組選擇及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016, 32（15）：107-11.

High-throughput Genotyping Techniques and Their Applications in Rice

ZHANG Xian-wen1，2，3HE Zhi-zhou2JIANG Nan2DENG Hua-feng1Li Ji-ming2
（1. State Key Laboratory of Hybrid Rice，Hunan Hybrid Rice Research Center，Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410125 ；2. Huazhi Rice Biotech Co.，Ltd.，Changsha 410125 ；3. College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

Deep understanding and efficient utilization of genetic basis of crop germplasm resources is of great importance for crop cultivar improvement and food safety. The traditional methods based on pedigree played a vital role in breeding practice. With the rapid development of molecular biology，genotyping methods based on genomics and high-throughput SNP markers have been developed and may efficiently identify the germplasm resources. This article reviews the main genotyping methods，focusing on the methods based on single nucleotide polymorphism（SNP）marker such as the next-generation sequencing（NGS），competitive allele-specific PCR（KASP），and SNP chip as well as the popular SNP analysis tools and databases. Furthermore，this article introduces the progresses of high-throughput SNP genotyping techniques in studying rice，and prospects the application and developmental trends of genotyping techniques in the fields such as crop breeding and so on.

pedigree；SNP；genotyping；next generation sequencing；competitive allele-specific PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0467

2017-06-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000125），中國(guó)博士后基金（2016M600627），雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖南雜交水稻研究中心）開放課題基金（2016KF05）

張先文，男，博士研究生，研究方向：水稻雜種優(yōu)勢(shì)；E-mail：xianwenzhang@hunau.edu.cn

鄧華鳳，男，博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向：水稻遺傳育種；E-mail：dhf@hhrrc.ac.cn李繼明，男，研究員，研究方向：水稻分子育種；E-mail：Jiming.li@wiserice.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）