防治水果病害的生防酵母及生防制劑研究進展

李僑飛，張紅印*，楊其亞，林 珍，程洋洋，孫藝文

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

防治水果病害的生防酵母及生防制劑研究進展

李僑飛，張紅印*，楊其亞，林 珍，程洋洋，孫藝文

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

水果在生長和貯藏過程中極易受到病原菌侵染而腐爛，從而造成巨大的經濟損失。目前，田間病害防控及采后果實貯藏保鮮主要依靠化學制劑。化學制劑因其高效性及便利性在農業(yè)領域備受歡迎，但化學制劑的廣泛使用對人體和環(huán)境都造成了很大的危害。因此，水果防腐需要尋求更安全、環(huán)保并高效的方法，其中生物防治是替代化學防治的有效措施之一。本文主要探究了生防酵母對于水果采后病害的生防效果及存在問題，并對國內外生防制劑的研究現(xiàn)狀和前景進行了分析討論，以期能為我國酵母生防制劑的商業(yè)化生產與應用提供有價值的參考。

酵母；水果；采后病害；生物防治；生防制劑

我國是世界上最大的水果生產國，目前，我國果樹種植面積1 320萬 hm2，水果產量達12 660.82萬 t。在2014年全國水果產量中，蘋果、柑橘、梨、桃、葡萄的總產量為10 698.38萬 t，占全國水果產量的79.18%[1]。雖然我國水果產量居世界之首，但水果采后腐爛造成的損失十分嚴重，我國每年由于病菌侵染和保鮮技術不完善所造成的果蔬損失占整個行業(yè)產值的30%以上。水果腐爛不是某一地域性的問題，而是在世界各國普遍存在的問題，聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）的報告表明，歐洲、北美和大洋洲等發(fā)達地區(qū)果蔬采后損失為29%；亞洲、非洲和拉丁美洲等地區(qū)果蔬采后損失為38%[2]?？傮w來說，即使在發(fā)達國家，每年由于采后病害造成的果蔬損失達到總量的20%～25%；在發(fā)展中國家，采后病害造成的果蔬損失更加嚴重[3]。造成水果腐爛的因素很多，其中水果采后由致病菌引起的腐爛造成的經濟損失尤為嚴重，化學殺菌劑是目前運用最普遍和最有效的控制方法。為了保證和提高農作物的產量，農藥和化學激素等農用化學制品的使用也越來越廣泛。雖然保證了農作物的產量，但對土壤和水體等環(huán)境的污染卻日趨嚴重，我國每年遭受農藥殘留污染的作物面積約達800萬 hm2，其中污染嚴重的比例達40%[4]，并且施用于作物上的農藥會在農作物里殘留，不容易降解，對人體危害極大。而果蔬的農藥殘留問題更為嚴重，殘留農藥有機磷能引起神經功能紊亂，攝入后可能出現(xiàn)一系列神經毒性表現(xiàn)，嚴重者則會中毒死亡；重金屬和硝酸鹽污染屬于慢性積累中毒，會引起癌癥和精神分裂癥等疾病[5]。因此化學制劑的使用不僅會引起農副產品質量下降，而且還會導致農業(yè)生態(tài)環(huán)境的惡化，對人們的生存健康帶來巨大的安全隱患。所以為了保護食品的安全和生態(tài)環(huán)境，需要找尋可以代替化學殺菌劑的方法，生物防治是有效替代措施之一。加強生物防治的研究，提倡綠色發(fā)展已是當前農業(yè)經濟發(fā)展的一項刻不容緩的任務。

1 拮抗酵母的生物防治效果及其存在的問題

水果采后的腐爛主要是由于真菌侵染所致，真菌是果實最主要的致腐病原菌。不同的水果主要的侵染菌也有所不同，葡萄的病害有灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的灰霉病以及黑曲霉（Aspergillus niger）引起的黑粉病[6]。蘋果采后貯藏期間腐爛的病害主要有擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病[7]；柑橘類采后腐爛的病害主要是由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病和意大利青霉（Penicillium italicum）引起的青霉病[8]。這些病害導致水果損失嚴重，對其的控制主要通過化學農藥來實現(xiàn)；但近些年隨著生物防治研究的加強，運用生物防治也可以有效地控制這些病害。利用生物防治來控制水果病害主要是利用生物物種間的相互關系，一種或一類生物抑制另一種或另一類生物的生長，從而達到抑制病菌、保鮮防腐的效果，對提高農作物的安全性及產量有著重要的推動作用。并且，生物防治和化學防治相比具有經濟、有效、安全、污染小和產生抗藥性慢等優(yōu)點[9]。生物防治作為替代化學殺菌劑的環(huán)境友好、新型安全的方法，成為近年來學者研究的熱點。目前已研究的可作為水果采后病害拮抗菌的微生物包括細菌、霉菌和酵母菌等。其中酵母菌因具有拮抗效果好、繁殖速度快、抗逆能力強、安全性高、遺傳穩(wěn)定、抑菌譜較廣以及可以和化學殺菌劑共同使用等優(yōu)點而成為水果采后生物防治研究的熱點[10]。利用酵母菌進行水果采后病害生物防治，其拮抗機理主要表現(xiàn)為營養(yǎng)或空間競爭、對病原菌的寄生、抗生作用及誘導抗性等。國內外的科研工作者致力于研究拮抗酵母對水果病害的控制，均取得了非常好的研究成果。Wilson等[11]在20世紀90年代就開始研究水果采后病害，并致力于生物防治的研究，在生防酵母方面取得了不錯的成果。隨著對生防酵母的深入研究，世界各國的科研工作者在拮抗酵母生物防治方面取得了顯著性的成果。淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）對梨果上感染的青霉病和灰霉病有很好的控制效果；膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）可以有效控制梨上的灰霉病[12]；卡利比克畢赤酵母（Pichia caribbica）可以有效控制桃子的根霉腐爛[13]；海洋紅酵母（Rhodos poridium paludigenum）可以有效控制柑橘的綠霉病和青霉病[14]；異常畢赤酵母（Pichia anomala）SRF可以控制蘋果的青霉病[15]；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以有效控制葡萄的黑曲霉病[16]。Concei??o等[17]研究發(fā)現(xiàn)，使用酵母LMA1結合Si處理組與對照組相比，細菌性果斑病的發(fā)病率明顯降低，降低幅度可以達到80%以上[17]。Nally等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在25 ℃、酵母濃度為107CFU/mL的條件下，與對照組相比，9 株釀酒酵母可以完全抑制葡萄上由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的灰霉病。LI Renping等[19]研究發(fā)現(xiàn)膠紅酵母對于蘋果灰霉病的控制效果顯著，與對照組相比，膠紅酵母處理組的灰霉病發(fā)病率降低了97.1%。近幾年來我國科研團隊也相繼研究了多種酵母對果蔬病害的控制，取得顯著效果。比如，葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）Y3可顯著抑制柑橘的青霉病，實驗組的腐爛率比對照組降低了61.8%，且結合15 mg/mL的卵磷脂使用，拮抗效果更好，比對照組的柑橘腐爛率降低了93.5%[20]。

酵母菌對水果采后霉菌病害的控制效果明顯，但其缺點也同樣存在。到目前為止，酵母菌的應用并不廣泛，其商業(yè)化之路也十分艱難。究其原因主要有：1）研究酵母菌的時間較短、深度尚淺，文獻報道的拮抗酵母大多用來防治采后水果傷口處的病原菌，而不是直接用在水果表皮防止正常水果的病原菌入侵[21]；2）在實際生產條件下，酵母菌受外界環(huán)境的影響較大，比如濕度、溫度和酸堿度都會對酵母菌的活力造成很大的影響，酵母菌的活力一旦下降，就無法對病害起到應有的控制效果；3）目前使用拮抗酵母菌與化學殺菌劑相比成本較高，也沒有化學殺菌劑的防治效果穩(wěn)定；4）酵母菌不能長期在室溫貯藏，使用期限短，并且不如化學試劑使用方便。這一系列的因素都影響了拮抗酵母菌的進一步開發(fā)與利用，阻礙了酵母菌作為水果保鮮劑和生防制劑在生產中的使用。

2 生防制劑的應用優(yōu)勢與國內外研究現(xiàn)狀

要解決拮抗酵母作為水果生防菌劑在實際應用中存在的問題，就要提高拮抗菌的穩(wěn)定性和生防效力，擴大拮抗酵母菌的應用范圍。最新的研究結果顯示，提高其生防效力的方法有以下幾種：1）將拮抗菌與低劑量的化學殺菌劑混合使用防治病害，可提高拮抗菌的抑菌能力；2）使用生物工程技術改造拮抗酵母菌從而提高其生防效果，比如，Limón等[22]將chit33基因導入酵母Trichoderma harizanum后，其轉化菌株產生的幾丁質酶活力是野生型的200 倍以上，抑菌能力大大加強；但是利用轉基因技術改造的菌株需要應用到實際生產中，必須經過后續(xù)的安全驗證；3）將拮抗酵母研制成生防制劑，可以延長酵母菌的使用期限、提高酵母菌的生防效果。目前微生物制劑是研究的熱點，因為生防制劑有許多優(yōu)點：首先，其活性高、用量少，為一般化學農藥用量的10%～20%；其次，生防制劑不會使病菌產生抗藥性，并且分解快速，對人體和環(huán)境沒有危害；最后，生防制劑所需的生產原料大多為農副產品，來源廣、易生產，有比較好的經濟效益[23]。生防制劑還可以結合化學物質從而制成復合生防制劑，進一步提高生防效果。比如拮抗酵母結合特定的化學物質如水楊酸、茉莉酸甲酯、碳酸氫鈉、殼聚糖等可以大幅度提高其生防效力[24-27]。

隨著科學技術的發(fā)展，越來越多的生防制劑產品實現(xiàn)了商業(yè)化，酵母制劑的優(yōu)點突出，是當前研究的熱點。但是除了酵母制劑，還有一些其他的生防制劑產品，也對水果病害有非常有效的控制效果。近年來已報道了多種實現(xiàn)商業(yè)化的生防制劑，如表1所示。早在1997年，新西蘭的研究人員成功研制出一種具有商業(yè)化潛力并且對葡萄灰葡萄孢霉有較好控制力的生防制劑BOTRY-Zen。這種生防制劑可與其他真菌形成競爭抑制，殺死作物上經常出現(xiàn)的葡萄孢屬（Botrytis）和核盤菌屬（Sclerotinia）病害；而且，BOTRY-Zen孢子制劑不具有入侵性，不會對活的植物組織造成威脅。研究人員已經在新西蘭葡萄園內對BOTRY-Zen進行了實驗，結果顯示只要正確使用，該產品可以有效保護葡萄不受灰葡萄孢霉感染。進一步的研究結果表明，6 g/L的商業(yè)制劑BOTRY-Zen可以有效地控制草莓和葡萄的果實腐爛率[28]。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)BOTRY-Zen在黑醋栗和獼猴桃上也表現(xiàn)出了良好的真菌抑制效果[29]。Calvo-Garrido等[30]研究的結果也表明BOTRY-Zen的使用使葡萄灰霉病的發(fā)病率降低了50%左右，并且BOTRY-Zen還可以與克菌丹和硫磺等殺菌劑共同使用。另外，生防制劑Aspire也實現(xiàn)了商業(yè)化的應用，其起主要抑菌的活性成分為假絲酵母菌。食品公司研究了Aspire對柑橘類水果采后病害的防治效果，實驗分為3 個組：對照組、實驗組（Aspire結合200 μg/mL的噻苯咪唑）和農藥組（2 000 μg/mL的噻苯咪唑、2 000 μg/mL的甲霜靈、2 000 μg/mL的抑霉唑和2 000 μg/mL的苯酚鈉），3 個處理組的柑橘在20 ℃存放28 d。結果顯示，對照組、實驗組和農藥組的柑橘腐爛率分別為24.2%、1.2%和2.2%[31]；說明Aspire可以有效控制柑橘的腐爛，對柑橘的綠霉病和青霉病有非常好的抑制效果。并且研究發(fā)現(xiàn)，Aspire還能控制由白地霉（Geotrichum candidum）引起的酸腐病[32]。Torres等[33]用海藻糖、丙三醇和聚乙二醇作假絲酵母液體制劑的保護劑，以此獲得假絲酵母細胞的液體制劑，將其在4 ℃條件下保存4 個月后，假絲酵母的活力仍大于70%；進一步的實驗表明假絲酵母制劑能有效地控制擴展青霉引起的金冠蘋果腐爛，使其腐爛率降低55%。除了以上幾種生防制劑，國外研發(fā)成功的商業(yè)生防制劑還有很多，并且在酵母制劑的商業(yè)化方面取得了顯著的成果。生防制劑Candifruit的主要成分是假絲酵母菌（Candida sake），用于控制梨果和葡萄的病害，在西班牙地區(qū)已被廣泛應用[34]。以梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）為主要成分研制的生防制劑Shemer在德國和荷蘭被廣泛應用，主要用于對多種蔬菜和水果的采前和采后灰霉病、青霉病等病害的控制[35]。生防制劑Nexy的主要成分是假絲酵母（Candida oleophila strain O），其于比利時被研制，因對果蔬病害有良好的控制效果而在歐洲國家普遍使用[36]。德國研究人員研究的一種酵母制劑，商品名為“Blossom-Protect”，在田間實驗中展現(xiàn)了對蘋果火疫病高效的控制效果[37]。

我國是農業(yè)大國，農作物豐富并且產量居于世界前列。近幾年我國提倡綠色發(fā)展，同時也推動了生物防治的研究。但由于起步較晚且受技術方面的限制，我國生防制劑還沒有實現(xiàn)廣泛的商業(yè)化應用。在生防制劑商業(yè)化應用的道路上，我國的科研工作者在借鑒和自主研發(fā)中不斷前行。徐占利[38]以膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）Y20為原材料，配合質量分數(shù)10%海藻糖、0.017 6% VC和磷酸鹽緩沖溶液制備酵母制劑并以其處理梨，在20 ℃和4 ℃條件下保存30 d，結果顯示酵母制劑對梨果的青霉菌以及灰葡萄孢霉有非常好的控制效果。溫新宇[39]用0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）配制含有1×108CFU/mL Y35-1季也蒙畢赤酵母、質量分數(shù)5%海藻糖和0.01% VC的液體生防制劑和以海藻糖作為保護劑制備Y35-1季也蒙畢赤酵母活性凍干粉劑，研究這兩種生防菌劑對枇杷貯藏保鮮方面的影響；結果顯示：這2 種生防制劑能夠明顯抑制枇杷果實貯藏期間的病害腐爛發(fā)生率，在貯藏至第25天時，腐爛指數(shù)分別僅為3.89%和4.06%；并且這兩種生防菌劑對枇杷的質量損失率、硬度、可溶性固形物含量、果皮細胞膜透性、VC含量、總糖含量、總酸含量、過氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性方面均起到了一定的積極作用。表明這2 種生防菌劑對枇杷采后貯藏保鮮方面存在積極的影響。浙江大學、云南農業(yè)大學和云南省制藥廠合作的高科技項目“木霉制劑的開發(fā)”，其結果顯示，木霉制劑使百合和辣椒中根腐病的發(fā)病率降低了70%[40]。劉錦霞等[41]以枯草芽孢桿菌D17和Bs16（體積比為1∶1）共發(fā)酵物為主藥制備的生防制劑在貯藏期間具有很高的穩(wěn)定性，在小區(qū)實驗中，枯草芽孢桿菌生防制劑的使用使得一品紅植株的灰霉病發(fā)病率降低了85%以上。另有3 株枯草芽孢桿菌生防菌株MBI600、GB03、QST713獲得環(huán)保局商品化或有限商品化生產應用許可[42]。在自主研發(fā)的同時，我們還需要借鑒國外先進的生防制劑研究技術，推廣優(yōu)良的生防制劑產品。生防制劑EM是日本科學家在20世紀80年代初期研制出來的一種新型復合微生物菌劑，因其性能穩(wěn)定、安全無害而備受關注，目前已在包括我國在內的160多個國家和地區(qū)推廣應用。EM稀釋液處理可使番茄花葉病發(fā)病率降低40%；用體積分數(shù)為0.1%的EM稀釋液浸泡山渣，可起到保鮮作用[43]；EM使根霉菌引起的草莓根腐病的發(fā)病率降低了85%以上；以一定濃度的EM稀釋液作追肥，還可以提高蔬菜和糧食作物產量，增產幅度在3.5%～15%[44]。

表1 商業(yè)化生防制劑所使用的主要微生物以及所控制的水果采后病害Table 1 Commercially available microbial biocontrol agents for the control of postharvest diseases of fruits

3 生防制劑目前面臨的形勢和應用前景

隨著經濟發(fā)展和生活水平的提高，人們對食品的安全和品質有了更高的要求，綠色無公害的食品越來越受到人們的追捧，運用生防制劑代替化學殺菌劑也是人心所向、大勢所趨。目前已經有越來越多的化學殺菌劑被禁止應用在水果上。生防制劑則可以用來填補這些化學殺菌劑的空缺，從使用效果和發(fā)展形勢來看，生防制劑顯示出巨大的商業(yè)化應用前景。我國從2008年開始禁止使用久效磷、磷胺；百草枯水劑、毒死蜱、三唑磷等40多種化學農藥自2016年底禁止在果蔬上使用。據(jù)研究報道，世界范圍內的許多國家都在減少化學殺菌劑的使用量。2016年1～5月我國累計生產殺蟲劑188 578 t，比2015年同期相比減少了9.6%[54]。根據(jù)德國農藥工業(yè)協(xié)會的數(shù)據(jù)估計，與2008年相比，2009年全球農藥市場銷售下降9.6%[55]，歐洲農藥市場銷售額下降了2.9%。從農藥類別看，除草劑的銷售同比下降5.5%，殺菌劑銷售同比下降1.9%[56]。并且，在全球統(tǒng)計的617 個農藥統(tǒng)計品種中，已過專利期的品種約占70%～80%[57]。歐洲議會也通過一項決議，一旦條件成熟，將全面禁止在采后果蔬上使用化學殺菌劑。與此同時，生防制劑的使用量卻在不斷增加，Markets and Markets發(fā)布的《2012—2017全球生物農藥市場趨勢與預測》報告顯示，2017年的生物農藥制劑的銷售額將會達到32億 美元[58]。生防制劑的研究也并不僅僅是局限于微生物方面，其選材廣闊，具有無限的開發(fā)性和可研究性。Wilson等[59]發(fā)現(xiàn)43 個科的多種植物提取物對B. cinerea病菌有拮抗作用，這些植物的提取物都表現(xiàn)出較強的抑菌活性。利用植物的提取物或者多種微生物來防治果實的采后病害也是全世界科學工作者研究熱點，并且在歐美一些發(fā)達國家易被商業(yè)化運用。就目前形勢綜合來看，化學殺菌劑的使用量在不斷減少，而生防制劑的使用量和應用范圍都在不斷增加，顯示了生防制劑良好的發(fā)展形勢。隨著科學技術和時間的推進，生防制劑必將取代化學殺菌劑，存在著巨大的市場應用前景。

4 結 語

酵母菌作為優(yōu)良的生防拮抗菌，對果蔬采后病害有顯著的控制效果；它們來源廣泛，能在比較干燥的水果表面生存，并且能夠迅速利用營養(yǎng)物質進行繁殖。酵母生防制劑不僅可以解決酵母菌對采后水果病害防治的不足，還具有保鮮水果的作用，而且綠色環(huán)保、對人體健康無害。在已經實現(xiàn)商業(yè)化的生防制劑中，酵母生防制劑占了很大的比例，并且對病害的控制效果十分顯著。但酵母生防制劑的商業(yè)化應用均在國外，國內尚未有酵母生防制劑商業(yè)化應用的成功案例，并且關于酵母生防制劑的相關研究報道較少，這說明在我國酵母制劑有非常大的研究空間和應用前景。

研究酵母生防制劑的技術要點在于要保證拮抗酵母的活性，尤其是在制備生防制劑的過程中，條件的變化會造成酵母大面積死亡。所以要優(yōu)化制備條件，提高酵母的存活率；并且還要保證酵母對某些病菌或者某一病菌有較好的控制效果；最后還要確保酵母制劑有較長的貨架期。雖然目前我國還沒有實現(xiàn)酵母生防制劑的商業(yè)化應用，但國家在大力提倡綠色、生態(tài)、環(huán)保的發(fā)展道路時，對生物防治以及生防制劑方面的研究給予了越來越多了關注和支持，有大批的科研工作者投入到了生防領域。隨著研究理論的不斷深入，科學技術的日趨完善，相信在不久的將來，生防制劑必將實現(xiàn)商業(yè)化，給人類創(chuàng)造更安全的食品、更美好的環(huán)境。

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Progress in Biocontrol Yeast Agents for Preventing and Treating Diseases of Fruits

LI Qiaofei, ZHANG Hongyin*, YANG Qiya, LIN Zhen, CHENG Yangyang, SUN Yiwen
(College of Food Science and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Fruits are vulnerable to pathogen infection and consequently decay during growth and storage, which causes huge economic losses. At present, the prevention and control fruit diseases and postharvest preservation are primarily achieved by the use of synthetic fungicides. Chemical fungicides are commonly used to control diseases of fruits and vegetables because of their high eff i ciency and convenience. However, due to the development of resistance to fungicides in fungal pathogens,which causes harmful effects on the environment and human health, it is necessary to develop safer alternative methods without causing any adverse effects on the environment or human health. Biological control using biological control agents(BCAs) especially antagonistic yeasts has emerged as a very promising way to substitute synthetic fungicides to mitigate postharvest diseases of fruits. This review outlines the advantages and shortcomings of biocontrol yeasts in the prevention and control of postharvest diseases of fruits and discusses the current status and future prospects of biological control agents.We hope that this review will provide valuable information for commercial production and application of biocontrol agents.

yeast; fruit; postharvest diseases; biological control; biological agents

10.7506/spkx1002-6630-201801044

Q939.95

A

1002-6630（2018）01-0291-06

李僑飛, 張紅印, 楊其亞, 等. 防治水果病害的生防酵母及生防制劑研究進展[J]. 食品科學, 2018, 39(1): 291-296.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801044. http://www.spkx.net.cn

LI Qiaofei, ZHANG Hongyin, YANG Qiya, et al. Progress in biocontrol yeast agents for preventing and treating diseases of fruits[J]. Food Science, 2018, 39(1): 291-296. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801044.http://www.spkx.net.cn

2016-10-21

國家自然科學基金面上項目（31271967）；江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（15）1048）；

鎮(zhèn)江市科技計劃項目（農業(yè)科技支撐）（NY2013020）

李僑飛（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：15862970889@163.com

*通信作者簡介：張紅印（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhanghongyin126@126.com