一氧化氮合酶途徑在精氨酸誘導番茄果實采后抗病性中的作用

季娜娜，閔德棟，李富軍，邵淑君，張新華*

（山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

一氧化氮合酶途徑在精氨酸誘導番茄果實采后抗病性中的作用

季娜娜，閔德棟，李富軍，邵淑君，張新華*

（山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

以綠熟期‘中蔬4號’番茄果實為實驗材料，研究了精氨酸（arginine，Arg）對番茄果實灰霉病發(fā)生的影響及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）途徑在其中的作用及機制。結果表明：0.0～10.0 mmol/L范圍內(nèi)，5.0 mmol/L的Arg對番茄果實灰霉病的發(fā)生率及病斑面積的擴展控制效果最佳。同時5.0 mmol/L Arg處理明顯提高了番茄果實NOS活力及NO含量，促進了酚類物質的積累，提高了番茄果實體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶等抗病相關酶的活力，誘導了病程相關蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）PR2a、PR2b、PR3a和PR3b的表達。而NOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸通過抑制NOS的活力和NO的水平，明顯削弱了Arg對番茄果實的這種誘導作用，因此Arg可能是通過調(diào)控NOS途徑誘導了番茄果實抵抗灰霉病的抗性。

番茄果實；一氧化氮合酶；精氨酸；抗病性

我國是果蔬生產(chǎn)大國，產(chǎn)量居世界第一位，但多數(shù)果蔬在采后貯運過程中易遭受病原體侵染，導致嚴重的經(jīng)濟損失。目前主要采用化學殺菌劑防治果蔬病害，藥劑殘留不僅對人體健康及環(huán)境造成危害，同時會導致果蔬致病菌產(chǎn)生抗藥性。因此，在尋找化學殺菌劑替代品的同時，誘導果蔬自身產(chǎn)生抗病性成為減輕采后病害的一條有效途徑[1]。

在人體及動物系統(tǒng)中的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸（arginine，Arg）不但廣泛地參與了機體的組織代謝與蛋白質代謝，在人體內(nèi)還具有重要的免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)功能[2]。因為Arg是植物體內(nèi)氮碳比最高的氨基酸，長期以來在植物系統(tǒng)中對Arg功能的研究主要集中于它的氮素貯藏功能[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Arg還具有其他氨基酸不具備的一些特殊生理功能，如外源Arg處理可以增強小麥植株對高溫脅迫的抵抗能力[4]；緩解重金屬對天仙子以及水分脅迫對番茄植株造成的氧化損傷[5-6]；提高鹽脅迫下菜豆種子的發(fā)芽率及鹽脅迫下幼苗中多胺（polyamine，PA）的含量[7]；促進阿月渾子幼苗體內(nèi)NO的產(chǎn)生，提高幼苗的抗冷能力[8]等。通過果實采后的相關研究發(fā)現(xiàn)，Arg處理可以抑制鮮切蘋果和萵苣褐變的發(fā)生[9]，前期實驗結果也證明，Arg代謝途徑的激活可以增強果實抗低溫脅迫的能力[10-11]。由此可見，在植物中Arg除了貯存氮素營養(yǎng)外，還廣泛參與植物的脅迫適應過程。PA是生物體中具有生物活性的一類低分子質量脂肪族含氮堿，廣泛參與了植物的生長發(fā)育及抗逆過程[12]。NO是一種重要的信號分子，在植物的生長發(fā)育、抗病防御反應、細胞程序性死亡和非生物脅迫反應等過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[13]。而Arg是生成NO和PA的前體，目前，已有大量研究證明Arg可以通過向PA轉化而參與植物的生理、病理等多種反應過程[14-15]。植物體內(nèi)的NO可以通過酶催化和非酶催化途徑合成，其中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是依賴于Arg的NO合成酶[16]，而目前關于Arg代謝的NOS途徑在植物，特別是果蔬采后抗性中的作用還有待深入研究。本實驗以番茄果實為材料，采用適宜濃度的外源Arg處理番茄果實，并結合NOS的特異性抑制劑N-硝基-L-Arg（Nω-nitro-L-arginine，L-NNA）阻斷NOS途徑，以探討NOS在Arg誘導番茄果實采后抗病性中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠熟期番茄果實‘中蔬4號’采自山東省淄博市張店區(qū)東孫村蔬菜大棚，選擇大小一致、果型端正、無病蟲害和機械傷的果實作為實驗原料，采摘當天運回實驗室。

熒光染料SYBR Green 日本東洋紡有限公司；NOS試劑盒、NO測試盒 南京建成生物工程研究所；寡聚核苷酸引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；Trizol試劑、M-MLV反轉錄酶、Oligo（dT）18、核糖核酸酶抑制劑、瓊脂糖 寶生物工程（大連）有限公司；脫鹽蝸牛酶、昆布多糖、福林酚試劑 美國Sigma-Aldrich公司；磷酸、乙醇、碳酸鈉、磷酸鈉、氯仿、異戊醇、異丙醇、丙酮、鹽酸、鄰苯二酚、檸檬酸、L-苯丙氨酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

H H-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；TC/96/G/H（b）A型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、FQD-96A型實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng) 杭州博日科技有限責任公司；3500型凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；GL-20-H型離心機 上海安亭科學儀器廠；DYY-8C型電泳儀北京市六一儀器廠；LDZX-50FBS型蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DW-HL 538型超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司；SK-1型快速混勻器 上海市上登實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

散去田間熱的番茄果實先在體積分數(shù)3%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min進行表面消毒，然后用清水沖洗自然晾干后進行處理。實驗共分為以下兩部分。

預實驗：將番茄果實隨機分為5 組，分別用濃度為0.0（對照）、0.5、1.0、5.0 mmol/L和10.0 mmol/L的Arg溶液進行真空滲透處理。真空滲透處理的方法為：將番茄果實放入盛有處理溶液（或蒸餾水）的容器中，再放入真空罐中，用真空泵抽真空，壓強達到-0.035 MPa后保持30 s，恢復到常壓后再浸泡2 min，取出番茄果實自然晾干。約24 h后對番茄果實進行病原菌損傷接種，接種后將番茄果實放入聚乙烯保鮮袋，于（25±1）℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，并于接菌后的第2、4、8天統(tǒng)計番茄果實病斑直徑和發(fā)病率。根據(jù)番茄果實的發(fā)病率及病斑面積，選擇最佳的Arg處理濃度，用于后續(xù)實驗。每個處理重復3 次，每個重復選取12 個番茄果實。

實驗處理：將番茄果實隨機分為3 組，分別用預實驗中最佳濃度的Arg溶液、0.2 mmol/L L-NNA溶液、0.2 mmol/L L-NNA+最佳濃度的Arg溶液及蒸餾水（對照）按上述方法對番茄果實進行真空滲透處理，處理結束后，番茄果實自然晾干，約24 h后每個處理取36個番茄果實（包含3 個重復）進行病原菌損傷接種，接種后將番茄果實放入保鮮袋，于（25±1）℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，并于接菌后的第2、4、8天統(tǒng)計果實病斑直徑和發(fā)病率。其余未接種的番茄果實于（25±1）℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，每隔1 d在每個處理組中隨機選取6個番茄果實，取番茄果實赤道部位的中果皮置于液氮中速凍，于-80 ℃低溫冰箱中保存，用于基因表達及各項生理指標的測定，每個處理重復3 次。

1.3.2 菌種與果實損傷接種

參照周曉婉等[17]的方法，略作修改。番茄灰霉病病原菌（Botrytis cinerea Pers.）分離于腐爛的番茄果實，經(jīng)鑒定后接種在馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基上，室溫條件下培養(yǎng)7 d，接種前用含有0.05% Tween-80的無菌水配制成孢子懸浮液，并借助血球計數(shù)板調(diào)整濃度為2×105CFU/mL。處理組與對照組均接種，接種前先用70%乙醇擦拭番茄果實表面進行消毒，自然晾干。再用滅菌鐵釘在果實赤道區(qū)域刺2 個孔（深4 mm、直徑2 mm）。待傷口處汁液晾干后，用微量移液器向每個孔注入10 μL孢子懸浮液。

1.3.3 病害發(fā)生率及病斑面積

番茄果實病害發(fā)生率的計算如式（1）。

病斑直徑利用游標卡尺進行十字交叉法測定[18]，每個病斑測量3 次，計算平均值作為其測量值，取各處理發(fā)病傷口病斑直徑的平均值分別作為其病斑直徑d（mm），病斑面積的計算如式（2）。

1.3.4 防御酶活力的測定

1.3.4.1 苯丙氨酸解氨酶活力的測定

參考Assis等[19]的方法測定番茄果實中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）的活力，并略有修改。稱取1.0 g樣品，用5 mL硼酸緩沖液（0.2 mol/L、pH 8.8，含10 g/L聚乙烯吡咯烷酮、2 mmol/L乙二胺四乙酸和5 mmol/L β-巰基乙醇）研磨，然后在4 ℃、12 000×g條件下離心15 min，取0.5 mL上清液，加入2 mL 0.1 mol/L pH 8.8硼酸緩沖液和1 mL L-苯丙氨酸溶液，37 ℃保溫1 h。290 nm波長處測定反應前后的吸光度，以每小時吸光度變化1為1 個酶活力單位（U）。實驗重復3 次。

1.3.4.2 幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活力測定

稱取1.0 g樣品加5 mL醋酸緩沖液（0.1mol/L、pH 5.2，含1 mmol/L乙二胺四乙酸和5 mmol/L β-巰基乙醇）研磨，然后在4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，上清液用于測定幾丁質酶（chitinase，CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）的活力。

CHI活力的測定參考Abeles等[20]的方法并略有修改。取0.5 mL上清液，加0.5 mL膠狀幾丁質于37 ℃保溫1 h，然后再加0.1 mL、質量分數(shù)3%蝸牛酶，37 ℃保溫1 h。保溫結束后，加0.3 mL四硼酸鉀溶液，沸水浴5 min，迅速冷卻。然后，再加2 mL對二甲氨基苯甲醛，37 ℃保溫10 min顯色，于585 nm波長處測定吸光度。實驗重復3 次。

GLU活力的測定參考Cao Shifeng等[21]的測定方法，略有改動，以每分鐘分解昆布多糖產(chǎn)生1 mg葡萄糖為一個酶活力單位（U）。實驗重復3 次。

1.3.4.3 多酚氧化酶活力的測定

多酚氧化酶（polyohenoloxidase，PPO）活力的測定參考周曉婉等[17]的方法，并略有修改。取1.0 g樣品加入5 mL、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液冰浴研磨，然后在4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，上清液為酶提取液。取2 mL磷酸鹽緩沖液和1 mL鄰苯二酚，與0.5 mL酶提取液混合，測定420 nm波長處吸光度的變化，以每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U），單位為U/g（以鮮質量計）。實驗重復3 次。

1.3.4.4 總酚含量的測定

采用福林-酚法[22]進行測定。稱取1.0 g果實樣品，加入2.5 mL、95%乙醇勻漿，4 ℃避光提取24 h后于4 ℃、10 000×g條件下離心10 min。取1 mL上清液，加入1 mL 95%乙醇、5 mL蒸餾水、0.5 mL體積分數(shù)50%福林-酚試劑，混勻靜置5 min后，加入1 mL、5 g/L碳酸鈉，室溫避光反應1 h，于685 nm波長處測吸光度，以沒食子酸作標準曲線計算總酚含量。

1.3.5 NOS活力和NO含量的測定

番茄果實體內(nèi)的NO含量及NOS活力分別采用NO和NOS試劑盒進行測定。NO含量單位為μmol/g（以鮮質量計），NOS活力單位為U/g（以鮮質量計），每毫升樣品每分鐘生成10-9mol NO為一個酶活力單位（U）。實驗重復3 次。

1.3.6 病程相關蛋白基因的實時熒光定量PCR分析

1.3.6.1 番茄果實總RNA的提取及其反轉錄

采用Trizol法[23]提取番茄果實總RNA，利用微量紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳對RNA的濃度及純度進行檢測，并參考寶生物工程（大連）有限公司的M-MLV反轉錄酶說明書合成cDNA，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.2 引物設計與合成

根據(jù)基因庫中公布的番茄病程相關蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）基因的序列，用Primer 5.0軟件設計引物，并參考Wang Fengde等[24]利用的引物序列，選擇最佳的引物序列，由生工生物工程（上海）公司合成。以Ubi3作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers used for quantitative real-time PCR

1.3.6.3 實時定量PCR

實時定量PCR以SYBR Green為熒光染料，采用25 μL體系：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA模板2 μL、SYBR premix Ex TaqTM（2×）反應液12.5 μL，用雙蒸水補至25 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。每個樣品重復3 次，目的基因相對表達量的分析以Ubi3基因作為內(nèi)參基因，利用2?ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件計算平均值、標準差并作圖，用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用鄧肯多重比較方法進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Arg處理對番茄果實采后發(fā)病率和病斑面積的影響

圖1 不同濃度Arg處理對番茄果實發(fā)病率（A）和病斑面積（B）的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of arginine on decay incidence (A)and lesion area (B) in tomato fruit

由圖1可知，適宜濃度的Arg處理可以有效地降低番茄果實的灰霉病發(fā)病情況。如圖1A所示，接種灰霉病原菌后第2天，經(jīng)不同濃度的Arg處理過的番茄果實均出現(xiàn)感病現(xiàn)象，但與對照組相比，0.5、1.0 mmol/L和5.0 mmol/L的Arg均不同程度地降低了番茄果實的發(fā)病率，而10.0 mmol/L處理組的番茄果實發(fā)病率為33.3%，略高于對照組（31.7%）；接種后第4天，各個處理組的番茄果實發(fā)病率急劇上升，對照組番茄果實的發(fā)病率達到83.3%，5 mmol/L處理組的發(fā)病率最低，與對照組相比降低了46.0%，而10.0 mmol/L Arg處理組的發(fā)病率高于對照組；接種后第8天，除了1.0 mmol/L和5.0 mmol/L Arg處理組，其他3 個處理組的番茄果實均全部發(fā)病，而1.0 mmol/L和5.0 mmol/L Arg處理組的發(fā)病率分別比對照組低18.3%和33.3%。

由圖1B可知，接種后第2天，各個處理組番茄果實的病斑面積均低于50 mm2，其中經(jīng)5.0 mmol/L Arg處理的番茄果實病斑面積只有7 mm2。隨著貯藏時間的延長，果實的病斑面積逐漸擴大，在接種后第4天與第8天時，1.0 mmol/L和5.0 mmol/L處理組的番茄果實均低于對照組，其中5.0 mmol/L Arg處理的番茄果實病斑面積最小。由上述兩個指標的結果可知，5.0 mmol/L Arg處理對番茄果實抗病性的誘導效果最好，因此，本研究用5.0 mmol/L Arg處理進行后續(xù)的實驗。

2.2 不同處理對番茄果實NOS活力和NO含量的影響

圖2 Arg與L-NNA處理對番茄果實中NO含量（A）和NOS活力（B）的影響Fig. 2 Effect of arginine and L-NNA treatments on NO content (A) and NOS activity (B) in tomato fruit

不同的處理對番茄果實中NO含量和NOS活力產(chǎn)生了不同的影響。由圖2A可以看出，在貯藏的前8 d內(nèi)，5 mmol/L Arg處理明顯降低了NO含量的下降幅度，8 d后Arg處理組的NO的含量與對照組比無明顯差異。L-NNA處理降低了番茄果實體內(nèi)NO的含量，也明顯抑制了Arg對番茄果實體內(nèi)NO的誘導效應。在貯藏的前8 d，Arg與L-NNA復合處理組的番茄果實體內(nèi)NO的含量明顯低于Arg處理組的果實。

如圖2B所示，與對照組相比，5 mmo/L Arg處理明顯提高了番茄果實體內(nèi)NOS的活力，處理后第2天NOS的活力達到最大，比同時間對照組高29.4%。而L-NNA處理不但抑制了番茄果實體內(nèi)NOS的活力，也明顯抑制了Arg對NOS活性的誘導作用，除了在貯藏的第12天外，Arg與L-NNA復合處理組的番茄果實體內(nèi)NOS的活力均明顯低于Arg處理組的果實。

2.3 不同處理對Arg誘導的番茄果實抗病性的影響

圖3 L-NNA與Arg處理對番茄果實發(fā)病率（A）、病斑面積（B）的影響Fig. 3 Effect of L-NNA and Arg treatments on decay incidence (A) and lesion area (B) in tomato fruit

由圖3可知，在貯藏期間，5 mmol/L Arg處理降低了番茄果實灰霉病的發(fā)病率，經(jīng)0.2 mmol/L L-NNA單獨處理的番茄果實發(fā)病率與病斑面積雖然與對照組番茄果實相比無明顯變化，但L-NNA與Arg復合處理抑制了Arg對番茄果實抗病性的誘導效應。如圖3A所示，Arg與L-NNA復合處理組番茄果實的發(fā)病率在接菌后的前4 d雖然低于對照組果實，但明顯高于Arg處理組的番茄果實，在接菌后的第4天和第8天，發(fā)病率分別比Arg處理組番茄果實高59.3%和50.0%，番茄果實發(fā)生病害的病斑面積也高于Arg處理組的番茄果實（圖3B）。

2.4 不同處理對番茄果實中總酚含量、PAL及PPO活力的影響

圖4 Arg與L-NNA處理對番茄果實中總酚含量（A）、PAL（B）及PPO（C）活力的影響Fig. 4 Effect of Arg and L-NNA treatments on total phenol content (A)and PAL (B) and PPO (C) activities in tomato fruit

如圖4A所示，對照組番茄果實的總酚含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，在處理后第6天達到峰值，隨后略有下降；Arg處理明顯提高了番茄果實貯藏中后期總酚的含量，在貯藏的第12天時，Arg處理組番茄果實的總酚含量達到最高，比同期對照組番茄果實總酚含量高33.1%。L-NNA單獨處理的番茄果實總酚含量變化趨勢與對照組果實相似，但復合處理明顯抑制了Arg對番茄果實體內(nèi)總酚含量的誘導，在貯藏的大多數(shù)時間內(nèi)，Arg與L-NNA復合處理組番茄果實的總酚含量均明顯低于Arg處理組的果實。

如圖4B所示，與對照組番茄果實相比，Arg處理明顯提高了整個貯藏過程中番茄果實體內(nèi)PAL的活力，在采后貯藏的第8天，對照組和Arg處理組番茄果實中PAL活力均達到最大，但對照組番茄果實的PAL活力比Arg處理組的低25.3%。而L-NNA單獨處理明顯降低了番茄果實體內(nèi)PAL的活力，復合處理也明顯抑制了Arg對番茄果實PAL的誘導效應，在貯藏第12 天時，L-NNA與Arg復合處理組番茄果實的PAL活力分別比同期對照組和Arg處理組低23.9%和34.9%。

如圖4C所示，對照組番茄果實的PPO活力呈波動變化的趨勢，且除了在貯藏末期外，整個貯藏過程中無明顯升高。而Arg使番茄果實中PPO活力急劇升高，在處理后第8天達到峰值，比同時期對照組番茄果實高79.53%，之后緩慢下降。L-NNA單獨處理組的番茄果實PPO活力與對照組相比無明顯差異，但L-NNA明顯抑制了貯藏中后期Arg對PPO活力的誘導效應，如L-NNA與Arg復合處理組果實的PPO活力在貯藏的第8天比Arg處理組的番茄果實低21.0%，在貯藏第10天時比Arg處理組的番茄果實低43.6%。

2.5 不同處理對番茄果實中病程相關蛋白基因表達、GLU及CHI活力的影響

對照組番茄果實中PR2a的相對表達量在貯藏過程中一直處于較低的水平（圖5A），PR2b的相對表達量在貯藏前期增加明顯，第4天時達到峰值，隨后下降（圖5B）。Arg處理明顯提高了整個貯藏過程中番茄果實體內(nèi)PR2a的相對表達量，在采后第2天，Arg處理番茄果實的PR2a的相對表達量急劇增加，比同期對照組番茄果實高1 764.1%。在貯藏的前4 d，Arg處理番茄果實PR2b的相對表達量低于對照組，但明顯提高了貯藏中后期PR2b的相對表達量，在第6天時，Arg處理組番茄果實PR2b的相對表達量達到峰值，比同期對照組高200.3%。Arg處理組的番茄果實中GLU活力明顯高于對照組，在貯藏的第12天時，Arg處理組番茄果實的GLU活力仍比對照組高18.8%（圖5C）。與對照組相比，L-NNA單獨處理對PR2a與PR2b的相對表達量及GLU活力均無明顯影響，但顯著抑制了Arg對三者的誘導作用。

Arg處理組番茄果實中PR3a和PR3b的相對表達量在貯藏過程中均明顯高于對照組。Arg處理組番茄果實PR3a的相對表達量在采后第8天達到峰值，比同期對照組高127%（圖5D）；對照組和Arg處理組番茄果實中PR3b的表達在采后第2天均達到最大值，但對照組番茄果實PR3b的相對表達量只有Arg處理組果實的50.6%（圖5E）。Arg處理組番茄果實的CHI活力在整個貯藏期間明顯高于對照組，在采后第8天達到最大值，比同期對照組高44.0%（圖5F）。L-NNA單獨處理降低了處理后第8天PR3a的相對表達量、貯藏第12天時PR3b的相對表達量及貯藏后期CHI活力，并明顯抑制了Arg對整個貯藏過程中番茄果實CHI活力、PR3a表達以及貯藏前期對PR3b表達的誘導效應。

圖5 Arg與L-NNA處理對番茄果實PR2a（A）、PR2b（B）、PR3a（D）、PR3b（E）相對表達量以及GLU（C）和CHI（F）活力的影響Fig. 5 Effect of Arg and L-NNA treatments on the expression of PR2a(A), PR2b (B), PR3a (D) and PR3b (E) and the activities of GLU (C) and CHI (F) in tomato fruit

3 討 論

在植物生長和發(fā)育過程中，Arg發(fā)揮著重要的作用。越來越多的研究表明，Arg不僅是植物中氮素轉化和貯存的媒介[3]，還是NO、PA等多種生物活性物質合成的前體[10]。因此，Arg在植物的抗逆性中可能也發(fā)揮了重要的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，0.5～5.0 mmol/L的Arg可以有效地緩解綠熟期番茄果實采后病害的發(fā)生，其中5.0 mmol/L的Arg對番茄果實灰霉病的發(fā)生抑制效果最為顯著；而0.1 mmol/L和10.0 mmol/L的Arg加劇了番茄果實病害的發(fā)生，這可能是因為Arg濃度過低不但沒有對番茄果實起到誘抗作用，而且可能為霉菌的生長提供了必要的營養(yǎng)物質來源；而Arg作為一種堿性氨基酸，過高的濃度可能會對番茄果實自身產(chǎn)生傷害。

在植物中Arg不僅是蛋白質合成的重要原料，同時也是PA、NO、脯氨酸等重要物質的合成前體。而PA和NO都是植物中重要的信使分子，參與包括生長發(fā)育、抗逆性等在內(nèi)的幾乎所有的生理生化過程。目前，在植物的植株及果實組織中，已有大量研究證明Arg可以代謝為PA而參與植物的生理、病理等多種反應過程[12-13]。在動物系統(tǒng)中，已有大量的研究報道NOS催化產(chǎn)生NO需依賴Arg，Arg也因此廣泛參與各種生理與病理過程[25-26]；而植物中雖然檢測到有依賴Arg的NO產(chǎn)生[10,15]，但NOS在植物逆境脅迫中的作用亟待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的外源Arg處理提高了番茄果實體內(nèi)NOS的活力以及NO的含量，而L-NNA明顯抑制了Arg代謝的NOS途徑，同時也明顯削弱了外源Arg對果實抗病性的誘導作用。L-NNA是NOS的抑制劑，在植物中廣泛用于NOS功能的研究[27-28]。本實驗結果表明，外源Arg可通過促進果實內(nèi)源Arg代謝的NOS途徑來增強果實抵抗灰霉病的能力。

酚類物質是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，有很強的清除自由基和抗氧化的能力[29]。PAL是植物次生物質生成合成途徑——苯丙烷代謝的關鍵酶，與植物的抗逆境脅迫和抗病性密切相關。PPO能催化酚類物質氧化形成比病原菌毒性更強的醌類物質，因此在植物體防御機制中也發(fā)揮了重要的作用[30]。周曉婉等[17]發(fā)現(xiàn)，1-甲基環(huán)丙烯提高蘋果果實的抗病性與果實體內(nèi)PAL、PPO活力的提高及酚類物質含量的增加有關；β-氨基丁酸誘導PAL活力及總酚含量的增加有助于提高葡萄果實對灰霉病的抗性[31]。本研究中，Arg處理能夠有效提高PAL和PPO的活力，同時提高了貯藏中后期果實中酚類物質的積累，并使總酚含量均保持在相對較高水平，從而增強了果實對灰霉病的抗性；但加入L-NNA后，Arg對果實的這種誘導效應被顯著抑制。L-NNA可抑制NOS的活力，降低NO的含量。有研究表明，外源NO處理可明顯提高油桃果實PAL與PPO活力，促進酚類物質的積累[32]；提高番茄果實PAL活力[33]；提高蘑菇總酚物質的積累及PAL等抗病酶的酶活力[34]。因此，推測Arg代謝的NOS途徑在Arg對果實總酚含量、PAL與PPO活力的誘導中可能發(fā)揮了重要作用。

果實PRs是果實受生物或非生物脅迫誘導產(chǎn)生并積累的一類蛋白質總稱，是果實防衛(wèi)體系的重要組成部分[35]。大多數(shù)的PRs有抗真菌或者細菌的活性，許多PRs在抗病性中的作用也已經(jīng)被證實[36]。PR2在病理相關條件可誘導細胞間隙或細胞內(nèi)產(chǎn)生GLU[37]，GLU能夠水解存在于真菌和卵菌細胞壁的葡聚糖，具有抗真菌的作用。PR3編碼的CHI（PR3a編碼細胞外CHI；PR3b編碼細胞內(nèi)CHI）能夠水解真菌細胞壁中的幾丁質，也具有抗真菌的功能。Ding等[37]研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯和水楊酸甲酯誘導的番茄果實PR2和PR3 mRNA的積累，有助于增強果實對低溫及病原菌的抵抗能力。Wang Fengde等[24]也發(fā)現(xiàn)牛蒡低聚果糖能增加PR2a、PR2b、PR3a及PR3b表達水平，這有助于增強果實抵抗灰霉病原菌的能力，減輕果實的發(fā)病率。本研究表明，外源適宜濃度的Arg處理可以有效誘導番茄果實中PR2a、PR2b、PR3a以及PR3b的表達，并顯著提高GLU和CHI的活力；而L-NNA處理明顯降低了Arg對番茄果實PR基因的表達、GLU和CHI活力的誘導。PRs基因表達的增加是植物系統(tǒng)性獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）的重要標志[24]，而NO在誘導植物建立SAR的信號途徑中發(fā)揮了重要作用[38]，Song Fengming等[39]的研究也發(fā)現(xiàn)NOS抑制劑處理可使水楊酸誘導的煙草SAR消失。因此，推測外源Arg可通過NOS途徑促進果實體內(nèi)NO的產(chǎn)生，誘導番茄果實產(chǎn)生SAR，增強果實的抗病能力。

4 結 論

5.0 mmol/L Arg處理顯著降低了接種灰霉菌番茄果實的發(fā)病率和病斑面積，提高了番茄果實體內(nèi)PPO、PAL、GLU和CHI等抗病相關酶的活力，促進了酚類物質的積累；誘導了病程相關蛋白PR2a、PR2b、PR3a和PR3b基因的表達，從而提高番茄果實對灰霉病的抗性。而NOS抑制劑與Arg復合處理明顯削弱了Arg對番茄果實的這種誘導作用，因此，NOS途徑在Arg誘導番茄果實抵抗灰霉病的過程中發(fā)揮了重要作用。

[1] ZHANG X H, SHEN L, LI F J, et al. Hot air treatment-induced arginine catabolism is associated with elevated polyamines and proline levels and alleviates chilling injury in postharvest tomato fruit[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3245-3251. DOI:10.1002/jsfa.6166.

[2] TSIKAS D, WU G Y. Homoarginine, arginine, and relatives: analysis,metabolism, transport, physiology, and pathology[J]. Amino Acids,2015, 47(9): 1697-1702. DOI:10.1007/s00726-015-2055-5.

[3] MICALLEF B J, SHELP B J. Arginine metabolism in developing soybean cotyledons 1. Relationship to nitrogen nutrition[J]. Plant Physiol. 1989, 90(2): 624-630. DOI:10.1104/pp.90.2.624.

[4] KHALIL S I, EL-BASSIOUNY H M S, HASSANEIN R A, et al.Antioxidant defense system in heat shocked wheat plants previously treated with arginine or putrescine[J]. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2009, 3(3): 1517-1526.

[5] NASIBI F, HEIDARI T, ASRAR Z, et al. Effect of arginine pretreatment on nickel accumulation and alleviation of the oxidative stress in Hyoscyamus niger[J]. Journal of Soil Science and Plant Nutrition,2013, 13(3): 680-689. DOI:10.4067/S0718-95162013005000054.

[6] NASIBI F, YAGHOOBI M M, KALANTARI K M. Effect of exogenous arginine on alleviation of oxidative damage in tomato plant underwater stress[J]. Journal of Plant Interactions, 2011, 6(4): 291-296. DOI:10.1080/17429145.2010.539708.

[7] ZEID I M. Effect of arginine and urea on polyamines content and growth of bean under salinity stress[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2009, 31(1): 65-70. DOI:10.1007/s11738-008-0201-3.

[8] BARAND A, NASIBI F, MANOUCHEHRIKALANTARI K. The effect of arginine pretreatment in the increase of cold tolerance in Pistacia vera L. in vitro[J]. Russian Agricultural Sciences, 2015,41(5): 340-346. DOI:10.3103/S1068367415050043.

[9] WILLS R B H, LI Y X. Use of arginine to inhibit browning on fresh cut apple and lettuce[J]. Postharvest Biology and Technology, 2016,113: 66-68. DOI:10.1016/j.postharvbio.2015.11.006.

[10] ZHANG X H, SHEN L, LI F J, et al. Methyl salicylate-induced arginine catabolism is associated with up-regulation of polyamine and nitric oxide levels and improves chilling tolerance in cherry tomato fruit[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(17):9351-9357. DOI:10.1021/jf201812r.

[11] ZHANG X H, SHEN L, LI F J, et al. Amelioration of chilling stress by arginine in tomato fruit: changes in endogenous arginine catabolism[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013, 76: 106-111. DOI:10.1016/j.postharvbio.2012.09.012.

[12] WALTERS D. Resistance to plant pathogens: possible roles for free polyamines and polyamine catabolism[J]. New Phytologist, 2003,159(1): 109-115. DOI:10.1046/j.1469-8137.2003.00802.x.

[13] SIDDIQUI M H, AL-WHAIBI M H, BASALAH M O. Role of nitric oxide in tolerance of plants to abiotic stress[J]. Protoplasma, 2010,248(3): 447-455. DOI:10.1007/s00709-010-0206-9.

[14] BECKMANN N, SCHAFFERER L, SCHRETTL M, et al.Characterization of the link between ornithine, arginine, polyamine and siderophore metabolism in Aspergillus fumigatus[J]. PLoS ONE,2013, 8(6): e67426. DOI:10.1093/jxb/erv138.

[15] MAJUMDAR R, BARCHI B, TURLAPATI S A, et al. Glutamate,ornithine, arginine, proline, and polyamine metabolic interactions: the pathway is regulated at the post-transcriptional level[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 78-94. DOI:10.3389/fpls.2016.00078.

[16] 楊洪強, 高華君. 植物精氨酸及其代謝產(chǎn)物的生理功能[J]. 植物生理與分子生物學學報, 2007, 33(1): 1-8.

[17] 周曉婉, 唐永萍, 石亞莉, 等. 1-MCP對低溫貯藏蘋果灰霉病抗性的誘導作用[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 254-260. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612046.

[18] 袁仲玉, 周會玲, 田蓉, 等. 蘆薈粗提物對蘋果采后灰霉病的防治效果與機理[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報, 2014, 30(4): 255-263. DOI:10.3969/j.issn.1002-6819.2014.04.031.

[19] ASSIS J S, MALDONADO R, MU?OZ T, et al. Effect of high carbon dioxide concentration on PAL activity and phenolic contents in ripening cherimoya fruit[J]. Postharvest Biology and Technology,2001, 23(1): 33-39. DOI:10.1016/S0925-5214(01)00100-4.

[20] ABELES F B, BOSSHART R P, FORRENCE L E, et al. Preparation and purif i cation of glucanase and chitinase from bean leaves[J]. Plant Physiology, 1971, 47(1): 129-134. DOI:10.1104/pp.47.1.129.

[21] CAO Shifeng, ZHENG Yonghua. Effect of 1-methylcyclopropene on anthracnose rot caused by Colletotrichum acutatum and disease resistance in loquat fruit[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(13): 2289-2294. DOI:10.1002/jsfa.4084.

[22] WANG K T, JIN P, CAO S F, et al. Methyl jasmonate reduces decay and enhances antioxidant capacity in Chinese bayberries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(13): 5809-5815.DOI:10.1021/jf900914a.

[23] ZHANG X H, SHEN L, LI F J, et al. Up-regulating arginase contributes to amelioration of chilling stress and the antioxidant system in cherry tomato fruits[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(13): 2195-2202. DOI:10.1002/jsfa.4070.

[24] WANG Fengde, FENG Guihua, CHEN Kaoshan. Defense responses of harvested tomato fruit to burdock fructooligosaccharide, a novel potential elicitor[J]. Postharvest Biology and Technology, 2009, 52(1):110-116. DOI:10.1016/j.postharvbio.2008.09.002.

[25] VANELLA L, DI GIACOMO C, ACQUAVIVA R, et al. The DDAH/NOS pathway in human prostatic cancer cell lines: antiangiogenic effect of L-NAME[J]. International Journal of Oncology, 2011, 39(5):1303-1310. DOI:10.3892/ijo.2011.1107.

[26] LIN K Y, ITO A, ASAGAMI T, et al. Impaired nitric oxide synthase pathway in diabetes mellitus role of asymmetric dimethylarginine and dimethylarginine dimethylaminohydrolase[J]. Circulation, 2002,106(8): 987-992. DOI:10.1161/01.CIR.0000027109.14149.67.

[27] HICHRI I, BOSCARI A, CASTELLA C, et al. Nitric oxide: a multifaceted regulator of the nitrogen-fixing symbiosis[J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(10): 2877-2887. DOI:10.1093/jxb/erv051.

[28] CHANG K, GUO T T, LI P F, et al. Novel fluorescence arginine analogue as a sensor for direct identification and imaging of nitric oxide synthase-like enzymes in plants[J]. Scientif i c Reports, 2016, 6:32630-32636. DOI:10.1038/srep32630.

[29] HATANO T, MIYATAKE H, NATSUME M, et al. Proanthocyanidin glycosides and related polyphenols from cacao liquor and their antioxidant effects[J]. Phytochemistry, 2002, 59(7): 749-758.DOI:10.1016/S0031-9422(02)00051-1.

[30] CONSTABEL C P, YIP L, PATTON J J, et al. Polyphenol oxidase from hybrid poplar. cloning and expression in response to wounding and herbivory[J]. Plant Physiology, 2000, 124(1): 285-296.DOI:10.1104/pp.124.1.285.

[31] 龍清紅, 高梵, 李曉安, 等. BABA處理對葡萄果實采后灰霉病的影響及機理[J]. 食品科學, 2016, 37(14): 213-218. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614039.

[32] 李永才, 陳松江, 畢陽, 等. 采后一氧化氮處理對油桃抗軟腐病的誘導[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(10): 340-342; 357. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.10.019.

[33] 劉零怡, 于萌萌, 鄭楊, 等. 采后一氧化氮處理調(diào)控番茄果實茉莉酸類物質合成并提高灰霉病抗性[J]. 食品科學, 2010, 31(22): 457-461.

[34] JIANG T J, ZHENG X L, LI J R, et al. Integrated application of nitric oxide and modif i ed atmosphere packaging to improve quality retention of button mushroom (Agaricus bisporus)[J]. Food Chemistry, 2011,126(4): 1693-1699. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.12.060.

[35] THIBAUD M C, GINESTE S, NUSSAUME L, et al. Sucrose increases pathogenesis-related PR-2 gene expression in Arabidopsis thaliana through an SA-dependent but NPR1-independent signaling pathway[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2004, 42(1): 81-88.DOI:10.1016/j.plaphy.2003.10.012.

[36] VAN LOON L C, PIERPOINT W S, BOLLER T, et al. Recommandations for naming plant pathogenesis-related proteins[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994(12): 245-264. DOI:10.1007/BF02668748.

[37] DING C K, WANG C Y, GROSS K C, et al. Jasmonate and salicylate induce the expression of pathogenesis-related-protein genes and increase resistance to chilling injury in tomato fruit[J]. Planta, 2002,214(6): 895-901. DOI:10.1007/s00425-001-0698-9.

[38] ROMERO-PUERTAS M C, PERAZZOLLI M, ZAGO E D, et al.Nitric oxide signalling functions in plant-pathogen interactions[J].Cellular Microbiology, 2004, 6(9): 795-803. DOI:10.1111/j.1462-5822.2004.00428.x.

[39] SONG Fengming, GOODMAN R M. Activity of nitric oxide is dependent on, but is partially required for function of, salicylic acid in the signaling pathway in tobacco systemic acquired resistance[J].Molecular Plant-Microbe Interactions, 2001, 14(12): 1458-1462.DOI:10.1094/MPMI.2001.14.12.1458.

Role of Nitric Oxide Synthase Pathway in Arginine-Induced Disease Resistance in Postharvest Tomato Fruit

JI Nana, MIN Dedong, LI Fujun, SHAO Shujun, ZHANG Xinhua*
(School of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China)

This study aimed to investigate the effect of arginine treatment on the occurrence of postharvest gray mold in‘Zhongshu No. 4’ tomato fruit and the role and mechanism of nitric oxide synthase (NOS) pathway in arginine-induced disease resistance during storage at (25 ± 1) ℃. The results indicated that 5.0 mmol/L arginine was the most effective treatment in reducing the incidence of gray mold and lesion area in tomato fruit in the concentration range of 0.0—10.0 mmol/L.Moreover, 5.0 mmol/L arginine treatment increased NOS activity and nitric oxide (NO) content. Total phenol content and the activities of phenylalanine ammonia-lyase, polyphenol oxidase, chitinase and β-1,3-glucanase were also enhanced remarkably. Besides, the expression of pathogenesis-related genes (PR2a, PR2b, PR3a and PR3b) were induced signif i cantly.However, these effects were partially counteracted by Nω-nitro-L-arginine, an inhibitor of NOS. Our results indicate that arginine-induced resistance to gray mold in postharvest tomato fruit may be due to promoting the NOS pathway.

tomato fruit; nitric oxide synthase; arginine; disease resistance

10.7506/spkx1002-6630-201801038

TS262.6

A

1002-6630（2018）01-0250-08

季娜娜, 閔德棟, 李富軍, 等. 一氧化氮合酶途徑在精氨酸誘導番茄果實采后抗病性中的作用[J]. 食品科學, 2018, 39(1):

250-257. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801038. http://www.spkx.net.cn

JI Nana, MIN Dedong, LI Fujun, et al. Role of nitric oxide synthase pathway in arginine-induced disease resistance in postharvest tomato fruit[J]. Food Science, 2018, 39(1): 250-257. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801038. http://www.spkx.net.cn

2016-09-28

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201432；31101587）

季娜娜（1992—），女，碩士研究生，研究方向為果蔬采后生理與貯藏保鮮。E-mail：jinana_sdut@126.com

*通信作者簡介：張新華（1976—），女，副教授，博士，研究方向為果蔬采后生理與貯藏保鮮。E-mail：zxh@sdut.edu.cn