表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過NF-κB通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化

吳 瓊，王樂鋒，張妍淞，湯小芳，張賢益，李 露，舒 瑤，黃 成，廖金珠，王富龍，李文娟,*

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過NF-κB通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化

吳 瓊1，王樂鋒1，張妍淞2，湯小芳2，張賢益2，李 露2，舒 瑤2，黃 成2，廖金珠2，王富龍2，李文娟2,*

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

目的：研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）的抗炎作用及其對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。方法：原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行不同的處理，將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，1 μg/mL）組、EGCG（25 μmol/L）組和EGCG+LPS（25 μmol/L+1 μg/mL）組；流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬活性、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量和細(xì)胞凋亡情況，噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；Griess法測(cè)定NO的含量；酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）含量，Western blot檢測(cè)Toll-樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）p65蛋白表達(dá)量。結(jié)果：EGCG和/或LPS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖和凋亡無顯著影響；與LPS組相比，EGCG可以極顯著抑制LPS刺激腹腔巨噬細(xì)胞中ROS、NO、TNF-α、IL-1β增加（P＜0.01），提示EGCG可抑制巨噬細(xì)胞向M1表型極化，具有抗炎作用；與LPS組相比，EGCG+LPS組中巨噬細(xì)胞TLR4和細(xì)胞核蛋白中NF-κB p65表達(dá)量明顯下降（P＜0.01）。結(jié)論：EGCG對(duì)LPS致炎的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，其作用機(jī)制可能與其阻斷TLR4受體介導(dǎo)的NF-κB通路活化，抑制巨噬細(xì)胞向M1表型極化有關(guān)。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；抗炎作用；細(xì)胞表型；NF-κB通路；巨噬細(xì)胞極化

炎癥是機(jī)體重要的免疫學(xué)反應(yīng)：一方面炎癥反應(yīng)是宿主防御的主要過程，是人體健康必不可少的生理反應(yīng)；另一方面炎癥反應(yīng)持久、異?？梢鸲喾N疾病，包括促進(jìn)腫瘤的形成[1-3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）是從茶葉中提取的多酚類物質(zhì)，是茶葉的主要活性成分，實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGCG能緩解巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，具有抗炎作用[4-5]。Seong等[6]通過一次性大劑量注射脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）建立小鼠炎癥模型，證實(shí)EGCG可通過下調(diào)Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）發(fā)揮抗炎作用。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中起著舉足輕重的作用。在炎癥反應(yīng)的進(jìn)程中，巨噬細(xì)胞極化表現(xiàn)出不同的細(xì)胞表型，從而發(fā)揮不同的免疫功能。根據(jù)細(xì)胞極化方式的不同，可將巨噬細(xì)胞表型分為M1型和M2型[7-8]。生理?xiàng)l件下，巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)是連續(xù)的，M1和M2型巨噬細(xì)胞是這一系列連續(xù)狀態(tài)的兩個(gè)極端，分別發(fā)揮不同的促炎和抗炎作用[9-10]。近年來，巨噬細(xì)胞極化在抗炎作用研究中越來越受到關(guān)注，但在EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞極化調(diào)控的研究頗少，尤其在信號(hào)通路機(jī)制研究中鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬在前期的研究基礎(chǔ)上，原代培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞，通過LPS刺激巨噬細(xì)胞模擬炎癥模型，檢測(cè)EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性功能（M1型炎癥相關(guān)參數(shù)，包括小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、NO、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量和吞噬活性）及細(xì)胞表面受體TLR4和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路的影響，研究EGCG的抗炎作用，繼而確定EGCG對(duì)的巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用，為研究EGCG抗炎分子機(jī)制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

ALB/c小鼠雌雄不限（生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2013-0004），7～8 周齡，體質(zhì)量（22±2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)科部（使用許可證：SCXK（贛）2015-0001）。

DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Thermo公司；EGCG、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、胎牛血清、LPS 美國(guó)Sigma公司；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國(guó)Molecular Probes公司；細(xì)胞凋亡試劑盒 美國(guó)BD公司；線粒體琥珀酸脫氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑、NO試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞因子（TNF-α和IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司；兔單克隆NF-κB抗體 美國(guó)Cell Signaling公司；小鼠單克隆TLR4抗體 美國(guó)Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash E33全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Electron公司；TDL-5-A大容量低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀美國(guó)Becton Dickinson公司；MS 3 basic旋渦混勻器德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

[11]原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。頸椎脫臼處死小鼠，碘伏浸泡5 min，醫(yī)用酒精脫碘3 min，置于彎盤中，腹腔注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），腹部輕揉2 min，收集腹腔液置于離心管中，1 000×g離心8 min，收集細(xì)胞沉淀并重懸，臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞大于95%，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，分別接種于96 孔培養(yǎng)板和6 孔培養(yǎng)板中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，差速貼壁去除未貼壁細(xì)胞，最后收集得到純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥模型的建立與分組

將原代培養(yǎng)腹腔巨細(xì)胞隨機(jī)分為4 組，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組：腹腔巨噬細(xì)胞中給予相同體積的培養(yǎng)基；LPS組：腹腔巨噬細(xì)胞中給予1 μg/mL LPS刺激24 h；EGCG+LPS組：結(jié)合文獻(xiàn)[12-13]，EGCG劑量選擇25 μmol/L預(yù)處理腹腔巨噬細(xì)胞24 h后，加入1 μg/mL LPS刺激24 h，全程給予EGCG；EGCG組：25 μmol/L EGCG預(yù)處理腹腔巨噬細(xì)胞48 h。

1.3.3 細(xì)胞增殖情況的測(cè)定

將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（1.5×104個(gè)/孔）180 μL接種于96 孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕傾凈96 孔培養(yǎng)板中微孔內(nèi)的液體，然后每孔加入150 μL二甲基亞砜，終止反應(yīng)，用振蕩儀振蕩10 min后，待MTT的紫色還原產(chǎn)物完全溶解。最后應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），細(xì)胞增殖情況以A表示，A越大代表其增殖越多。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞懸液（約2×106個(gè)/mL）于3 000 r/min離心10 min，PBS洗2 次，500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入Annexin-V和PI各5 μL，避光反應(yīng)5 min后，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞染色情況（一般不超過1 h），早期凋亡細(xì)胞為Annexin（+）／P1（-），壞死或凋亡晚期的繼發(fā)壞死細(xì)胞為Annexin（+）／P1（+），正常活細(xì)胞為Annexin（-）／P（-）。同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為裸細(xì)胞，用于設(shè)定流式檢測(cè)條件。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量

收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞懸液（約2×106個(gè)/mL）于3 000 r/min離心10 min，PBS洗2次，將配好的DCFHDA溶液（20 μmol/L）0.5 mL重懸細(xì)胞，37 ℃孵育20 min，3 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗2 次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，以DCF的熒光強(qiáng)度來表示細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表明ROS含量越高。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬活性

收集腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞懸液（約2×106個(gè)/mL）于3 000 r/min離心10 min，PBS洗2 次，加入熒光標(biāo)記FITC-Dextran（5 mg/mL）2 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。3 000 r/min離心3 min，PBS洗滌細(xì)胞2 次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)FITC-Dextran的熒光強(qiáng)度，以此反映細(xì)胞的吞噬功能，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表明其吞噬活性越高。

1.3.7 NO含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)Griess法測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣本中NO含量，具體操作方法參照NO試劑盒說明書。

1.3.8 細(xì)胞因子含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書，采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子（TNF-α和IL-1β）含量。最后采用多功能酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A292nm為縱坐標(biāo)）計(jì)算出實(shí)驗(yàn)樣本中細(xì)胞因子含量。

1.3.9 TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)量的測(cè)定

將2.5 mL小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接種到6 孔培養(yǎng)板中（2×106個(gè)/孔）。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PBS沖洗兩遍，加入細(xì)胞裂解液，采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白。收集細(xì)胞蛋白，BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，等量蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）（50 V電壓，30 min；100 V電壓，55 min），半干轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉2 h、一抗過夜、HRP標(biāo)記二抗2 h。ECL化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng)，應(yīng)用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 ±s表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響

表1 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of EGCG and/or LPS on the proliferation of mouse peritoneal macrophages

如表1顯示，巨噬細(xì)胞經(jīng)EGCG預(yù)處理后，EGCG組與對(duì)照組相比無顯著差異。與對(duì)照組相比，LPS組和EGCG+LPS組中腹腔巨噬細(xì)胞有輕微的增殖，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均無顯著性差異（P＞0.05）。這些結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)中EGCG（25 μmol/L）、LPS（1 μg/mL）、EGCG+LPS對(duì)巨噬細(xì)胞增殖無明顯影響。

2.2 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡率的影響

圖1 EGCG和/或LPS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的影響Fig. 1 Effect of EGCG and/or LPS on apoptosis in mouse peritoneal macrophages

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的正常生理現(xiàn)象，巨噬細(xì)胞凋亡具有自身的特點(diǎn)，既可調(diào)控自身的細(xì)胞功能，又可介導(dǎo)非己細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[14]。由圖1可知，在EGCG、LPS、EGCG+LPS給予巨噬細(xì)胞處理后，實(shí)驗(yàn)組中腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比，均處于一個(gè)較低的水平，各組之間無顯著性差異（P＞0.05）。說明本實(shí)驗(yàn)中EGCG和/或LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的正常凋亡無明顯影響。

2.3 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的影響

巨噬細(xì)胞通過熒光探針FITC-Dextran標(biāo)記后，上樣于流式細(xì)胞儀，檢測(cè)Dextran的熒光強(qiáng)度。Dextran的熒光強(qiáng)度可反應(yīng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，巨噬細(xì)胞吞噬活性越高。吞噬結(jié)果如圖2所示，在LPS（1 μg/mL）的作用下，與對(duì)照組相比，腹腔巨噬細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度從40.58±8.53升高到215.80±38.28，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能極顯著增加（P＜0.01）。在EGCG（25 μmol/L）預(yù)處理后加入LPS（1 μg/mL）刺激，與LPS（1 μg/mL）組相比，腹腔巨噬細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度從215.80±38.28下降到90.16±13.32，差異極顯著（P＜0.01），即EGCG能顯著抑制LPS（1 μg/mL）激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

圖2 EGCG對(duì)LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的影響Fig. 2 Effect of EGCG on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages

2.4 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ROS含量的影響

圖3 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ROS含量的影響Fig. 3 Effect of EGCG on the generation of ROS in mouse peritoneal macrophages

由圖3可知，1 μg/mL LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能使細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著上升，與對(duì)照組相比有明顯差異（P＜0.01）。對(duì)照組熒光強(qiáng)度為8.79±1.41，LPS（1 μg/mL）的刺激后明顯升高到106.98±17.27。在EGCG（25 μmol/L）預(yù)處理后加入LPS（1 μg/mL）刺激，與LPS組相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯降低（P＜0.01），DCF熒光強(qiáng)度為10.68±2.59。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG能極顯著降低LPS刺激活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS。

2.5 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NO、細(xì)胞因子含量的影響

表2 EGCG對(duì)LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NO 、IL-1β和TNF-α含量的影響Table 2 Effect of EGCG on the production of NO, IL-1βand TNF-α in mouse peritoneal macrophages

由表2可以看出，對(duì)照組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放的NO含量很少；LPS（1 μg/mL）刺激24 h能促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO，與對(duì)照組相比具有極顯著差異（P＜0.01）；若先用EGCG（25 μmol/L）預(yù)處理24 h，再加入LPS刺激24 h，則NO的產(chǎn)生量受到明顯抑制，與LPS組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。

實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞中釋放細(xì)胞因子TNF-α、1L-1β的量，結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組相比，在LPS 組中，TNF-α由（513.53±68.97）ng/mL升高到（3 150.13±319.82）ng/mL，有極顯著差異（P＜0.01）；IL-1β含量由（38.62±14.48）pg/mL升高到（292.77±58.14）pg/mL，有極顯著差異（P＜0.01），故LPS（1 μg/mL）能顯著地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、1L-1β。在EGCG（25 μmol/L）預(yù)處理后加入LPS（1 μg/mL）刺激，與LPS組相比，TNF-α由（3 150.13±319.82）ng/mL下降到（1 874.93±122.75） ng/mL，有極顯著差異（P＜0.01）；IL-1β由（292.77±58.14）pg/mL下降到（225.58±34.07）pg/mL，有顯著差異（P＜0.01）。故EGCG能抑制經(jīng)LPS激活巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β的水平。

2.6 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TLR4表達(dá)的影響

免疫的發(fā)生及其調(diào)控涉及復(fù)雜的免疫識(shí)別機(jī)制，依賴于種系編碼的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）。TLR4是巨噬細(xì)胞表面重要PRRs，可識(shí)別并結(jié)合EGCG，觸發(fā)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控免疫基因表達(dá)，執(zhí)行免疫調(diào)控功能。此外，LPS是巨噬細(xì)胞TLR4中的主要配體，可與TLR4結(jié)合[15-16]。由圖4的Western blot結(jié)果可知，在腹腔巨噬細(xì)胞未接受任何處理的對(duì)照組中，TLR4蛋白表達(dá)在一個(gè)較低的水平；與對(duì)照組相比，LPS組中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.01）。與LPS組相比，EGCG+LPS組中TLR4的蛋白表達(dá)極顯著下降（P＜0.01）。與此同時(shí)EGCG單獨(dú)處理巨噬細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)無明顯變化。這些結(jié)果表明EGCG的抗炎作用與細(xì)胞表面受體對(duì)TLR4的調(diào)節(jié)有關(guān)。

圖4 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of EGCG on the expression of TLR4 in LPS-stimulated macrophages

2.7 EGCG對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NF-κB p65表達(dá)的影響

圖5 EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of EGCG on the expression of NF-κB p65 in LPS-stimulated macrophages

NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在巨噬細(xì)胞的炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)作用。LPS與TLR4結(jié)合后，激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)炎癥因子的釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[17]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，LPS組中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞核蛋白中NF-κB p65表達(dá)量顯著增加；LPS處理巨噬細(xì)胞前，加入EGCG預(yù)處理24 h，極顯著降低LPS介導(dǎo)的NF-κB p65蛋白表達(dá)的上調(diào)（P＜0.01)。與此同時(shí)EGCG單獨(dú)處理巨噬細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，巨噬細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的表達(dá)無顯著變化。這說明EGCG抑制LPS介導(dǎo)的炎癥，與可通過抑制NF-κB通路的激活有關(guān)。

3 討 論

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有很強(qiáng)的可塑性，在炎癥反應(yīng)和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。M1型巨噬細(xì)胞主要通過分泌TNF-α、1L-1β和NO等，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[18-19]。LPS炎癥模型是最常見的炎癥模型，其誘炎機(jī)理為L(zhǎng)PS與細(xì)胞表面的CD14結(jié)合，然后再結(jié)合TLR4復(fù)合物，激活腫瘤壞死受體相關(guān)因子6，進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶1，然后使NF-κB抑制性蛋白（NF-kappa B inhibitor，IκB）激酶磷酸化，導(dǎo)致IκB降解，使NF-κB信號(hào)通路激活，促進(jìn)炎癥因子釋放，同時(shí)啟動(dòng)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶轉(zhuǎn)錄，釋放NO，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化[20-21]。本實(shí)驗(yàn)通過原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，應(yīng)用LPS刺激巨噬細(xì)胞建立炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通過檢測(cè)不同組別中巨噬細(xì)胞的NO、TNF-α、IL-1β含量及NF-κB p65蛋白表達(dá)量來說明EGCG對(duì)LPS致炎的巨噬細(xì)胞的抗炎作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS組中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、1L-1β和NO水平增加，NF-κB p65蛋白表達(dá)量增加，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與LPS組相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)EGCG預(yù)處理后，TNF-α、1L-1β、NO的水平顯著下降。表明EGCG可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化。

研究證實(shí)，當(dāng)巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞被激活后，細(xì)胞內(nèi)的各種氧化酶的表達(dá)水平增加，釋放大量的ROS來清除壞死的細(xì)胞。持久且異常的炎癥過程中ROS可以在細(xì)胞間充當(dāng)?shù)诙攀梗軌蛲ㄟ^趨化因子的表達(dá)，增加炎性細(xì)胞黏附，是炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出級(jí)聯(lián)效應(yīng)，機(jī)體原有的抗氧化-氧化平衡被打破，生成過量的ROS作用于生物大分子造成細(xì)胞和組織損傷[22-23]。LPS作為一個(gè)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是免疫反應(yīng)中的促炎刺激物，在進(jìn)入細(xì)胞后能在增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能力和ROS的生成。本實(shí)驗(yàn)中，LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能使細(xì)胞吞噬能力和ROS的水平與對(duì)照組相比顯著上升。EGCG可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化的同時(shí)也抑制了巨噬細(xì)胞的吞噬活性和ROS的生成。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，化學(xué)本質(zhì)是由多肽亞單位組成的蛋白質(zhì)家族，包括NF-κB2（p52）、p65（RelA）、NF-κB1（p50）、cRel、RelB 5 個(gè)成員，存在于真核生物中[24-26]。5 個(gè)家族成員的共同點(diǎn)是氨基末端有由近300 個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)域（Rel同源區(qū)，RHD）。RHD里的功能區(qū)能夠通過二聚化、與DNA結(jié)合等方式，調(diào)控靶基因的表達(dá)。抑制狀態(tài)的NF-κB滯留在細(xì)胞質(zhì)中。在哺乳動(dòng)物中，IκB家族有8 個(gè)成員IκBa、IκBy、IκBP、BcL-3、IκBe、IicB-R、pl00、pl05[27-28]。NF-κB信號(hào)通路的激活有兩條途徑——經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。其中經(jīng)典途徑指的是NF-κB信號(hào)通路被大量的細(xì)胞因子等迅速激活，這種激活主要依賴由IκB激酶（IκB kinase，IKK）誘導(dǎo)的IκB的降解。當(dāng)IKK激活后，可以使IκB特定位點(diǎn)發(fā)生降解，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路。當(dāng)NF-κB被激活后，NF-κB能和STAT1信號(hào)通路等共同作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，然后促進(jìn)促炎因子的釋放，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[29-30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG可通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活化抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥。炎癥的發(fā)生及其調(diào)控涉及復(fù)雜的免疫識(shí)別機(jī)制，依賴于種系編碼的PRRs。TLR受體家族是生物致炎因素的主要受體，主要表達(dá)在固有免疫細(xì)胞表面，能與各種細(xì)菌或病毒的分解產(chǎn)物結(jié)合。TLR4是LPS的主要受體，LPS配體與TLR4受體結(jié)合后，可通過激活NF-κB促進(jìn)細(xì)胞因子等的釋放，從而發(fā)生炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組中NF-κB信號(hào)通路活化的同時(shí)，TLR4的蛋白表達(dá)量增加。EGCG預(yù)處理后，可顯著抑制LPS介導(dǎo)TLR4蛋白的增加和NF-κB信號(hào)通路的活化。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGCG具有抗炎作用，EGCG預(yù)處理LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，可抑制小鼠巨噬細(xì)胞中M1型相關(guān)炎癥參數(shù)的增加；提示EGCG的抗炎作用可通過競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合TLR4受體阻斷NF-κB通路，繼而抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化。

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EGCG Inhibits LPS-Caused Polarization of Macrophages into M1 Phenotype via the NF-κB Pathway

WU Qiong1, WANG Lefeng1, ZHANG Yansong2, TANG Xiaofang2, ZHANG Xianyi2, LI Lu2, SHU Yao2, HUANG Cheng2,LIAO Jinzhu2, WANG Fulong2, LI Wenjuan2,*
(1. The Second Aff i liated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China;2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: The aim of this study was to explore the anti-inf l ammatory effect of (-)-epigallocatechin gallate (EGCG)and its effects on macrophage polarization. Methods: Primary cultures of mouse peritoneal macrophages were divided into 4 groups: control, 1 μg/mL lipopolysaccharides (LPS), 25 μmol/L EGCG, and 25 μmol/L EGCG + 1 μg/mL LPS groups. Flow cytometry analysis was used to determine phagocytosis, reactive oxygen species (ROS) and apoptosis. Cell proliferation was monitored by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay. NO generation was analyzed by Griess method. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of Toll-like receptor 4 (TLR4) and NF-κB p65 proteins was detected by using Western blot analysis. Results: EGCG and/or LPS were no signif i cant effect on cell proliferation or apoptosis in mouse peritoneal macrophages. Compared with the LPS group, EGCG could significantly inhibit the LPS-induced increasing in ROS, NO, TNF-α and IL-1β in peritoneal macrophages (P ＜ 0.01), thereby consequently suppress the polarization of macrophages into M1 phenotype and consequently exerting anti-inf l ammatory effects. Compared with the LPS group, the expression of TLR4 protein in macrophages and the expression of nuclear transcription factor-κB(NF-κB) p65 in nucleus were signif i cantly decreased in the EGCG + LPS group (P ＜ 0.01). Conclusion: EGCG could inhibit LPS-induced inf l ammatory responses in mouse peritoneal macrophages, and the underlying mechanism may be related to the blocking of the polarization of macrophages into M1 phenotype via the TLR4-mediated NF-κB pathway.

(-)-epigallocatechin gallate; anti-inf l ammatory effects; cell phenotype; NF-κB pathway; macrophage polarization

2016-10-27

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31560460）；江西省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20151512041185）；“三區(qū)”人才支持計(jì)劃科技特派人員專項(xiàng)（0210208651）

吳瓊（1984—），女，主管技師，碩士，研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)相關(guān)性。E-mail：66077223@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：李文娟（1982—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c營(yíng)養(yǎng)。E-mail：wenjuanli@ncu.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201801022

TS201.4

A

1002-6630（2018）01-0142-07

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