ε-聚賴氨酸與卵白蛋白間相互作用及對(duì)抑菌活性的影響

譚之磊，武雅楠，方思棋，孫曉光，梁 麗，郭鳳柱，賈士儒，周 斌

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 臺(tái)州 317200）

ε-聚賴氨酸與卵白蛋白間相互作用及對(duì)抑菌活性的影響

譚之磊1，武雅楠1，方思棋1，孫曉光1，梁 麗1，郭鳳柱1，賈士儒1，周 斌2

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 臺(tái)州 317200）

為表征帶正電ε-聚賴氨酸與帶負(fù)電卵白蛋白間的相互作用以及相互作用對(duì)ε-聚賴氨酸抑菌活性的影響，本實(shí)驗(yàn)通過測定ε-聚賴氨酸與卵白蛋白復(fù)合溶液的ζ-電位和濁度，對(duì)ε-聚賴氨酸與卵白蛋白之間的相互作用進(jìn)行了表征。通過抑菌實(shí)驗(yàn)研究ε-聚賴氨酸與卵白蛋白之間的相互作用對(duì)ε-聚賴氨酸抑菌活性的影響。結(jié)果表明卵白蛋白可與ε-聚賴氨酸形成帶不同電荷的復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌的抑菌效果下降，這可能是由于ε-聚賴氨酸與卵白蛋白分子之間發(fā)生靜電結(jié)合，減少了其與帶負(fù)電微生物表面間的相互作用。本研究初步建立了ε-聚賴氨酸與卵白蛋白及大腸桿菌之間的相互作用模型，有利于進(jìn)一步揭示在復(fù)雜食品體系中ε-聚賴氨酸與蛋白質(zhì)的相互作用及其對(duì)ε-聚賴氨酸抑菌活性的影響。

ε-聚賴氨酸；卵白蛋白；靜電結(jié)合；抑菌活性；蛋白質(zhì)

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一種由賴氨酸單體通過ε-氨基和α-羧基形成酰胺鍵聚合而成的均聚物，因具有安全性高、抑菌譜廣、水溶性和熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，被日本、美國、韓國等多個(gè)國家用作食品防腐劑，2014年我國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)ε-PL及ε-PL鹽酸鹽作為食品防腐劑使用[1-7]。雖然ε-PL在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基中對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌及真菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果[8-12]，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)ε-PL對(duì)不同食品的抑菌效果不盡相同。Geornaras等[13]研究了ε-PL對(duì)于不同食物提取物的抑菌效果，結(jié)果表明ε-PL對(duì)米飯和蔬菜提取物的抑菌效果要好于高蛋白的牛乳、牛肉和臘腸提取物抑菌效果。Islam等[14]研究表明ε-PL處理可以降低蔬菜腸炎沙門氏菌數(shù)量。Kang Jihun等[15]研究了乳酸鏈球菌素、精氨酸月桂酸、ε-PL和殼聚糖對(duì)三文魚單核球增多性李斯特菌的抑制效果，結(jié)果表明ε-PL抑菌效果較差。吳勤等[16]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL在藍(lán)莓汁飲料中抑菌活性受到影響，ε-PL抑菌率降低，并且出現(xiàn)了小顆粒，影響了產(chǎn)品感官品質(zhì)。雖然ε-PL在部分食品，尤其是淀粉類食品防腐應(yīng)用中取得了良好效果，但食品是一個(gè)多組分共存且存在相互作用的復(fù)雜體系；而ε-PL具有聚陽離子特性，可能與食品組分中的帶負(fù)電物質(zhì)如阿拉伯膠、果膠、卡拉膠、羧甲基纖維素鈉等發(fā)生相互作用，改變其帶電性質(zhì)，導(dǎo)致濁度改變、形成沉淀并對(duì)其抑菌活性產(chǎn)生影響[17-20]。雖然通過其他防腐劑復(fù)配或與氣調(diào)包裝等技術(shù)手段相結(jié)合可以提高ε-PL在食品中的抑菌效果[21-23]，但對(duì)于ε-PL與食品中其他組分間的相互作用，尤其是食品中含量豐富的蛋白質(zhì)成分間的相互作用機(jī)制還不清楚，因而也難以采取更有效的技術(shù)手段提高ε-PL在富含蛋白質(zhì)類食品中的抑菌效果。

大腸桿菌是人和恒溫動(dòng)物中常見的腸道共生微生物[24-25]，在世界各地動(dòng)植物產(chǎn)品中廣泛分布[26-29]。在肉和肉制品等富含蛋白質(zhì)食品加工過程中很容易受到大腸桿菌污染[29]，從而引發(fā)食源性疾病，此外，對(duì)大腸桿菌的抑制能力也是評(píng)估抗菌活性的重要指標(biāo)[30]，因而本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為指示微生物，通過ζ-電位測定、濁度測定和抑菌實(shí)驗(yàn)研究了ε-PL與食品中重要組分——蛋白質(zhì)間的相互作用。研究結(jié)果有助于揭示ε-PL與食品中其他組分的分子間相互作用機(jī)制，另一方面可進(jìn)一步探討如何通過技術(shù)手段提高ε-PL在食品復(fù)雜體系中的抑菌效果，進(jìn)而提高產(chǎn)品質(zhì)量，保證食品安全。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）由天津科技大學(xué)生化工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

ε-PL鹽酸鹽 浙江新銀象生物工程有限公司；卵白蛋白 加拿大BBI公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

90Plus型激光粒度儀 美國布魯克海文儀器公司；UVmini-1240型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；CX40RF200型顯微鏡 日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備

以檸檬酸緩沖液（0.5 mmol/L、pH 6.6）為溶劑，分別制備1.0 g/100 mL ε-PL和0.1 g/100 mL卵白蛋白溶液，過0.45 μm無菌濾膜除菌，4 ℃冷藏保存。實(shí)驗(yàn)所需溶液均使用去離子水配制。

1.3.2 卵白蛋白與ε-PL的質(zhì)量比對(duì)ζ-電位的影響

取1.3.1節(jié)所配溶液，制備卵白蛋白與ε-PL的質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、0∶1和1∶0的混合液。將復(fù)合溶液混勻后，立即進(jìn)行ζ-電位測定。

1.3.3 卵白蛋白與ε-PL的質(zhì)量比對(duì)濁度的影響

卵白蛋白與ε-PL復(fù)合溶液的質(zhì)量比同1.3.2節(jié)，使用紫外-可見分光光度計(jì)測定復(fù)合溶液的OD600nm。將復(fù)合溶液置于4 ℃下保存24 h后，再次測定OD600nm，測定前將溶液混合均勻。

1.3.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

將保藏于斜面的大腸桿菌轉(zhuǎn)接于新制備的LB固體斜面培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，將活化好的大腸桿菌接入LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)8 h。

制備卵白蛋白與ε-PL不同質(zhì)量比的復(fù)合溶液，其中卵白蛋白（0.5 g/100 mL、pH 6.6）與ε-PL（2.0 g/100 mL、pH 6.6）的質(zhì)量比分別為4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1、1∶0，以不添加復(fù)合溶液的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。按上述比例分別向錐形瓶中加入8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.0 mL卵白蛋白儲(chǔ)備液和0.5 mL ε-PL，純卵白蛋白一組加入20 mL卵白蛋白。分別加入10 mL已滅菌的LB培養(yǎng)基，搖勻，接入0.5 mL上述大腸桿菌菌液，37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)6 h后，測定各組菌懸液OD600nm，并用光學(xué)顯微鏡觀察菌體生長和分布狀態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3 次，結(jié)果運(yùn)用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL與卵白蛋白相互作用后ζ-電位的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)溶液中只含有卵白蛋白時(shí)，ζ-電位為-20.03 mV，卵白蛋白的等電點(diǎn)約為4.5，溶液pH值為6.6，故其帶負(fù)電荷。卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比為零時(shí)，即復(fù)合溶液中只含有ε-PL時(shí)，其ζ-電位為0.985 mV，ε-PL的等電點(diǎn)約為9.0，而溶液pH值為6.6，故其帶正電荷。

圖1 不同卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比對(duì)混合液ζ-電位的影響Fig. 1 Effect of ovalbumin-ε-PL complex solution with different mass ratios on ζ-potential

由圖1可知，ζ-電位隨卵白蛋白比例的增加而降低，當(dāng)卵白蛋白與ε-PL的質(zhì)量比從0∶1到1∶8時(shí)，其復(fù)合物的電位由0.985 mV下降至-4.065 mV，質(zhì)量比由1∶4變?yōu)?∶1時(shí)，其復(fù)合物的電位由-4.18 mV繼續(xù)下降至-5.22 mV，但變化幅度不大，這可能是由于ε-PL所帶正電荷與卵白蛋白所帶負(fù)電荷相互作用后，復(fù)合物所帶電荷達(dá)到了相對(duì)飽和的狀態(tài)。結(jié)果表明：在pH 6.6條件下帶正電荷的ε-PL與帶負(fù)電荷的卵白蛋白發(fā)生相互作用，形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，且隨著卵白蛋白比例增大，ζ-電位降低趨勢逐步減緩。

2.2 ε-PL與卵白蛋白相互作用后濁度的變化

圖2 卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比對(duì)混合液濁度的影響Fig. 2 Effect of ovalbumin-ε-PL mass ratio on turbidity of mixture solutions

圖3 卵白蛋白與ε-PL復(fù)合物溶液0 h（A）和 24 h（B）視覺外觀Fig. 3 Visual appearance of ovalbumin-ε-PL complex solutions at 0 h (A) and 24 h (B)

由圖2可知，隨著卵白蛋白比例的增加，ε-PL與卵白蛋白復(fù)合溶液的OD600nm逐漸增大，當(dāng)卵白蛋白與ε-PL的質(zhì)量比為1∶1時(shí)，其OD600nm達(dá)到最大值0.25，由圖3A可觀察到其渾濁程度的變化。這表明ε-PL與卵白蛋白發(fā)生相互作用，在短時(shí)間內(nèi)ε-PL可能與卵白蛋白復(fù)合形成了比ε-PL分子更大的復(fù)合物，且隨著卵白蛋白質(zhì)量濃度的增加，ε-PL與卵白蛋白復(fù)合物分子的數(shù)量和/或大小增加。

對(duì)置于4 ℃下保存24 h后的復(fù)合溶液再次進(jìn)行濁度測定，測定前將復(fù)合溶液振蕩混勻，由圖2、圖3B可知，隨著卵白蛋白比例的升高，其OD600nm緩慢增加至0.069。與0 h測定的OD600nm相比，卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比從0∶1變?yōu)?∶4時(shí)，24 h時(shí)濁度沒有明顯變化；但當(dāng)其質(zhì)量比從1∶4增加至1∶1時(shí)，其濁度與0 h相比出現(xiàn)明顯下降。

從圖3B可觀察到，當(dāng)卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比為1∶1、1∶2和1∶4時(shí)，復(fù)合液中形成了比較明顯的不溶性復(fù)合物，造成聚沉，溶液變得澄清，且隨著卵白蛋白比例的升高，其復(fù)合物的大小和/或數(shù)量增加，因此當(dāng)其質(zhì)量比1∶4變?yōu)橛?∶1時(shí)，其濁度較0 h明顯下降，且下降程度逐漸增加。而卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比為1∶8和1∶16時(shí)，其復(fù)合溶液較為澄清，沒有形成明顯不溶性復(fù)合物沉淀，因此其濁度無明顯變化，這可能是由于卵白蛋白含量低，ε-PL與卵白蛋白相互作用形成的復(fù)合物分子質(zhì)量較小，不足以形成聚沉。

2.3 卵白蛋白-ε-PL復(fù)合物的抑菌活性

圖4 卵白蛋白與ε-PL不同質(zhì)量比對(duì)抗菌活性的影響Fig. 4 Effect of ovalbumin-ε-PL mass ratio on antibacterial activity

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中無ε-PL和卵白蛋白添加，只添加菌液時(shí)，其0 h的OD600nm為0.031，37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)6 h后，其OD600nm為1.608。當(dāng)培養(yǎng)基中卵白蛋白和ε-PL的質(zhì)量比為0∶1時(shí)，0 h時(shí)OD600nm為0.032，培養(yǎng)6 h后其OD600nm為0.054，由此可見，單純的ε-PL起到了良好的抑菌效果。

培養(yǎng)6 h后，當(dāng)卵白蛋白與ε-PL的質(zhì)量比從0∶1變?yōu)?∶1時(shí)，菌液OD600nm從0.054增加至1.468，隨卵白蛋白的增加呈上升趨勢，即隨著卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比的增加，ε-PL的抗菌活性下降。這可能是由于ε-PL所帶正電荷與卵白蛋白所帶負(fù)電荷發(fā)生相互作用，減少了ε-PL與大腸桿菌菌體表面相互作用的機(jī)率，從而導(dǎo)致ε-PL抑菌活性的下降，且隨著帶負(fù)電卵白蛋白的增加，ε-PL與其相互作用增強(qiáng)，菌液OD600nm呈上升趨勢。

根據(jù)推測，隨著卵白蛋白比例的升高，ε-PL的抑菌活性下降，菌液OD600nm應(yīng)呈上升趨勢，然而，當(dāng)卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比從1∶1變?yōu)?∶1時(shí)，菌液OD600nm出現(xiàn)下降趨勢。對(duì)此，推測這可能是卵白蛋白與ε-PL形成的復(fù)合物包裹了部分菌體，從而導(dǎo)致菌液中部分菌體呈聚集狀態(tài)。

圖5 卵白蛋白-ε-PL復(fù)合物處理后E. coli生長情況的光學(xué)顯微鏡圖片（×1 000）Fig. 5 Representative light microscopic pictures showing the growth of E. coli after being treated with ovalbumin-ε-PL complex (× 1 000)

為了證實(shí)推測的可靠性，將培養(yǎng)好的菌液取樣進(jìn)行結(jié)晶紫染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察了大腸桿菌菌體數(shù)量與分布狀態(tài)。由圖5B～E可知，卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比從0∶1變?yōu)?∶1，視野內(nèi)菌體數(shù)量逐漸增加，且發(fā)生一定聚集現(xiàn)象，而純卵白蛋白處理組（圖5H）與空白對(duì)照組（圖5A）菌體分布狀態(tài)基本一致，表明卵白蛋白與菌體間基本不發(fā)生相互作用。從圖5F、G可觀察到蛋白質(zhì)與ε-PL相互作用形成大塊膠狀聚集體，且膠狀聚集體包裹著大量菌體，聚集體外分散菌體數(shù)量減少，這種絮凝作用可能與同樣帶正電荷的殼聚糖可作為絮凝劑去除菌體細(xì)胞相似[31]，這也就解釋了菌液OD600nm出現(xiàn)下降的原因。

2.4 ε-PL與卵白蛋白及與微生物的相互作用模型

綜合前面關(guān)于ε-PL-卵白蛋白復(fù)合物的聚合特性和帶電特性的討論，推測當(dāng)卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比從0∶1變?yōu)?∶1時(shí)，ε-PL與卵白蛋白相互作用增強(qiáng)，ε-PL-卵白蛋白復(fù)合溶液濁度逐漸增加，其復(fù)合物的ζ-電位逐漸下降，所帶負(fù)電荷增加，ε-PL與菌體表面相互作用減少，導(dǎo)致菌液OD600nm增加，ε-PL抑菌活性下降。

根據(jù)上述推測，提出以下ε-PL與卵白蛋白及菌體相互作用的模型，見圖6。

圖6 卵白蛋白-ε-PL-微生物相互作用模型Fig. 6 Schematic diagram of the interaction of ε-PL with ovalbumin and the bacterial surface

圖6為pH 6.6環(huán)境下ε-PL與卵白蛋白及微生物相互作用示意圖。當(dāng)體系中無卵白蛋白時(shí)，ε-PL與大腸桿菌菌體表面帶負(fù)電物質(zhì)相互作用，進(jìn)而起到抑菌作用；當(dāng)體系中有少量卵白蛋白存在時(shí)，部分ε-PL與卵白蛋白相互作用，游離ε-PL數(shù)量減少，抑菌作用減弱；當(dāng)卵白蛋白量繼續(xù)增加時(shí)，抑菌作用繼續(xù)減弱，當(dāng)卵白蛋白數(shù)量足夠多時(shí)，ε-PL、卵白蛋白與大腸桿菌菌體形成聚集體，ε-PL抑菌效果基本消失。

3 結(jié) 論

對(duì)ε-PL與卵白蛋白相互作用及其對(duì)ε-PL抑菌活性的影響研究結(jié)果表明在pH 6.6的環(huán)境下，ε-PL帶正電荷，卵白蛋白帶負(fù)電荷，卵白蛋白會(huì)與ε-PL相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)合溶液的ζ-電位和濁度發(fā)生變化。ε-PL與卵白蛋白相互作用后會(huì)不同程度降低ε-PL的抑菌活性，當(dāng)卵白蛋白與ε-PL質(zhì)量比從0∶1變?yōu)?∶1時(shí)，ε-PL的抑菌活性逐漸下降，當(dāng)其質(zhì)量比大于1時(shí)，ε-PL與卵白蛋白相互聚結(jié)成較大團(tuán)塊，同時(shí)會(huì)包裹菌體，從而使OD600nm有一定程度下降。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步建立了ε-PL與卵白蛋白及微生物間相互作用的模型，對(duì)ε-PL陽離子和卵白蛋白之間相互作用進(jìn)行了解釋，并分析了這些相互作用對(duì)ε-PL抗菌活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)深入揭示ε-PL在富含蛋白質(zhì)組分食品中抗菌活性差的作用機(jī)制，解決今后ε-PL在食品尤其是高蛋白含量食品中的應(yīng)用問題提供了借鑒，有望通過控制pH值等手段提高ε-PL在高蛋白含量食品中的抑菌效果。

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Interaction of ε-Poly-L-lysine with Ovalbumin and Its Inf l uence on Antibacterial Activity

TAN Zhilei1, WU Yanan1, FANG Siqi1, SUN Xiaoguang1, LIANG Li1, GUO Fengzhu1, JIA Shiru1, ZHOU Bin2
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2. Zhejiang Silver Elephant Bioengineering Co. Ltd., Taizhou 317200, China)

The purpose of this study was to characterize the interaction of cationic ε-poly-L-lysine (ε-PL) with anionic ovalbumin and investigate the influence of this interaction on the antimicrobial efficacy of ε-PL. The interaction was characterized by measuring the ζ-potential and turbidity of ovalbumin-ε-PL complex solution. The results showed that ovalbumin interacted with ε-PL molecules, forming complexes with different electrical charges. In addition, the antimicrobial eff i cacy of ε-PL against Escherichia coli decreased, likely due to strong electrostatic binding of ε-PL to ovalbumin molecules and consequently reducing its interaction with the negative charge on the of microbial surface. The model of ε-PL interaction with ovalbumin and bacteria proposed in this study helps further reveal the interaction of ε-PL with protein and the inf l uence of this interaction on the antimicrobial eff i cacy of ε-PL in complex food systems.

ε-poly-L-lysine; ovalbumin; electrostatic binding; antibacterial activity; protein

10.7506/spkx1002-6630-201801011

TS201.3

A

1002-6630（2018）01-0073-05

譚之磊, 武雅楠, 方思棋, 等. ε-聚賴氨酸與卵白蛋白間相互作用及對(duì)抑菌活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1): 73-77.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801011. http://www.spkx.net.cn

TAN Zhilei, WU Yanan, FANG Siqi, et al. Interaction of ε-poly-L-lysine with ovalbumin and its inf l uence on antibacterial activity[J]. Food Science, 2018, 39(1): 73-77. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801011.http://www.spkx.net.cn

2016-10-06

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102106）；天津市科技特派員項(xiàng)目（15JCTPJC59700）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21276197）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD16B04）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510057006）

譚之磊（1977—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：tanzhilei@tust.edu.cn