基于Pd/Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料的H2O2無酶傳感器

趙雪伶，李嶄虹，陳 誠，朱志剛

(上海第二工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與材料工程學(xué)院，上海 201209)

基于Pd/Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料的H2O2無酶傳感器

趙雪伶，李嶄虹，陳 誠，朱志剛

(上海第二工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與材料工程學(xué)院，上海 201209)

環(huán)境監(jiān)測、食品工業(yè)、臨床、制藥等領(lǐng)域?qū)^氧化氫(H2O2)的快速、準(zhǔn)確檢測有極大的需求，而電化學(xué)檢測方法由于靈敏度高、響應(yīng)快、檢測限低等特點(diǎn)被認(rèn)為是最理想的H2O2檢測方法.本文利用電化學(xué)沉積的方法將Pd納米顆粒沉積到四氧化三鐵/石墨烯(Fe3O4/rGO)納米復(fù)合材料修飾的玻碳電極表面，形成基于新型磁性納米復(fù)合材料的H2O2無酶傳感器；并采用循環(huán)伏安和計時安培電流等方法對修飾電極的電化學(xué)性能進(jìn)行了表征.結(jié)果表明：制備的Pd/Fe3O4/rGO/GCE對H2O2的催化還原顯示出較好的電催化活性，Pd納米顆粒和Fe3O4/rGO在催化H2O2還原的過程中表現(xiàn)出了良好的協(xié)同作用.測定H2O2的線性范圍為0.05～1 mM和1～2.6 mM兩段，最低檢測限達(dá)到3.918 μM (S/N=3).并且該傳感器具有較高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性和抗干擾性，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價值.

過氧化氫；Pd；Fe3O4/rGO；納米復(fù)合材料；無酶傳感器

過氧化氫(H2O2)具有強(qiáng)氧化性，作為高效消毒滅菌劑和漂白劑，廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生、環(huán)保、紡織、化工等領(lǐng)域[1]，但H2O2的過量殘留會對人體健康及生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害[2].因此，對H2O2進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測顯得尤為重要.目前，測定H2O2的方法有分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、熒光光度法、色譜法等.但這些方法存在靈敏度低、操作復(fù)雜、儀器分析方法費(fèi)用較高，且難于進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測等缺點(diǎn)，因此建立一種痕量H2O2的快速測定方法具有重要意義[3-4].電化學(xué)生物傳感器具有操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬、快速而穩(wěn)定的響應(yīng)信號等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注.在已有報道的電化學(xué)H2O2傳感器中，大多要利用辣根過氧化物酶(HRP)的高效催化功能.而酶是一種具有活性的蛋白質(zhì)，價格昂貴且易變性失活，對保存、檢測條件要求也較苛刻，使其實(shí)際應(yīng)用價值受到限制[5-6].

納米材料由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，表現(xiàn)出良好的光電活性、磁性及催化性能.近年來，利用納米材料進(jìn)行傳感器研究已經(jīng)引起了人們的廣泛興趣[7-8].自2007年Fe3O4納米顆粒被報道具有類過氧化物酶活性以來，鐵氧化物磁性納米材料在電化學(xué)傳感研究領(lǐng)域中占據(jù)非常重要的地位.然而，未經(jīng)修飾的尖晶型鐵磁顆粒很容易團(tuán)聚，極不穩(wěn)定，其應(yīng)用也面臨著巨大挑戰(zhàn)[9].石墨烯是一種只有1個碳原子厚度的二維材料，當(dāng)把零維的鐵磁納米顆粒負(fù)載到石墨烯上，這種雜化的納米結(jié)構(gòu)不但可以保持其原有的單一材料性能，而且會展現(xiàn)出更好的協(xié)同作用[10-11].同時，將具有良好生物相容性和穩(wěn)定性的貴金屬與上述材料形成復(fù)合材料，構(gòu)成一個友好的電化學(xué)傳感界面，對于H2O2的快速、簡便檢測具有重要意義[12].

本文采用一步原位法合成尖晶型鐵磁/石墨烯納米復(fù)合材料(Fe3O4/rGO)，將該復(fù)合材料修飾到玻碳電極表面，再利用電化學(xué)沉積的方法將貴金屬Pd沉積到材料表面，形成新型磁性納米復(fù)合材料.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

CHI760A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi，S-4800)；能譜儀(EDS, Falcon, EDAX)；三電極體系：玻碳電極為工作電極，鉑網(wǎng)電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極.所有電化學(xué)實(shí)驗(yàn)都在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行(pH=7.4).

石墨粉、氯化鐵(FeCl3·6H2O)、氯化鈀 (PdCl2)、過氧化氫(H2O2)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-葡萄糖(Glu)、L-抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)購于Sigma-Aldrich公司.其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.2 Fe3O4/rGO 納米復(fù)合材料的制備

首先利用改進(jìn)的Hummers方法制備氧化石墨烯[13]；然后將30 mg氧化石墨烯加入到置有20 mL一縮二乙二醇溶劑的反應(yīng)裝置中，超聲1 h，使氧化石墨烯均勻分散于溶劑中；接著，向反應(yīng)裝置中加入120 mg FeCl3·6H2O，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下220 ℃加熱攪拌0.5 h；最后，向混合物中迅速加入5 mL NaOH/DEG儲備液，并于220 ℃下加熱反應(yīng)1 h，最終產(chǎn)物離心分離并洗滌，置于40 ℃烘箱中干燥過夜.

1.3 Fe3O4/rGO修飾電極的制備

直徑3 mm的玻碳電極依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化鋁粉末拋光，再分別用硝酸以及超純水對電極表面進(jìn)行超聲清洗.然后以新制備的0.1 mol/L H2SO4為底液，用循環(huán)伏安法掃描15圈，電壓-0.25～1.25 V，掃描速度50 mV/s，經(jīng)處理后的電極干燥后用超純水洗滌后干燥待用.將1 mg Fe3O4/rGO分散于1 mL 無水乙醇中，取10 μL該分散液于玻碳電極表面，置于室溫中干燥，該電極記為Fe3O4/rGO/GCE.

1.4 Pd/Fe3O4/rGO修飾電極的制備

以Fe3O4/rGO/GCE為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑網(wǎng)電極為輔助電極，在0.1 mol/L KCl和0.5 mmol/L Pd前驅(qū)物的混合溶液中，控制-0.8～0.5 V電位內(nèi)，采用循環(huán)伏安法掃描50周，掃描速度50 mV/s.取出，用超純水沖洗并自然干燥，得到Pd/Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料修飾電極，該電極記為Pd/Fe3O4/rGO/GCE，即為基于Pd沉積鐵磁/石墨烯納米復(fù)合材料的傳感器.

2 結(jié)果與討論

2.1 Pd/Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料的表征

將Pd納米顆粒利用電化學(xué)方法沉積到Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料表面以后，利用掃描電子顯微鏡(SEM)和能譜儀(EDS)分別對樣品的形貌和組成進(jìn)行了表征，結(jié)果見圖1.

圖1Pd/Fe3O4/rGO的掃描電鏡照片(a)和X射線能譜(b)

Fig.1 SEM images of Pd/Fe3O4/rGO on GCE (a) and the EDS of Pd/Fe3O4/rGO composite (b)

由圖1(a)可以觀察到，較深的黑色襯底表面，分布著粒徑為50 nm 左右的白色球狀物質(zhì).EDS能譜分析結(jié)果(圖1(b))也表明，復(fù)合材料中有Pd和Fe的存在，說明Pd納米顆粒已經(jīng)成功沉積到了Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料表面.

2.2 修飾電極的電化學(xué)性能表征

圖2顯示了不同材料修飾電極Fe3O4/GCE、Fe3O4/rGO/GCE和Pd/Fe3O4/rGO/GCE在0.1 M PBS(pH 7.4, 含有 0.1 M KCl)中的循環(huán)伏安曲線.從圖2可以觀察到：Fe3O4/GCE沒有明顯的氧化還原峰，但Fe3O4/rGO/GCE和Pd/Fe3O4/rGO/GCE都顯示出一對完整的氧化還原峰；并且Pd/Fe3O4/rGO/GCE的峰值電流(ΔIp)是Fe3O4/rGO/GCE的3倍之多，這也說明了石墨烯和Pd納米顆粒的引入賦予了傳感器更為優(yōu)異的電子轉(zhuǎn)移能力.

圖2Fe3O4/GCE、Fe3O4/rGO/GCE和Pd/Fe3O4/rGO/GCE在0.1MPBS(pH7.4,含有0.1MKCl)中的CV曲線

Fig.2 Cyclic voltammograms of Fe3O4/GCE、Fe3O4/rGO/GCE and Pd/ Fe3O4/rGO/GCE in 0.1 M PBS, pH 7.4 (containing 0.1 M KCl) at scan rate of 50 mV/s

隨后研究了Pd/Fe3O4/rGO/GCE在含有5 mM Fe(CN)63-/4-的 0.1 M PBS(0.1 M KCl)溶液中，不同掃描速度與峰電流之間的關(guān)系，掃苗速度范圍10～100 mV/s.如圖3所示，隨著掃描速度的增加，峰與峰之間的電位ΔEp以及峰電流ΔIp也同步增加，且陽極峰電流和陰極峰電流均與掃速成良好的線性關(guān)系，表明電極反應(yīng)是一個表面控制過程.

2.3 修飾電極對H2O2的電化學(xué)性能測試

圖4比較了Pd/Fe3O4/rGO/GCE在有/無 0.1 m M H2O2存在時的循環(huán)伏安行為.對于Pd/Fe3O4/rGO/GCE而言，-0.1 V處的還原峰歸屬于Pd的電還原信號.當(dāng)溶液中加入 0.2 mM H2O2儲備液后，Pd/Fe3O4/rGO/GCE 傳感器在-0.1 V的還原峰電流增大，表明了制備的電極對H2O2有較好的電化學(xué)響應(yīng).

圖3Pd/Fe3O4/rGO/GCE在0.1MPBS(pH7.4,含有0.1MKCl)溶液中不同掃描速度下的CV圖(a)和氧化還原電流值和掃速的關(guān)系(b)

Fig.3 Cyclic voltammograms of the Pd/Fe3O4/rGO/GCE in in 0.1 M PBS, pH 7.4 (containing 0.1 M KCl) at different scan rates (a) and the dependence of redox peak currents on the scan rate (b)

圖4Pd/Fe3O4/rGO/GCE在0.1MPBS(pH7.4)溶液中，掃速50mV/s時加入/不加入H2O2的CV曲線

Fig.4 CV curves of Pd/Fe3O4/rGO/GCE in 0.1 M PBS (pH 7.4) with the absence and presence of H2O2at scan rate of 50 mV/s

為進(jìn)一步說明石墨烯片層結(jié)構(gòu)和Pd納米顆粒的引入對傳感器電催化性能的影響，利用計時電流法，在檢測電位為-0.1 V時，向 0.1 M PBS(pH 7.4, 包含0.1 M KCl)溶液中等時間間隔加入同濃度的H2O2，比較Fe3O4/GCE、Fe3O4/rGO/GCE和Pd/Fe3O4/rGO/GCE對檢測物響應(yīng)大小.如圖5所示，通過修飾Fe3O4/GCE，當(dāng)連續(xù)加入等濃度的H2O2、Fe3O4/rGO/GCE和Pd/Fe3O4/rGO/GCE對H2O2都產(chǎn)生一個快速響應(yīng).值得注意的是Fe3O4/rGO/GCE和Pd/Fe3O4/rGO/GCE產(chǎn)生的電流響應(yīng)分別約為 Fe3O4/GCE電流響應(yīng)的3倍和5倍.修飾電極電流響應(yīng)信號的增強(qiáng)可能歸結(jié)于石墨烯良好的二維層狀結(jié)構(gòu)可以為Fe3O4磁性納米顆粒和Pd提供良好的固定環(huán)境；同時，Pd納米顆粒的引入可以提高傳感器的催化性能和穩(wěn)定性，這樣便形成了完美的整體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是一種導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)，可以縮短電子和離子運(yùn)輸?shù)耐緩剑岣唠娮觽鬟f速度.

圖5檢測電位-0.1V時，向0.1MPBS(pH7.4,包含0.1MKCl)溶液中等時間間隔加入0.2mMH2O2，不同修飾電極對檢測物響應(yīng)

Fig.5 Current-time response of Fe3O4/GCE、Fe3O4/rGO/GCE and Pd/Fe3O4/rGO/GCE upon successive addition of 0.2 mM H2O2in 0.1 M PBS, pH 7.4 (containing 0.1 M KCl) at an applied potential of -0.1 V

2.4 修飾電極對H2O2的線性范圍及檢測限

用計時電流法考察傳感器性能之前，先對傳感器檢測電位進(jìn)行優(yōu)化.因?yàn)楹线m的檢測電位對傳感器靈敏度有很大影響.如圖6所示，在 -0.2 ～0 V內(nèi)，向溶液中加入 0.1 mM H2O2后，檢測電極在-0.1 V電位下的安培響應(yīng)最大，因此-0.1 V為最優(yōu)檢測電位，故以下測試均在此電位下進(jìn)行.

圖6Pd/Fe3O4/rGO/GCE在不同檢測電位下對H2O2的電流響應(yīng)

Fig.6 Current responses of the Pd/Fe3O4/rGO/GCE upon H2O2at different applied potentials

圖7記錄了采用計時電流法記錄檢測電位為 -0.1 V 時，向攪拌的 0.1 M PBS(pH 7.4, 含有 0.1 M KCl)溶液中連續(xù)滴加不同濃度H2O2時的安培電流響應(yīng)曲線.由圖7可知，隨著不斷加入H2O2，電流響應(yīng)呈現(xiàn)階梯性的增大，電極對檢測物的響應(yīng)時間約為5 s.在 50～1 000 μM 和1 000～2 600 μM范圍內(nèi)，H2O2的濃度與電流響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，靈敏度分別為3.685和2.810 μA/mM.由以上數(shù)據(jù)可看出，Pd/Fe3O4/rGO/GCE傳感器對于H2O2的檢測有較高的靈敏度和較寬的線性范圍.

圖7Pd/Fe3O4/rGO/GCE電極在檢測電位-0.1V，向攪拌的0.1MPBS(pH7.4,含有0.1MKCl)溶液中連續(xù)滴加不同濃度H2O2時的安培電流響應(yīng)曲線；內(nèi)插圖為電流與H2O2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.7 Amperometric response of the Pd/Fe3O4/rGO/GCE for the successive addition of different concentration of H2O2into constantly stirred 0.1 M PBS, pH 7.4 (containing 0.1 M KCl). Applied potential: -0.1 V; Insert: the calibration line of the response current vs. the H2O2concentration

2.5 修飾電極的抗干擾性和穩(wěn)定性

選擇性是一項(xiàng)評價傳感器性能優(yōu)劣的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)測試了常見干擾物L(fēng)-抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)、D-葡萄糖(Glu)以及尿酸(UA)對H2O2傳感器選擇性的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 8所示，可以看出，以上干擾物對H2O2檢測的影響較小，可忽略不計，這說明Pd/Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料修飾電極可以避免其他物質(zhì)干擾,用于實(shí)際樣品的檢測.

接著考察了Pt/Fe3O4/rGO修飾電極的重復(fù)性和穩(wěn)定性.挑選新制備的5根電極，利用計時電流法對0.2 mM的H2O2進(jìn)行檢測，記錄每根電極的安培電流響應(yīng)，計算得到5根電極電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.2%，結(jié)果表明，制備的修飾電極具有良好的一致性，可用于H2O2的可重復(fù)性檢測.此外，同樣利用計時電流法研究了傳感器的穩(wěn)定性，考察 4 周內(nèi)同一根電極對相同濃度H2O2測定的電流變化，結(jié)果見圖9，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過數(shù)周使用后Pt/Fe3O4/rGO修飾電極30天后仍保持 95.2% 以上的靈敏度.Pt/Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)有效保持了傳感器的穩(wěn)定性.

圖8外源性干擾物對電極檢測H2O2性能的影響(圖中箭頭表示加入0.1mMH2O2、0.5mMUA、0.5mMAA、0.5mMDA和0.5mMGlu的計時電流曲線)

Fig.8 Effect of the possible interferents in H2O2biosensor. The arrows show the each moment at the successive addition of 0.1 mM H2O2、0.5 mM UA、0.5 mM AA、0.5 mM DA and 0.5 mM Glu

圖9Pt/Fe3O4/rGO修飾電極的長期穩(wěn)定性測試結(jié)果

Fig.9 Long-term stability of the Pt/Fe3O4/rGO/GCE

3 結(jié) 論

1)本文利用電化學(xué)沉積的方法將Pd納米顆粒沉積到Fe3O4/rGO納米復(fù)合材料修飾的玻碳電極表面，形成了直接測定H2O2的無酶傳感器.該復(fù)合結(jié)構(gòu)集合了石墨烯和Pd納米顆粒的性能優(yōu)越性，提高了傳感器對H2O2的檢測靈敏度，降低了檢測限，在50～1 000 μM 和1 000～2 600 μM范圍內(nèi)，H2O2的濃度與電流響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，靈敏度分別為3.685和2.810 μA/mM.

3)該傳感器經(jīng)過數(shù)周使用后仍保持 95.2% 以上的靈敏度，常見干擾物質(zhì)也對H2O2檢測的影響較小，因此具有一定的實(shí)際應(yīng)用價值.

[1] CHEN Wei, CAI Shu, REN Qiongqiong, et al. Recent advances in electrochemical sensing for hydrogen peroxide: a review [J]. Analyst, 2012, 137(1): 49-58.

[2] LI Jianping, LI Yuping, ZHANG Yun, et al. Highly sensitive molecularly imprinted electrochemical sensor based on the double amplification by an inorganic prussian blue catalytic polymer and the enzymatic effect of glucose oxidase [J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(4): 1888-1893.

[3] ZHU Zhigang, GARCIA-GANCEDO L, CHEN Cheng, et al. Enzyme-free glucose biosensor based on low density CNT forest grown directly on a Si/SiO2substrate [J]. Sensor and Actuators B: Chemical, 2013, 178(3): 586-592.

[4] ZHU Xiang, NIU Xiangheng, ZHAO Hongli, et al. Doping ionic liquid into prussian blue-multiwalled carbon nanotubes modified screen-printed electrode to enhance the nonenzymatic H2O2sensing performance [J]. Sensor and Actuators B:Chemical, 2014, 195(5): 274-280.

[5] CHEN Lijian, WANG Nan, WANG Xindong, et al. Protein-directed in situ synthesis of platinum nanoparticles with superior peroxidase-like activity, and their use for photometric determination of hydrogen peroxide [J]. Microchimica Acta, 2013, 180(15): 1517-1522.

[6] GAO Lizeng, ZHUANG Jie, NIE Leng, et al. Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles [J]. Nature Nanotechnology, 2007, 2(9): 577-583.

[7] GEORGIA G, ANTHEMIDIS A N. Magnetic materials as sorbents for metal/metalloid preconcentration and/or separation. A review [J]. Analytica Chimica Acta, 2013, 789(14): 1-16.

[8] HAO Rui, XING Ruijun, XU Zhichuan, et al. Synthesis, functionalization, and biomedical applications of multifunctional magnetic nanoparticles [J]. Advanced Materials, 2010, 22(25): 729-2742.

[9] ZHANG Zhanxia, ZHU Hui, WANG Xiaolei, et al. Sensitive electrochemical sensor for hydrogen peroxide using Fe3O4magnetic nanoparticles as a mimic for peroxidase [J]. Microchimica Acta, 2011, 174(1): 183-189.

[10] AMBROSI A, CHUA C K, BONANNI A, et al. Electrochemistry of graphene and related materials [J]. Chemical Reviews, 2014, 114: 7150-7188.

[11] JIANG Lili, FAN Zhuangjun. Design of advanced porous graphene materials: from graphene nanomesh to 3D architectures [J]. Nanoscale, 2014, 6: 1922-1945.

[12] CHEN Shihong, YUAN Ruo, CHAI Yaqin, et al. Electrochemical sensing of hydrogen peroxide using metal nanoparticles: a review [J]. Microchimica Acta, 2013, 180: 15-32.

[13] MARCANO D C, KOSYNKIN D V, BERLIN J M, et al. Improved synthesis of graphene oxide [J]. ACS Nano, 2010, 4(8): 4806-4814.

AnonenzymaticH2O2biosensorbasedonPd/Fe3O4/rGOnanocomposite

ZHAO Xueling, LI Zhanhong, CHEN Cheng, ZHU Zhigang

(School of Environmental and Materials Engineering, Shanghai Polytechnic University, Shanghai 201209, China)

There is a great demand for the fast and accurate sensing of hydrogen peroxide (H2O2) in environmental monitoring, food industry, clinical, pharmaceutical and other fields. Due to the high sensitivity, fast response and low detection limit, electrochemical method is considered as an ideal analytical strategy. A nonenzymatic H2O2biosensor was obtained by utilizing the electrodeposition of Pd nanoparticles on iron oxide-reduced graphene oxide (Fe3O4/rGO) nanocomposite modified glassy carbon electrode (GCE). The electrochemical characteristics of the resulting biosensor were characterized by cyclic voltammetry (CV) and chronoamperometry methods. These results indicated that the prepared Pd/Fe3O4/rGO/GCE exhibited excellent electro-catalytical activity towards the reduction of H2O2and the synergetic effect of Pd and Fe3O4/rGO nanocomposite on the reaction of H2O2. The linear range of Pd/Fe3O4/rGO is 0.05～1 mM and 1～2.6 mM, with a detection limit of 3.918 μM (S/N=3). The biosensor also exhibited high sensitivity, high reproducibility and good anti-interferent ability, and thus has certain value on the practical applications.

hydrogen peroxide; Pd; Fe3O4/rGO; nanocomposite; biosensor

2016-12-21. < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版時間

時間: 2017-06-27.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(61471233, 21504051)；上海市教委曙光計劃(14SG52)；上海第二工業(yè)大學(xué)?；?EGD15XQD04)；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃(ZZZZEGD15012)；上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2015年度開放課題(SKLFMC201502)；上海第二工業(yè)大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科(材料科學(xué)與工程，XXKZD1601)資助.

趙雪伶(1988—)，女，博士，講師；朱志剛(1977—)，男，教授，博士生導(dǎo)師.

朱志剛，E-mail: zgzhu@sspu.edu.cn.

10.11951/j.issn.1005-0299.20160446

TB3; O646

A

1005-0299(2017)06-0056-05

(編輯程利冬)