多型口蹄疫疫苗滅活時間和純化的比較研究

趙書藝，崔 燕

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

多型口蹄疫疫苗滅活時間和純化的比較研究

趙書藝，崔 燕*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

【目的】為了探討不同滅活時間及純化對多型口蹄疫疫苗146 S、總蛋白量、抗原收獲量及疫苗效力的影響?！痉椒ā窟x取OM/Re-A/AF/Asia1 4種不同型的口蹄疫疫苗為研究對象，設定不同滅活時間(8、10、12、14和16 h)，對每個時間點疫苗母液中146 S、總蛋白和抗原收獲量進行檢測和差異性分析；測量純化前后146 S和總蛋白的變化趨勢；測定不同滅活時間及純化前后疫苗PD50數(shù)值進行判定效力?！窘Y果】滅活不同時間點，146 S含量和抗原收獲量隨著時間先增高后平緩的趨勢，146 S在14 h出現(xiàn)平緩，而抗原收獲量在10 h時開始平緩；146 S含量OM和AF型明顯高于Re-A和Asia1型，抗原收獲量Asia1型最高；總蛋白含量隨著時間呈現(xiàn)先降低后平緩的趨勢，AF型口蹄疫疫苗降低最明顯；疫苗純化前后相比分析發(fā)現(xiàn)，146 S含量明顯升高，總蛋白含量明顯降低(P<0.01)。4種疫苗PD50值隨著純化時間先增大后平穩(wěn)，純化后PD50顯著提高(P<0.01)，免疫效力增強?！窘Y論】 OM/Re-A/AF/Asia1 4種不同型的口蹄疫疫苗在純化不同時間點，疫苗中146 S、抗原收獲量和總蛋白含量呈規(guī)律性變化，且純化前后146 S、總蛋白含量及PD50值差異性極顯著，表明口蹄疫疫苗的滅活時間和純化是影響疫苗效價的重要因素。

口蹄疫疫苗；純化；抗原收獲量；總蛋白；146 S

【研究意義】口蹄疫病毒根據(jù)地域及特征有7種不同血清型，各型之間幾乎沒有免疫保護力，針對不同的血清型病毒采用相應的滅活疫苗進行疫病防控。隨著科學技術的不斷發(fā)展出現(xiàn)很多新型疫苗，比如活載體疫苗、基因工程疫苗、空病毒衣殼蛋白疫苗、新型的弱毒疫苗、DNA疫苗、感染性克隆疫苗和合成肽疫苗等。新型疫苗的優(yōu)缺點較為明顯，例如口蹄疫空病毒衣殼疫苗接種后在血清中檢測到高濃度的抗體[1]?！厩叭搜芯窟M展】疫苗是口蹄疫病毒最好的防控措施之一。最新報道，德國科學家實驗證實通過ELISA檢測試劑盒能夠準確的對口蹄疫進行檢測和診斷[2]。3AB1-ELISA是一個重要的快速檢測接種口蹄疫病毒疫苗動物群體的試劑盒，優(yōu)點不僅在于適合大量血清樣本，還具有可靠、經(jīng)濟和簡單等[3]。ELISA 可標記口蹄疫病毒基因的3’羧基末端，達到最口蹄疫的直接檢測[4-5]。此外，實驗動物模型證實小分子藥物可通過選擇性抑制口蹄疫病毒的復制而起到控制疫病的效果[6]。生產(chǎn)過程中很多因素決定了疫苗的免疫效價。隨著技術的不斷更新和改進，口蹄疫疫苗的篩選雙抗夾心法-ELISA有著檢測更加敏感，且146 S微粒能夠分解蛋白酶的作用，基本取代了蔗糖密度梯度法[7]。此外，最新建立的微量雙抗夾心法-ELISA檢測O型口蹄疫疫苗技術，通過檢測抗原146 S的量，不僅具備檢測迅速、針對性強、可重復、高敏的特點，還可以大量應用于滅活疫苗的生產(chǎn)[8]。疫苗的滅活和純化是影響效價的重要因素之一。規(guī)?；a(chǎn)過程中溫度36.5～37.0 ℃，pH值7.4～7.6，DO值為50.0 %～70.0 %，攪拌轉速50～70 r/min時，可有效提高口蹄疫病毒增殖能力[9]。超濾純化技術對口蹄疫滅活疫苗抗原純化后，血清抗體水平較常規(guī)純化顯著升高，陽轉率也高于常規(guī)滅活疫苗[10]?！颈狙芯壳腥朦c】本文對4種不同型口蹄疫疫苗生產(chǎn)過程中，設定不同的滅活時間點及純化前后測定疫苗中146 S、總蛋白量及抗原收獲量，并通過檢測LD50進行判定疫苗效力?！緮M解決的關鍵問題】該實驗詳實的數(shù)據(jù)為口蹄疫疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

動態(tài)試管儀、蔗糖密度梯度形成儀、凱氏定氮儀、紫外分光光度計、超速冷凍離心機、電泳儀及電泳槽、-20 ℃冰箱、 高壓鍋、 垂直板電泳轉移裝置、 恒溫水浴搖床、多用脫色搖床等。

單去污劑裂解液、0.01 mol/L PBS (pH 7.3)、10 %分離膠、4 %濃縮膠、G250 考馬斯亮藍溶液、0.15 mol/L NaCl溶液、SDS 上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉移緩沖液、麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、定影液、抗體、化學發(fā)光試劑、鱟試劑、PEG6000、蔗糖、氯仿、丙烯酰胺等。

1.2 試驗方法

1.2.1 口蹄疫 146 S 抗原含量的測定 按照蔗糖密度梯度離心與紫外分光光度計定量法[11]檢測破乳后水相中 146 S 抗原含量。

1.2.2 總蛋白含量測定 采用凱氏定氮法，對疫苗樣品進行總蛋白含量測定。

1.2.3 效力檢測 每頭份疫苗所含PD50的數(shù)值不能太少，對照豬至少有一例出現(xiàn)典型的口蹄疫水泡或者潰瘍。

2 結果與分析

2.1 不同滅活時間點146 S、抗原收獲量及總蛋白含量測定

由圖1可以看出，4種不同型的口蹄疫疫苗，在滅活不同時間后146 S含量變化差異極顯著。疫苗中146 S含量在8 h時基本相同，沒有差異，6 h時AF和OM之間差異不顯著，但是AF和Re-A，AF和Asia1，OM和Re-A，OM和Asia1相互之間差異顯著。根據(jù)146 S含量增長趨勢發(fā)現(xiàn)，4種疫苗在8～10，12～14 h變化極顯著，但在10～12，14～16 h變化不顯著。在16 h時不同疫苗中146 S含量值AF>OM>Re-A>Asia1，說明AF和OM型疫苗146 S含量對滅活時間更加敏感，其次Re-A和Asia1。

由圖2可知，不同型的口蹄疫疫苗，在滅活不同時間后抗原收獲量變化差異極顯著。疫苗中抗原含量在8 h時基本相同，差異不顯著，16 h時AF和OM之間含量差異不顯著，但是AF和Re-A，AF和Asia1，OM和Re-A，OM和Asia1相互之間差異顯著。根據(jù)抗原含量增長趨勢發(fā)現(xiàn)，4種疫苗在8～10 h抗原含量增長極顯著， AF、OM和Re-A在10～16 h抗原含量變化不顯著，但Asia1在10～14 h抗原含量變化顯著，14～16 h這4種疫苗抗原含量變化不顯著。在16 h時不同疫苗中抗原收獲量值Asia1>AF>Re-A>OM，說明Asia1型疫苗抗原收獲量對滅活時間更加敏感。

圖1 不同時間點AF、OM、Re-A和Asia1 4種疫苗中146 S含量Fig.1 146 S contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time points

圖2 不同時間點AF、OM、Re-A和Asia1 4種疫苗中抗原收獲量Fig.2 Antigen yield in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time points

由圖3可見，不同型的口蹄疫疫苗，在滅活不同時間點總蛋白含量變化差異極顯著。4種疫苗中總蛋白含量在8～10 h時變化：AF > Asia1>OM >Re-A；10～12 h Asia1>OM 和Re-A >AF；12～14 h AF總蛋白含量變化顯著，而Asia1、OM、Re-A趨于平穩(wěn)； 14～16h時4種疫苗中總蛋白含量變化才趨于平穩(wěn)。在16 h時不同疫苗中總蛋白含量值Asia1>AF> Re-A >OM，說明Asia1和AF中總蛋白含量對滅活時間更加敏感。

2.2 純化前后146 S和總蛋白含量測定

疫苗中146 S含量是疫苗質量的重要參數(shù)，從滅活樣和純化后檢測數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，純化后146 S含量較滅活樣顯著增高，表現(xiàn)為OM> Asia1> AF> Re-A；滅活樣4種疫苗中146 S含量無顯著差異，純化后OM型疫苗146 S含量明顯高于Asia1、 AF和Re-A ；然而，純化后Asia1、AF、Re-A的146 S含量無顯著差異。說明OM型疫苗146 S含量對純化更加敏感(圖4)。

圖3 不同時間點AF、OM、Re-A和Asia1 4種疫苗中總蛋白含量Fig.3 Total protein contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time points

不同字母A，B，C和D表明不同疫苗中差異顯著(P<0.05),相同字母之間表明差異不顯著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P > 0.05)圖4 純化前后AF、OM、Re-A和Asia1 4種疫苗中146 S含量Fig.4 146 S contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 before and after purification

總蛋白含量影響著疫苗的效價，從純化后和滅活樣檢測數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，純化后總蛋白含量較滅活樣顯著降低，表現(xiàn)為Asia1> Re-A > AF > OM；而OM型差異明顯高于Asia1、 AF和Re-A，且純化后AF和Re-A之間差異不顯著，說明OM型疫苗總蛋白含量對純化更加敏感(圖5)。

不同字母A，B，C和D表明不同疫苗中差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表明差異不顯著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P>0.05)圖5 純化前后AF、OM、Re-A和Asia1 4種疫苗中總蛋白含量Fig.5 Total protein contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 before and after purification

不同字母A，B，C和D表明不同疫苗中差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表明差異不顯著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P > 0.05)圖6 不同時間點AF、OM、Re-A和Asia1 4種疫苗中每頭份PD50測量值Fig.6 Each copy contains PD50 in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time point

2.3 效力測定

標準規(guī)定，每頭份疫苗至少含有6個PD50，對照豬至少有一例出現(xiàn)典型的口蹄疫水泡或者潰瘍。檢驗得出結果為對照豬2/2發(fā)病，每頭份疫苗所含PD50均多余6個，基本集中在10個左右，說明疫苗效力比較強。4種疫苗PD50值隨著純化時間先增大后平穩(wěn)(圖6)，純化后PD50顯著提高(P<0.01)，免疫效力增強(圖7)。

3 討 論

3.1 生產(chǎn)中滅活對疫苗效價的影響

生產(chǎn)條件的控制直接影響著疫苗對動物的免疫效力。該實驗滅活前的細胞懸浮培養(yǎng)，如BHK-21細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液、pH、溶解氧、罐壓、攪拌等都沿用最理想的細胞生長條件；例如在BHK-21細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的氨將直接影響細胞的生長代謝率[12-13]。研究證實，疫苗質量與細胞培養(yǎng)方式關系密切，懸浮培養(yǎng)的A/O/SAT-2口蹄疫疫苗相對于其他培養(yǎng)出現(xiàn)抗體效價時間提前，保護周期明顯增長[14]。為了保證疫苗抗體的高效價，該實驗過程中細胞的培養(yǎng)全部為懸浮培養(yǎng)技術，但生產(chǎn)中培養(yǎng)毒性高的口蹄疫病毒對病毒擴散有潛在的危險，疫苗可能有時含有口蹄疫病毒非結構蛋白(NSPs)[15]。研究發(fā)現(xiàn)組氨酸6標記的病毒和沒有標記的病毒在傳染性等功能上保留了相似性，說明高度純化的組氨酸6標記口蹄疫病毒可以代替當前口蹄疫病毒抗原的凈化、濃縮和伸縮性流程[16]。

不同字母A,B,C和D表明不同疫苗中差異顯著(P<0.05),相同字母之間表明差異不顯著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P > 0.05)圖7 純化前后AF、OM、Re-A和Asia1 4種疫苗中每頭份PD50測量值Fig.7 Each copy contains PD50 in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 before and after purification

該實驗采用2次滅活，滅活罐需要在中間更換一次，這樣有利于病毒的完全混合，能夠保證滅活更加徹底[12]。此外，口蹄疫疫苗的效價隨著儲存時間的延長而減小，146 S會裂解為12 s使免疫原性降低[17]。本實驗中不同型口蹄疫疫苗146 S含量在16 h含量差異變化明顯，AF和OM型疫苗146 S含量對滅活時間更加敏感，Asia1型疫苗抗原收獲量和總蛋白含量對滅活時間更加敏感。研究還發(fā)現(xiàn)高溫處理下亞洲和亞洲1血清型中的146 S提前轉換為12 S顆粒，可通過添加防腐劑硫柳汞來刺激抗原加快分解為12 S單體并保存于4 ℃，但分解的口蹄疫疫苗免疫原性明顯降低[18]。

3.2 純化對疫苗質量的影響

疫苗質量的檢測指標較多，但146 S含量、抗原收獲量和總蛋白含量是檢測得最重要指數(shù)。XX等人發(fā)現(xiàn)雙抗夾心-ELISA檢測技術與蔗糖密度梯度法相比更加敏感，同時也表明146 S微粒具有分解蛋白酶的作用[19]。懸浮培養(yǎng)體系能夠得到高質量的A/O/SAT-2口蹄疫疫苗，且抗原性在18 h出現(xiàn)峰值，并檢測到完整的146 S病毒顆粒[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)純化前后146 S顯著增高，而總蛋白含量顯著下降，OM型相對于其他型疫苗對純化更加敏感，出現(xiàn)此種情況根本原因在于疫苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)以及出廠疫苗所含有的有效 146 S 抗原、總蛋白及內毒素含量有著密切的關系。

3.3 疫苗效力對免疫效果的影響

疫苗效力是評價疫苗免疫力的重要參照。最新研究發(fā)現(xiàn)，多表位抗體蛋白口蹄疫病毒疫苗，在免疫的小鼠血清中抗體明顯升高，說明當口蹄疫病毒發(fā)生變異時多表位抗體蛋白可以作為取代疫苗進行免疫[21]。2016年第1次證明家蠶幼蟲可以被用作口蹄疫疫苗的生產(chǎn)，在口蹄疫病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的生產(chǎn)和診斷中具有重要的作用[22]。該實驗發(fā)現(xiàn)，在最佳滅活時間，純化后4種疫苗中PD50均多余6個，達到10個左右，通過進一步臨床檢驗證實疫苗免疫效果優(yōu)良，但極少數(shù)批次疫苗使用產(chǎn)生不同的免疫保護效果，有時也會出現(xiàn)明顯的免疫失敗，發(fā)生免疫應激造成死亡現(xiàn)象，說明疫苗質量是免疫保護的重要因素，但不是唯一因素。

4 結 論

該實驗研究發(fā)現(xiàn)，OM/Re-A/AF/Asia1 4種不同型的口蹄疫疫苗，在不同滅活時間點，疫苗中146 S含量和抗原收獲量隨著純化時間先增高后平緩的趨勢，146 S和抗原收獲量出現(xiàn)平緩的時間點不同。疫苗純化前后相比發(fā)現(xiàn)，146 S含量明顯升高，總蛋白含量明顯降低(P<0.01)。4種疫苗PD50值隨著純化時間先增大后平穩(wěn)，純化后PD50顯著提高(P<0.01)，免疫效力增強?？傊撗芯空f明滅活時間和純化是影響疫苗效價的重要因素之一。

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【Objective】The aim of this study is to investigate the different types of foot and mouth disease vaccine of 146 S, total protein contents, antigen harvest and vaccine efficacy by inactivate time and purify.【Method】 OM/Re-`A/AF/Asia1 four different types of foot and mouth disease vaccine were selected as the research objects, setting different inactivated time (8, 10, 12, 14 and 16 hours), the difference of the 146 S, total protein contents and antigens harvest by each point-in-time were analyzed, and the changing trends of total protein and 146 S before and after purification were measured. The vaccine effect of PD50numerical at different time inactivated and before-after purification was identified. 【Result】At the different time points of inactivated, 146 S and antigen harvest with the time of increased first and then gentle trend, the 146 S appeared flat at 14 hours, but the antigen harvest began to gently at 10 hours; The 146 S content in OM and AF was significantly higher than that of Re-A and Asia1, and antigen harvest was the highest in Asia1; Purified over time and total protein content showed a trend of first decreases and then gentle, AF type of foot and mouth disease vaccine lowers was the most obvious; Compared of vaccine before and after purification, it was found that 146 S levels increased significantly, total protein content significantly decreased (P<0.01). Four types of vaccine PD50value with the purification time firstly increases and then was smooth, purified PD50significantly increased (P<0.01), increasing the immune effect.【Conclusion】With the purification of OM/Re-A/AF/Asia1 four different types of foot and mouth disease vaccine at different time points, 146 S, antigen harvest and total protein were regularly changed in vaccine, and the 146 S, total proteins and PD50value difference significantly in before-after purification. This study indicated that the inactivated time and purification was one of the important factors in affecting vaccine titer.

FMDV; Purification; Antigen harvest; Total proteins; 146 S

1001-4829(2017)12-2833-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.037

2017-07-10

國家自然基金項目 “冷應激因子CIRP和HSP70與牦牛高寒低氧環(huán)境的適應性機制”(31360594)

趙書藝(1982-)，女，助理經(jīng)濟師，從事生物制品行業(yè)，E-mail：rose.zsy88@163.com；*為通訊作者：崔 燕(1962-)，女，教授，博士生導師，從事解剖與組織胚胎學研究，E-mail：Cuiyan369@sina.com。

S852.4

A

AnalysisofPolytypeFoodandMouthDiseaseVaccinebyInactivateTimeandPurify

ZHAO Shu-yi，CUI Yan*

(College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Gansu Lanzhou 730070, China)

(責任編輯陳 虹)