雨生紅球藻PHOT的基因克隆和生物信息學(xué)分析

崔紅利，陳 軍，王林萍，胡章立，秦 松

(1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點實驗室，山東 煙臺 264003；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 深圳 518060)

雨生紅球藻PHOT的基因克隆和生物信息學(xué)分析

崔紅利1，陳 軍2,3，王林萍1，胡章立4，秦 松2

(1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點實驗室，山東 煙臺 264003；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 深圳 518060)

【目的】本文旨在獲得雨生紅球藻中藍光受體向光素(Phototropin，PHOT)的全長序列并進行生物信息分析?！痉椒ā坎捎猛纯寺『蚏ACE結(jié)合的方法獲得雨生紅球藻中編碼HaePHOT的cDNA序列全長，并對HaePHOT進行生物信息分析?！窘Y(jié)果】HaePHOT的開放閱讀框全長為2139 bp，編碼712個氨基酸，預(yù)測的等電點8.66，理論分子量78.73 kD。經(jīng)BLASTP程序分析，與擬南芥來源PHOT的相似性達到58 %，與萊茵衣藻來源PHOT的相似性達到68 %。通過序列比對和結(jié)構(gòu)域分析，PHOT蛋白的典型結(jié)構(gòu)域存在于HaePHOT中，包括發(fā)色團結(jié)合和激酶結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析表明，高等植物和真核綠藻來源PHOTs來自共同祖先?！窘Y(jié)論】首次從雨生紅球藻中獲得編碼PHOT的基因序列，為下一步雨生紅球藻中PHOT的表達和功能研究奠定基礎(chǔ)，同時為解析藍光調(diào)控雨生紅球藻蝦青素合成的分子機制提供線索。

向光素；cDNA全長；結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進化；雨生紅球藻

【研究意義】向光素(phototropin, PHOT)是植物和綠藻特有的藍光受體[1-2]。PHOT由N端光感知(Light-oxygen-voltage, LOV)結(jié)構(gòu)域、Jα螺旋區(qū)和C端絲氨酸/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase, STK)結(jié)構(gòu)域組成[2-5]。其中N端光感知結(jié)構(gòu)域依次含有兩個序列極為相似的光-氧-電LOV結(jié)構(gòu)域(LOV1和LOV2)，在感知藍光信號、結(jié)合黃素單核苷酸FMN(Flavin mononucleotide)發(fā)色團及光依賴自磷酸化過程中發(fā)揮重要作用[6]；Jα螺旋區(qū)位于LOV2和C端激酶之間，大約20個保守氨基酸，可介導(dǎo)激酶(STK)與光感知(LOV)結(jié)構(gòu)域的耦合，是藍光誘導(dǎo)PHOT發(fā)生自磷酸化所必需的條件[7]；C端STK結(jié)構(gòu)域與其他蛋白互作，在藍光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用[7-9]。磷酸化、構(gòu)象改變及蛋白互作是PHOT介導(dǎo)藍光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機制，已有大量的磷酸化位點和互作蛋白被鑒定[10-13]，磷酸化的PHOT通過構(gòu)象改變激活STK激酶的活性，進而與其他蛋白互作，共同調(diào)控多種生理反應(yīng)[14-18]。擬南芥包括兩個向光素(AtPHOT1和AtPHOT2)，在功能上冗余而又不完全相同，例如AtPHOT1和AtPHOT2共同調(diào)節(jié)光形態(tài)建成、氣孔開度、葉片伸展、葉片運動及葉綠體積聚運動[19-21]。有趣的是AtPHOT1 介導(dǎo)葉綠體的積聚運動，與藍光信號強弱無關(guān)；而AtPHOT2 在低強度藍光照射時介導(dǎo)葉綠體的積聚運動，在高強度藍光照射時介導(dǎo)葉綠體的逃避運動[19-22]。盡管高等植物中藍光受體PHOT的基因克隆、功能鑒定及信號通路方面有一些研究報道，但在綠藻中的報道很少。【前人研究進展】與高等植物相比，綠藻中PHOT的功能和信號通路研究還很不完善，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)來源CrePHOT已經(jīng)完成分子克隆、序列分析及功能研究。RNA干擾實驗驗證CrePHOT參與細胞有性生活周期[23]，并能影響大量基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達，涉及捕光復(fù)合物形成、葉綠素和類胡蘿卜素的生物合成[24]。通過突變技術(shù)，表明CrePHOT調(diào)控眼點大小和細胞周期[24-26]。除此之外，通過擬南芥AtPHOT1和AtPHOT2雙突變株的恢復(fù)實驗，CrePHOT部分功能也得到了驗證，上述結(jié)果暗示綠藻和高等植物來源PHOTs的功能與作用機制較為保守[19]。團藻(Volvoxcarteri)中VcaPHOT的相關(guān)研究表明其表達與細胞的發(fā)育相關(guān)[27]。最近，海洋生境綠藻(Ostreococcustauri)中OtaPHOT相關(guān)研究表明其作用機制和功能與擬南芥存在差異[11]。目前，雨生紅球藻中未見PHOT的相關(guān)報道。雨生紅球藻，也稱紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種淡水單細胞綠藻，是目前已知蝦青素含量最高的物種，在脅迫條件(高溫、高鹽、強光和營養(yǎng)缺乏等)下蝦青素含量可達細胞干重的4 %，是極為理想的天然蝦青素來源[28]。但紅球藻中蝦青素的合成是一個誘導(dǎo)的過程，即合成與積累總是發(fā)生在不適合紅球藻細胞生物量積累的脅迫條件下，兩者之間的矛盾已成為利用紅球藻高效生產(chǎn)天然蝦青素的限制因素[29]。大量研究表明，光是影響蝦青素合成的重要因子[30-33]。并且在同等光強條件下，與自然光(白光)相比，藍光更有效誘導(dǎo)紅球藻中類胡蘿卜素羥化酶基因的表達和蝦青素的積累[34-35]。但相關(guān)基因如何被激活，作用機制不清楚。高等植物研究表明光調(diào)控類胡蘿卜素合成存在新機制：光受體介導(dǎo)的信號通路可調(diào)控類胡蘿卜素代謝相關(guān)功能基因(psy、lcyb、bch、zep和vde)在轉(zhuǎn)錄水平上的表達[36-38]。因此，可推測類似信號通路也存在于紅球藻中。開展紅球藻中PHOT功能的研究是探討上述新調(diào)控機制的理想途徑，但獲得基因序列和生物信息學(xué)分析是前提條件。【本研究切入點】本文以雨生紅球藻為研究對象，利用同源克隆與RACE結(jié)合的方法克隆HaePHOT基因的cDNA 全長，對其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化進行了分析，進一步對功能進行了預(yù)測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為該基因的功能鑒定和信號通路的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 實驗材料 本實驗所用Haematococcuspluvialisstrain Flotow 1844購自藻類和原生生物培養(yǎng)中心(Dunstaffnage Marine Laboratory)，由本實驗室保存。采用EG：JM有機培養(yǎng)基和BBM無機培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為25 μmol m-2s-1的光照強度，于(22±1) ℃，12 h/12 h的光/暗周期，靜置培養(yǎng)每天搖動2～3次。大腸桿菌(E.coil)采用Top 10為本實驗室保存。LB培養(yǎng)基，包括10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母萃取物，10 g/L NaCl，用5 M NaOH調(diào)pH至7.0～7.2，定容，高壓滅菌15～20 min。固體培養(yǎng)基加入1 %的瓊脂。

1.1.2 實驗試劑 提取RNA的試劑盒(RNAiso plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、RACE試劑盒(SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit)、PCR試劑盒(TaKaRa LATaq?)、DNA片段回收試劑盒(MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)及測序載體(pMD-18T)等均購買于寶生物公司。無水乙醇、氯仿、異丙醇等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，瓊脂糖購自Biowest 公司。

1.1.3 實驗儀器 超凈工作臺(上海博迅)、光照培養(yǎng)箱 GTOP(浙江托普儀器有限公司)、公司的電泳設(shè)備(GE)、VeriFlexTM96 PCR儀(Well Applied Biosystems)、凝膠成像儀 GelDox XR Bio(伯樂)、小型低溫高速離心機(Thermo Fisher)、Nano Drop 2000 分光光度計(賽默飛世爾科技公司)。

表1 文中用到的引物信息

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 采用Takara公司的RNAiso plus試劑盒。具體過程參考產(chǎn)品說明書。RNA 提取過程涉及到的所有耗材包括槍頭，離心管采用RNA提取專用的耗材，購自Axygen公司。其它的玻璃和瓷器包括研缽等經(jīng)過180 ℃干熱處理8 h 以上。實驗過程中保持工作臺面干凈，并用75 %酒精擦拭，操作人員穿戴實驗室，戴口罩，并及時更換1次性手套，整個操作過程中盡量減少人員流動。具體操作過程如下：①離心收集藻株，采用PBS緩沖溶液懸浮洗藻體3～5次，并及時存放于液氮中保存；②取適量的藻體，在液氮條件下迅速研磨成粉末狀，快速加入1 mL RNAiso plus，渦旋儀上震蕩均勻，室溫孵育3 min；③加入氯仿200 μl，管蓋，震蕩混勻，室溫孵育3 min；④在4 ℃條件下，12 000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上清到一新的離心管中；⑤加等體積的異丙醇，混合均勻， -20 ℃靜置30 min；⑥在4 ℃條件下，12 000 r/min 離心15 min；⑦倒掉上清，重新離心，用移液器將殘液吸出，防止 RNA 沉淀丟失；⑧用 1 mL 70 % 乙醇洗沉淀1次，4 ℃下，12 000 r/min 離心5 min；⑨室溫下晾干，大概3～5 min，加入適量DEPC 處理水，溶解；⑩采用超微量分光光度計進行定量分析，同時采用凝膠電泳儀進行電泳檢測。提取后的RNA于-80 ℃保存。

1.2.2 模板的制備 包括普通cDNA模板的制備和RACE模板制備兩大類。普通模板的制備參照TaKaRa 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行。包括基因組DNA 處理和反轉(zhuǎn)錄兩步。RACE 模板的制備參照Clontech 公司的 SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit說明書。

1.2.3 引物設(shè)計 在比較基因組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)與雨生紅球藻物種相近5株綠藻物種(C.reinhardtii,C. sp. NC64A,V.carteri,C.vulgaris, 和C. sp. C-169) 向光素PHOT基因序列比對的結(jié)果，找出高度保守的氨基酸序列，用CODEHOP軟件設(shè)計兼并引物。根據(jù)同源克隆片段設(shè)計RACE引物，獲得全長的基礎(chǔ)上設(shè)計表達框引物(表1)，引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.2.4 同源片段的獲得 以1.2.2中制備的普通cDNA為模板，結(jié)合1.2.3中設(shè)計的同源克隆引物，采用TaKaRa公司的TaKaRa LATaq?擴增體系進行PCR。反應(yīng)體系的配置按照試劑盒說明書的要求，PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min，1 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃(根據(jù)引物的退火溫度)30 s，72 ℃ 1 Kb/min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃ 保溫。循環(huán)結(jié)束后，取3 μl PCR 產(chǎn)物，用 1.2 %的瓊脂糖膠電泳檢測，根據(jù)引物位置確定目的條帶的大小，將可能的目的條帶進行膠回收，進行后續(xù)的連接、轉(zhuǎn)化及測序。

1.2.5 全長的獲得 在獲得同源克隆片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計兩端RACE引物(表1)，以1.2.2中制備的RACE cDNA為模板，根據(jù)試劑盒說明書進行兩端片段的PCR。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測、連接、轉(zhuǎn)化及挑選陽性克隆測序。

1.2.6 生物信息分析 HaePHOT基因cDNA全長序列通過軟件SeqMan software of DNAStar 7.1 (DNASTAR Inc., USA)拼接得到；序列翻譯和ORF的查找借助在線軟件(http://www.bio-soft.net/sms/)。序列鑒定通過在線BLASTP和tBLASTN程序完成，利用ClustalW軟件進行多序列比對分析。目的基因翻譯氨基酸的分子量(Mw)和等電點(pI)采用ExPASy Compute pI/Mw tool軟件預(yù)測，跨膜結(jié)構(gòu)與亞細胞定位分別采用Transmembrane Prediction Server和ChloroP 及TargetP Server分別預(yù)測。通過在線SMART和Pfam軟件進行結(jié)構(gòu)域分析，利用PhyML中的ML (Maximum likelihood) 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(模型選擇Leand Gascuel 進化模型)。

M: Marker DL2000圖1 雨生紅球藻總RNA的提取和Haephot基因克隆Fig.1 Total RNA of H. pluvialis and amplification of Haephot

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻總RNA的提取

如圖1所示，出現(xiàn)3條帶，從上往下依次是28S rRNA，18S rRNA 和5S rRNA ，前2條帶比較清晰，第3條帶模糊，說明完整性較好，沒發(fā)生明顯的降解。RNA的濃度和純度采用NanoDorp 2000微量分光光度計檢測，A260/A280在1.8～2.0，A260/A230在1.9～2.0，所得到的RNA濃度為850 ng/μl，總體積為50 μl。說明RNA質(zhì)量比較好，可以滿足后續(xù)試驗的要求。

2.2 雨生紅球藻Haephot基因cDNA序列的獲得

過同源克隆和RACE相結(jié)合方法，獲得了雨生紅球藻中編碼向光素基因的cDNA 序列(HaePHOT, NCBI 注冊號：KT354897)的全長(圖2，封三)。全長為2692 bp，編碼區(qū)2139 bp(137～2275)，編碼712個氨基酸，5′-非翻譯區(qū)(5’-untranslated region, 5’-UTR)長度為136 bp，3′-非翻譯區(qū)(3’-UTR)長度為417 bp，并帶有poly (A) 尾巴。通過BLASTP程序分析，與擬南芥來源PHOT的相似性達到58 %，與萊茵衣藻來源PHOT的相似性達到68 %。

2.3 雨生紅球藻HaePHOT的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam 軟件分析HaePHOT基本理化性質(zhì)。表明該蛋白質(zhì)分子式為(C3510H5579N971O1027S24)，開放閱讀框翻譯的氨基酸預(yù)測分子量為78.73 kD，預(yù)測的等電點為8.66。由20 種基本氨基酸組成，含量較高的氨基酸殘基是亮氨酸(Leu, 10.4 %)和纈氨酸(Val, 9.0 %)，含量較低的氨基酸殘基是色氨酸(Trp, 0.8 %)和半胱氨酸(Cys, 1.3 %)。帶正電荷氨基酸殘基85個(Arg+Lys)，帶負電荷氨基酸殘基81個(Asp+Glu)。預(yù)測該蛋白為穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)為32.75)。信號肽預(yù)測(SignalP 4)結(jié)果顯示不存在信號肽序列。DAS-TMfilte和TMHMM軟件預(yù)測目的蛋白不存在跨膜區(qū)，是可溶性蛋白。細胞定位顯示該蛋白定位細胞質(zhì)。

2.4 雨生紅球藻HaePHOT的二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(H: α-helix)、β-折疊(T: β-turn)、延伸鏈(E: Extended strand)和無規(guī)則卷曲(C: Random coil)?；谲浖OPMA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，無規(guī)則卷曲占的比例最高(35.39 %)，其次為由α-螺旋(27.95 %)，延伸鏈和β-折疊分別占25.98 % 和10.67 %。綜上所述，無規(guī)則卷曲和α-螺旋是HaePHOT 蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成，屬于混合型蛋白。

2.5 雨生紅球藻HaePHOT序列比對、保守結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點分析

利用SMART和CDD分析了HaePHOT中的保守結(jié)構(gòu)域(圖3A)。HaePHOT編碼蛋白中存在N 端的2個重復(fù)PAS亞家族結(jié)構(gòu)域(24-125和215-304)，C端的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(387-702)，上述兩大結(jié)構(gòu)域是向光素家族的典型特征。為了進一步研究PHOT蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域，對不同來源五種真核綠藻(PHOT-1，PHOT-2，PHOT-3，PHOT-4和PHOT-5)和高等植物擬南芥來源的PHOTs蛋白進行序列比對，發(fā)現(xiàn)在LOV1和LOV2中都存在結(jié)合發(fā)色團FMN保守結(jié)構(gòu)域(GXNCRFLQG)，其中C是結(jié)合FMN的活性位點(圖3B)。蛋白質(zhì)磷酸化是一種常見的翻譯后修飾，可影響蛋白質(zhì)的功能，因此磷酸化分析對研究蛋白質(zhì)的功能具有重要意義?；赟cansite 3.0 軟件分析了HaePHOT蛋白中可能的磷酸化位點(圖3C)。預(yù)測到HaePHOT 中存在12個可能的磷酸化位點，其中第1個PAS結(jié)構(gòu)域中存在4個(T23、V87、T106和T110)，第2個PAS結(jié)構(gòu)域中存在2個(P211和T293)，激酶結(jié)構(gòu)域中存在4個(T419、Y475、T543和P620)及C末端2個(P695和Y696)。

2.6 雨生紅球藻HaePHOT高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

為進一步研究Hae PHOT蛋白的高級結(jié)構(gòu)，采用同源建模方法對其高級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測。因為PHOT蛋白包括3個保守結(jié)構(gòu)域(LOV1、LOV2和STK)因此對3個保守結(jié)構(gòu)域分別進行了高級結(jié)構(gòu)研究(圖4)。結(jié)果顯示，LOV1和LOV2結(jié)構(gòu)域具有幾乎一樣的高級結(jié)構(gòu)，包括4個β-折疊和2個α-螺旋。其中結(jié)合發(fā)色團的保守半胱氨酸殘基存在于整個高級結(jié)構(gòu)的中心位置，圖4A和圖4B中的紅色圓圈標(biāo)記。LOV2與STK激酶之間通過一個大約20個氨基酸殘基的Jα螺旋區(qū)域連接，其中Jα螺旋區(qū)域是圖4C中的紅色箭頭所示。STK激酶結(jié)構(gòu)域的高級結(jié)構(gòu)與其他蛋白中STK激酶高級結(jié)構(gòu)極為相似(圖4D)，暗示phot基因的形成可能是通過不同基因的不同結(jié)構(gòu)域重新組合形成。

圖3 雨生紅球藻HaePHOT的結(jié)構(gòu)域分析、序列比對及磷酸化位點預(yù)測Fig.3 Structural domain (A), amino acid sequence alignment (B) and phosphorylation sites (C) analysis of HaePHOT

2.7 雨生紅球藻HaePHOT的起源和系統(tǒng)進化分析

在高等植物和真核綠藻中先后發(fā)現(xiàn)了PHOT蛋白，為了進一步研究不同物種來源PHOTs的起源和系統(tǒng)進化，采用PHYML軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建(圖5)。系統(tǒng)進化樹表明雨生紅球藻來源HaePHOT與其他真核綠藻(萊茵衣藻和團藻)聚為一類，并且與海洋生境的真核綠藻形成姐妹群，進而與高等植物來源的PHOTs形成單系群，并且PHOT的基因進化樹與物種之間的進化樹吻合。這些研究結(jié)果進一步暗示高等植物和真核綠藻來源PHOTs具有共同祖先，形成于真核綠藻和高等植物分枝之前。

A為LOV1結(jié)構(gòu)域部分的高級結(jié)構(gòu)；B為LOV2結(jié)構(gòu)域部分的高級結(jié)構(gòu)；C為LOV2結(jié)構(gòu)域部分(含有Jα螺旋區(qū)域)的高級結(jié)構(gòu)；D為STK激酶結(jié)構(gòu)域部分的高級結(jié)構(gòu)圖4 雨生紅球藻HaePHOT的LOV1、LOV2及STK_c結(jié)構(gòu)域的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Model of structure of LOV1, LOV2 and STK_c from HaePHOT

其中HaePHOT為黑色圓點標(biāo)記，黑色三角形代表物種特異性的種內(nèi)基因復(fù)制現(xiàn)象(基因復(fù)制發(fā)生在物種形成之后)，黑色方框代表類群特異性的基因復(fù)制現(xiàn)象(基因復(fù)制發(fā)生在物種形成之前)。不同種類物種來源的PHOTs被分類標(biāo)記(Solanum lycopersicum PHOT1和 PHOT2：NP_001234214和XP_010323569; Zygnemopsis sp. MFZO PHOTA 和PHOTB: AHZ63920和AHZ63918; Arabidopsis thaliana PHOT1和 PHOT2: PHOT1_ARATH和PHOT2_ARATH; Mesotaenium braunii PHOT: AHZ63922; Mesotaenium kramstage PHOT: AHZ63457)圖5 不同物種來源PHOTs的系統(tǒng)進化分析Fig.5 Maximum likelihood tree of PHOTs from bacteria, fungi, higher plants and green alga

3 討 論

光是環(huán)境中重要的信號因子之一，不僅為真核微藻提供能量，而且還為它們提供信息，調(diào)節(jié)其生長發(fā)育過程[8]。為適應(yīng)光強、光質(zhì)及光周期等光信息，真核微藻在漫長的進化過程中形成了一套精細的光信號接收和轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。光受體在光信號通路中發(fā)揮重要的作用，起著接收和轉(zhuǎn)化的橋梁作用。高等植物擬南芥中PHOT的研究表明，PHOT可介導(dǎo)藍光調(diào)控多種生理過程的信號通路，為真核微藻中研究PHOT的功能提供了線索[3,16,19]。

通過同源克隆和RACE結(jié)合方法獲得了雨生紅球藻中編碼PHOT的基因cDNA序列全長。HaePHOT與擬南芥來源PHOT的相似性達到58 %，與萊茵衣藻來源PHOT的相似性達到68 %，暗示該基因可能是雨生紅球藻中可能的編碼PHOT的基因。向光素PHOT蛋白由N端與發(fā)色團FMN結(jié)合的并具有藍光感知功能的光氧電結(jié)構(gòu)域(LOV1和LOV2)和C端具有激酶活性的STK_c的結(jié)構(gòu)域組成[4,7,9,13]。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，在HaePHOT中同樣存在上述3個保守結(jié)構(gòu)域，進一步暗示這個基因編碼PHOT蛋白。

光感知結(jié)構(gòu)域LOV在藍光激發(fā)下，通過發(fā)色團FMN和胱氨酸Cys3發(fā)生可逆光循環(huán)，形成共價結(jié)合物，進而誘導(dǎo)PHOT蛋白的構(gòu)象變化和激活激酶活性，最終磷酸化互作蛋白，LOV1和 LOV2對光照、氧氣及電壓差敏感[8,39-40]。GXNCRFLQG及其保守的結(jié)構(gòu)域是LOV的典型特征，其中C是發(fā)色團FMN的結(jié)合位點[40]，在HaePHOT中也發(fā)現(xiàn)了該保守區(qū)域。C 末端含有Ser/Thr蛋白激酶區(qū)域，屬于蛋白激酶家族。蛋白質(zhì)磷酸化是一種常見的翻譯后修飾，影響蛋白的活性與功能，因此磷酸化分析對研究蛋白質(zhì)的功能具有重要意義[41]。擬南芥中PHOT的研究表明，磷酸化在PHOT蛋白的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用，已經(jīng)在At PHOT1 的 C末端鑒定出了多個磷酸化位點[42]。通過磷酸化位點預(yù)測軟件，在HaePHOT蛋白中發(fā)現(xiàn)了12個可能的磷酸化位點，在任何一個保守結(jié)構(gòu)域中都有分布，這與上述研究結(jié)果一致，并為后續(xù)磷酸化機制功能研究提供了重要線索。Jα螺旋區(qū)域的功能是連接LOV2和STK激酶，起著橋梁作用，在激活激酶活性的過程中發(fā)揮重要的作用[8]，通過同源建模方法，在HaePHOT中發(fā)現(xiàn)了同樣的Jα螺旋區(qū)域，該區(qū)域與LOV2區(qū)域緊密相鄰。研究表明PHOT蛋白N端的兩個LOV結(jié)構(gòu)域不僅在氨基酸序列水平極為相似，同時具有幾乎一樣的高級結(jié)構(gòu)[19]。同源建模結(jié)果表明HaePHOT蛋白的LOV1和LOV2的高級結(jié)構(gòu)幾乎一致，與上述研究結(jié)果吻合[19]。

含有LOV結(jié)構(gòu)域蛋白介導(dǎo)的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制廣泛分布于幾乎所有的生物中[43-44]，但目前研究表明，PHOTs蛋白僅存在于高等植物和真核綠藻中，在其他類型真核微藻中并沒有發(fā)現(xiàn)。同理，含有STK激酶保守結(jié)構(gòu)域的蛋白也是廣泛存在于幾乎所有的生物中[45]，上述研究結(jié)果對編碼PHOT的基因起源和系統(tǒng)進化提出了挑戰(zhàn)。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析表明，當(dāng)真菌來源的LOV結(jié)構(gòu)域蛋白作為進化樹的根時，高等植物和真核綠藻來源PHOTs形成一個單系群，暗示他們具有共同的祖先，這與前人的研究結(jié)果相符[1]。暗示phot基因的出現(xiàn)發(fā)生在高等植物和真核綠藻分開之前，在進化過程中的不同選擇壓力條件下，出現(xiàn)了基因復(fù)制現(xiàn)象并在功能上出現(xiàn)了分工。基因復(fù)制現(xiàn)象的發(fā)生存在2種形式，一種基因復(fù)制發(fā)生在物種形成之后，另一種是物種形成之前。并且基因的出現(xiàn)是通過不同基因的LOV結(jié)構(gòu)域和STK結(jié)構(gòu)域的重新組合形成，但這種假說還需要進一步數(shù)據(jù)支持。

總而言之，上述研究結(jié)果為雨生紅球藻中HaePHOT的基因表達研究和確定其功能奠定了基礎(chǔ)。同時保守結(jié)構(gòu)域的分析和高級結(jié)構(gòu)預(yù)測為藍光信號感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)機制提供了依據(jù)，并將有助于研究PHOT在藍光信號通路中相關(guān)調(diào)控因子的作用機制。例如，雨生紅球藻是天然蝦青素的理想來源，也是目前制備蝦青素的首選藻種。多種研究表明高藍光可有效誘導(dǎo)其蝦青素的合成與積累，調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，但具體分子機制并不清楚。紅球藻中PHOT基因的表達模式如何？是否具有功能？在藍光誘導(dǎo)下，體內(nèi)的PHOT如何感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)藍光信號，并如何與其他已知的蛋白(COP1和CIBI等)互作？互作之后通過何種途徑激活下游轉(zhuǎn)錄因子的表達從而啟動紅球藻中蝦青素合成相關(guān)基因的表達，最終合成并積累蝦青素，這些問題都有待進行研究。目前，由于有關(guān)PHOT的研究主要以高等植物擬南芥為主，PHOT介導(dǎo)的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中的許多疑問沒有解決，更多參與PHOT 響應(yīng)藍光信號的轉(zhuǎn)錄因子有待進一步發(fā)現(xiàn)。雨生紅球藻中PHOT 基因的同源克隆和生物信息學(xué)分析對于今后更深入系統(tǒng)地研究PHOT 蛋白響應(yīng)藍光的分子機理有一定的參考價值。

4 結(jié) 論

獲得了雨生紅球藻中藍光受體向光素(Phototropin，PHOT)的cDNA全長序列并進行了生物信息分析。HaePHOT的開放閱讀框全長為2139 bp，編碼712個氨基酸，預(yù)測的等電點8.66，理論分子量78.73 kDa。與擬南芥來源PHOT的相似性達到58 %，與萊茵衣藻來源PHOT的相似性達到68 %。PHOT蛋白的典型結(jié)構(gòu)域存在于HaePHOT中，包括發(fā)色團結(jié)合和激酶結(jié)構(gòu)域。高等植物和真核綠藻來源PHOTs屬于共同祖先。首次從雨生紅球藻中獲得編碼PHOT的基因序列，存在與高等植物PHOT相似的結(jié)構(gòu)域，暗示其作用機制與高等植物類似，為下一步雨生紅球藻中PHOT的表達和功能研究奠定基礎(chǔ)，同時為解析藍光調(diào)控雨生紅球藻蝦青素合成的分子機制提供線索。

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GeneCloningandBioinformaticsAnalysisofNovelBluePhotoreceptorPhototropinfromGreenAlgaHaematococcuspluvialis

CUI Hong-li1, CHEN Jun2,3, WANG Lin-ping1, HU Zhang-li4, QIN Song2

(1.School of Life Science and Technology, Dalian University, Liaoning Dalian 116622,China; 2.Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resources Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Shandong Yantai 264003,China; 3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4.College of Life and Marine Science，Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology, Shenzhen University, Guangdong Shenzhen 518060, China)

【Objective】In this study, a full-length complementary DNA (cDNA) sequence of a novel blue photoreceptor phototropin (PHOT), designatedHaephot, was cloned, and the bioinformatics from the green algaHaematococcuspluvialiswas analyzed. 【Method】The homology cloning and rapid-amplification of cDNA ends (RACE) strategies were applied to obtain the sequence ofHaephot, and its sequence was analyzed. 【Result】The cloned cDNA ofHaephotcontained an open reading frame (ORF) of 2139 bp encoding a protein of 712 amino acids, and the deduced protein had a calculated molecular mass of 78.73 kD with an estimated isoelectric point (pI) of 8.66. Multiple sequence alignment analysis revealed that HaePHOT was homologs to known PHOTs, e.g.,Arabidopsisthaliana(58 %) andChlamydomonasreinhardtii(68 %). Conserved domains analysis showed that the typical catalytic motifs of the PHOT were highly conserved in the protein sequences of HaePHOT. The phylogenetic analysis of the PHOTs implied that HaePHOT had higher similarity to the PHOTs from high plants and green algae, which indicated that they share a common ancestor origin. 【Conclusion】The first identified algalphotgene from green algaHaematococcuspluvialiswas obtained, which facilitated the expression and functional investigations of PHOT-mediated signaling pathways involved in astaxanthin biosynthesis regulation.

Phototropin; Full-length of cDNA; Structure domain; Phylogeny and evolution;Haematococcuspluvialis

1001-4829(2017)12-2639-09

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.005

2017-01-04

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(2016112580 38)；國家自然基金項目(41376139)

崔紅利(1987-)，男，山西臨汾人，博士，研究方向：微藻功能基因挖掘及利用，E-mail: cuihongli@dlu.edu.cn。

S154.38+4

A

(責(zé)任編輯陳 虹)