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    PGE1對改善血管性癡呆大鼠學習記憶功能的影響及BDNF/TrkB信號通路的作用研究

    2018-01-07 23:41:20馮麗娟張素平劉博會李福滔王慕真鄧婉青
    當代醫(yī)藥論叢 2017年20期
    關鍵詞:百分比鹽水海馬

    馮麗娟,張素平,劉博會,李福滔,王慕真,何 銳,鄧婉青

    (暨南大學附屬廣州紅十字會醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

    PGE1對改善血管性癡呆大鼠學習記憶功能的影響及BDNF/TrkB信號通路的作用研究

    馮麗娟,張素平,劉博會,李福滔,王慕真,何 銳,鄧婉青

    (暨南大學附屬廣州紅十字會醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

    目的:探討前列腺素E1(PGE1)對血管性癡呆(VD)大鼠學習記憶功能的影響及BDNF/TrkB信號通路在其中的作用。方法:將48只成年雄性大鼠分為假手術組、鹽水組、PGE1組和PGE1+K252a組,每組各有12只大鼠。使用雙側頸總動脈永久性結扎法將鹽水組、PGE1組和PGE1+K252a組大鼠制成慢性腦低灌注誘導的VD大鼠模型,對假手術組大鼠的頸動脈進行鈍性分離,并使用4-0號縫線對其頸動脈進行環(huán)繞,但不進行結扎。4周后,為假手術組和鹽水組大鼠經尾部靜脈注射生理鹽水,為PGE1組大鼠經尾部靜脈注射PGE1。為PGE1+K252a組大鼠經右側腦室注射TrkB拮抗劑——K252a和DMSO(二甲基亞砜)后,為該組大鼠經尾部靜脈注射PGE1。對四組大鼠進行水迷宮實驗和條件性恐懼實驗,比較其進行這兩種實驗的結果。在光學顯微鏡下觀察四組大鼠海馬組織CA1區(qū)錐體細胞的排列情況。結果:在這四組大鼠中,假手術組大鼠的逃避潛伏期最短,鹽水組大鼠的逃避潛伏期最長(P<0.05)。PGE1組大鼠的逃避潛伏期短于PGE1+K252a組大鼠(P<0.05)。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠跨越原平臺的次數相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與鹽水組和PGE1+K252a組大鼠相比,PGE1組和假手術組大鼠跨越原平臺的次數較多(P<0.05)。PGE1組大鼠跨越原平臺的次數多于假手術組大鼠(P<0.05)。假手術組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比均大于鹽水組和PGE1+K252a組大鼠(P<0.05)。假手術組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。假手術組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細胞層的排列緊密、均勻。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細胞層的排列松散。PGE1組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細胞層的排列緊密、均勻,可見少許的脫落細胞。結論:PGE1可有效地改善VD大鼠的學習記憶功能。此作用是通過調節(jié)VD大鼠體內BDNF/TrkB信號通路來實現的。

    前列腺素E1;血管性癡呆;BDNF/TrkB信號通路

    血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)多繼發(fā)于腦動脈粥樣硬化、腦卒中等腦血管疾病。此病是一種智能障礙綜合征[1-2]。VD患者的記憶和認知功能可出現障礙。前列腺素E1(prostaglandinE1,PGE1)具有擴張血管、促進血管再生、抗血小板聚集、抗炎等多種生物學效應[3]。此藥被廣泛地應用于對心腦血管疾病患者進行治療的過程中。有動物實驗表明,PGE1可有效地促進VD大鼠海馬區(qū)神經血管的再生,進而改善其認知功能。研究發(fā)現,PGE1的這一作用機制可能與BDNF/TrkB信號通路有關[4-5]。為了探討PGE1對VD大鼠學習記憶功能的影響及BDNF/TrkB信號通路在其中的作用,筆者進行了研究。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象

    取48只成年雄性大鼠(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(粵)2013-0001),其體重為200~250 g。將這些大鼠隨機分為假手術組、鹽水組、PGE1組、PGE1+K252a組,每組各有12只大鼠。

    1.2 造模的方法

    使用雙側頸總動脈永久性結扎法使鹽水組、PGE1組和PGE1+K252a組大鼠成為VD大鼠模型[6]。對假手術組大鼠進行相同的頸動脈鈍性分離操作,并使用4-0號縫線對其頸動脈進行環(huán)繞,但不對其頸動脈進行結扎。

    1.3 給藥的方法

    在造模4周后,為假手術組和鹽水組大鼠經尾部靜脈注射1 ml的生理鹽水。按照10 ug/kg的劑量取適量的PGE1,將其加入到1 ml的生理鹽水中為PGE1組和PGE1+K252a組大鼠經尾部靜脈注射。在為PGE1+K252a組大鼠注射PGE1的前30 min,按照10μg/kg的比例取適量的含有K252a和DMSO的溶液對大鼠進行注射,注射的部位為右側腦室,注射的速度為2 ul/min。四組大鼠均連續(xù)注射7 d。

    1.4 進行水迷宮實驗(MorrisWaterMaze,MWM)的方法

    在進行藥物處理的第2 d,對四組大鼠均進行水迷宮實驗[7]。在進行水迷宮實驗時使用的水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)是由一個圓形水池、懸掛在水池正上方的攝像機、與攝像機相連的計算機三部分組成。水池的直徑約為120 cm,其深度約為50 cm。水池被周圍標著東、南、西、北四個方位的標志牌平分為四個象限。將站臺置于第三象限的中間,站臺的高度約為30 cm,其直徑約為9 cm,水面超過站臺2~3 cm。用攝像機跟蹤大鼠在水池中的運動軌跡并記錄相關的時間。進行水迷宮實驗的時間為6 d。水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗。在第1~第5 d,對四組大鼠均進行定位航行實驗。進行定位航行實驗的方法是:每天將大鼠的頭朝池壁從四個象限依次放入水池中,進行四次定位航行實驗的平均潛伏期即為該只大鼠當天的成績。每次進行定位航行實驗的時間為120 s,進行兩次定位航行實驗的間隔時間為20 min。記錄每只大鼠每次進行定位航行實驗的逃避潛伏期。逃避潛伏期是指從大鼠被放入水池中直至其爬到平臺上的這段時間。逃避潛伏期反映了大鼠的學習能力。逃避潛伏期越短,說明大鼠的學習能力越好。大鼠若超過120 s仍未找到平臺,則將其引導至平臺,使其熟悉平臺周圍的環(huán)境,并將其游泳的用時記為120 s。定位航行實驗結束后,記錄在這5 d內大鼠的平均逃避潛伏期。在第6 d,撤去平臺,在原平臺所在象限的對側將大鼠頭朝池壁放入水池中,每只大鼠進行1次空間探索實驗,將進行空間探索實驗的時間設置為120 s。將大鼠跨越原平臺的次數作為其進行空間探索實驗的成績。用跨越原平臺的次數評估大鼠對空間的記憶能力。大鼠跨越原平臺的次數越多,說明其對空間的記憶力越好。

    1.5 進行條件性恐懼實驗(ContextualandCuedFearConditio ning)的方法

    水迷宮實驗結束后,對四組大鼠均進行為期2 d的條件性恐懼實驗[8]。在進行條件性恐懼實驗的第1 d,將大鼠放到條件恐懼箱中,讓其在條件恐懼箱中自由探索2 min。通過震驚反射系統(tǒng)和計算機控制、記錄在這2 min內大鼠發(fā)生震驚反射的時間,以評估大鼠對恐懼的記憶能力。震驚反射是指大鼠除了呼吸以外沒有其他任何活動。然后,對大鼠進行30 s的聲音刺激,聲音的響度為90 db。在進行聲音刺激的最后2 s時,對大鼠進行電擊,電流為4 mA。讓大鼠在條件恐懼箱中休息90 s,對其進行聲音刺激(時間為30 s,聲音的響度為90 dB)和電擊(電流為4 mA,時間為2 s)。最后,讓大鼠休息90 s,將其從條件恐懼箱中取出。在第2 d,將大鼠放到與第1 d相同的條件恐懼箱中,讓其自由探索3 min后將其取出,記錄大鼠在這期間發(fā)生震驚反射的時間。最后,計算大鼠在進行環(huán)境及聲音刺激實驗中發(fā)生震驚反射時間的百分比。發(fā)生震驚反射時間的百分比=發(fā)生震驚反射的時間/進行環(huán)境或聲音刺激實驗的時間×100%。大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比越大,說明其對恐懼的記憶力越好。

    1.6 用光鏡觀察大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細胞排列情況的方法

    條件性恐懼實驗結束后,對四組大鼠均進行麻醉,經灌注后快速取腦。將獲取的腦組織放到4℃濃度為4%的多聚甲醛固定液中固定。在第2 d,將四組大鼠的腦組織分別放到4℃濃度為10%、20%、30%的蔗糖溶液中依次進行脫水處理。然后將大鼠腦組織制作成冰凍切片。對冰凍切片進行HE染色后,在光鏡下觀察切片中海馬CA1區(qū)錐體細胞的排列情況。

    1.7 統(tǒng)計學方法

    使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對本次研究中的數據進行處理。計量資料用均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗。計數資料用百分比(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 對四組大鼠進行水迷宮實驗結果的比較

    進行定位航行實驗的結果顯示,假手術組、鹽水組、PGE1組、PGE1+K252a組大鼠的逃避潛伏期分別為(28.5±26.5)s、(39.2±27.9)s、(30.9±25.4)s、(37.8±25.2)s。在這四組大鼠中,假手術組大鼠的逃避潛伏期最短,鹽水組大鼠的逃避潛伏期最長(P<0.05)。PGE1組大鼠的逃避潛伏期短于PGE1+K252a組大鼠(P<0.05)。詳見圖1。進行空間探索實驗的結果顯示,假手術組、鹽水組、PGE1組、PGE1+K252a組大鼠跨越原平臺的次數分別為(4.33±1.23)次、(3.83±1.27)次、(5.93±1.03)次、(3.64±1.29)次。在這四組大鼠中,鹽水組和PGE1+K252a組大鼠跨越原平臺的次數相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與鹽水組和PGE1+K252a組大鼠相比,PGE1組和假手術組大鼠跨越原平臺的次數較多(P<0.05)。PGE1組大鼠跨越原平臺的次數多于假手術組大鼠(P<0.05)。

    圖1 在進行定位航行實驗中四組大鼠逃避潛伏期的比較

    2.2 對四組大鼠進行條件性恐懼實驗結果的比較

    在第1 d,四組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在第2 d,在進行環(huán)境及聲音刺激實驗中,假手術組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比分別為(52.51±16.98)%、(77.07±14.56)%,鹽水組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比分別為(37.80±10.86)%、(53.63±15.16)%,PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百 分 比 分 別 為 (49.91±12.39)%、(73.35±13.11)%,PGE1+K252a組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比分別為(28.54±13.23)%、(45.12±28.81)%。 在 進 行 環(huán) 境 及聲音刺激實驗中,假手術組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比均大于鹽水組和PGE1+K252a組大鼠(P<0.05)。假手術組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),鹽水組和PGE1+K252a組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖2。

    圖2 四組大鼠在不同條件下發(fā)生震驚時間百分比的比較

    2.3 用光鏡觀察四組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細胞的排列情況

    假手術組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細胞層的排列緊密、均勻。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細胞層的排列松散。PGE1組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細胞層的排列緊密、均勻,可見少許的脫落細胞。如圖3。

    圖3用光鏡觀察四組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細胞的排列情況

    3 討論

    研究發(fā)現,大鼠大腦中的海馬區(qū)域(特別是 CA1區(qū))與其認知功能的關系密切。該區(qū)域中腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF,brain-derived neurotrophic factor)水平的降低是誘發(fā)血管性癡呆的重要原因[9]。BDNF廣泛表達于哺乳類動物的大腦中,是一種具有多種效用的神經營養(yǎng)因子。BDNF可促進腦神經元的修復、軸突的再生。TrkB(酪氨酸激酶受體B)是BDNF的一個具有高度親和力的受體。BDNF是通過與TrkB相結合來發(fā)揮作用[10]。另有研究發(fā)現,BDNF可調節(jié)大鼠學習、認知及情緒相關的行為[11]。此研究使調節(jié)BDNF/TrkB信號通路成為治療血管性癡呆的靶點。動物實驗證實,PGE1可上調VD大鼠體內BDNF的表達。PGE1是臨床上治療人心腦血管疾病的常用藥[12]。此藥具有增加外周血流量、調節(jié)纖溶系統(tǒng)、抑制血小板聚集、舒張血管、保護神經細胞和促進血管再生等作用。

    本次實驗的結果顯示,用PGE1對VD大鼠進行治療,可有效地改善其學習記憶功能,這與相關研究的結果相一致。與PGE1組大鼠相比,PGE1+K252a組大鼠的學習記憶功能較差。說明TrkB拮抗劑可阻礙BDNF與其受體TrkB相結合,進而降低PGE1對VD大鼠學習記憶功能的改善作用。反言之,PGE1可通過調節(jié)BDNF/TrkB信號通路來提高VD大鼠的學習記憶功能。

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    R285

    B

    2095-7629-(2017)20-0030-03

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