不同梯度NaCl脅迫對(duì)甜高粱幼苗抗氧化同工酶亞基及酶活性的影響

趙會(huì)君++李歡++劉海波

摘要： 以甜高粱品種M-81E為材料，采用水培的方法，研究鹽濃度為0、25、50、100mmol/L的脅迫處理對(duì)甜高粱幼苗抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）]同工酶亞基、酶活性以及葉片中丙二醛含量的影響。結(jié)果表明：不同濃度的鹽脅迫對(duì)甜高粱幼苗葉片中SOD、POD、CAT、APX活性的影響程度不同，SOD活性隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增大在一定范圍內(nèi)降低，而POD、CAT、APX活性卻在一定范圍內(nèi)顯著升高，表現(xiàn)為同工酶亞基條帶增多或者亮度增強(qiáng)。甜高粱幼苗葉片丙二醛含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)有上升趨勢(shì)，但不顯著。由研究結(jié)果可知，鹽脅迫對(duì)甜高粱的抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行了修飾，導(dǎo)致SOD活性下降，因此SOD并沒(méi)有起到清除過(guò)氧化物的作用，而CAT、APX和POD在甜高粱耐受鹽堿脅迫中起到重要的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞： 甜高粱；鹽脅迫；同工酶；抗氧化酶系統(tǒng)；丙二醛

中圖分類號(hào)： Q554；S514.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0089-05

寧夏地處西北內(nèi)陸，有大面積待開(kāi)發(fā)的鹽堿化土地，僅銀川北部的鹽堿化土地面積已經(jīng)達(dá)到總耕地面積的49%，這已經(jīng)成為寧夏農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要影響因素之一[1]。因此，篩選適合鹽堿地種植的作物，充分開(kāi)發(fā)利用鹽堿地，對(duì)于當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著重要的意義。甜高粱別稱糖高粱、蘆粟、甜稈等，是禾本科高粱屬一年生草本植物，為普通粒用高粱的變種，具有抗旱、耐澇、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)、生物產(chǎn)量高、糖分含量高等特點(diǎn)，對(duì)土壤的適應(yīng)能力很強(qiáng)，是名副其實(shí)的高效能植物[2-3]。再吐尼古麗·庫(kù)爾班等對(duì)甜高粱改良鹽堿地的效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明，種植甜高粱后對(duì)鹽堿地有非常明顯的脫鹽效果，種植過(guò)程中土壤鹽分含量逐漸降低，土壤養(yǎng)分含量也發(fā)生明顯的變化，其中pH值輕度降低[4]。隨著我國(guó)出臺(tái)的《中國(guó)可再生能源中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃》的推行，大力發(fā)展鹽堿地甜高粱等非糧生物質(zhì)能源作物的種植，對(duì)鹽堿化土地的有效利用以及能源危機(jī)的緩解有重大意義。

當(dāng)遭受鹽堿脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)累積較多的活性氧，若不能及時(shí)清除就會(huì)使膜系統(tǒng)受到損傷，對(duì)植物體造成不同程度的傷害甚至死亡。龔明等對(duì)鹽脅迫下大麥、小麥等葉片脂質(zhì)過(guò)氧化傷害與超微結(jié)構(gòu)的變化研究發(fā)現(xiàn)，鹽分可以增加膜的透性，增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，最終導(dǎo)致膜系統(tǒng)破壞[5]。鹽生植物或耐鹽植物在鹽堿脅迫下膜系統(tǒng)的變化過(guò)程是先被破壞，然后被修復(fù)。植物能否維持其膜系統(tǒng)的完整性，關(guān)鍵在于其修復(fù)能力大小，而膜系統(tǒng)的修復(fù)與 超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）的活性高低是分不開(kāi)的。SOD、POD、CAT及APX是植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，它們相互協(xié)調(diào)、共同作用來(lái)清除膜脂過(guò)氧化作用產(chǎn)生的活性氧和丙二醛，最終達(dá)到保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的作用[6]，抗氧化系統(tǒng)的協(xié)調(diào)作用使活性氧簇（ROS）在體內(nèi)維持較低水平，從而使植物能進(jìn)行正常生長(zhǎng)和發(fā)育。

因此，本試驗(yàn)以甜高粱品種M-81E為材料，研究不同濃度的鹽脅迫對(duì)抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性以及同工酶亞基、丙二醛（MDA）含量等生理指標(biāo)的影響，以探討甜高粱苗期耐鹽的生理機(jī)制，對(duì)甜高粱的適地種植有重要的指導(dǎo)意義，也為開(kāi)發(fā)利用鹽堿地發(fā)展生物質(zhì)能源提供品種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甜高粱品種為M-81E，由北方民族大學(xué)植物生理實(shí)驗(yàn)室提供，選取當(dāng)年產(chǎn)的籽粒飽滿、大小均勻的種子備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng)及處理 種子用自來(lái)水反復(fù)沖洗后用10%次氯酸鈉消毒10 min，常溫下用滅菌水沖洗并浸泡8 h，擺放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于27 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。等芽長(zhǎng)約為3.0 cm時(shí)，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行光照培養(yǎng)。待苗高約為5cm時(shí)，轉(zhuǎn)至自然光條件下用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每周更換1次培養(yǎng)液。

待甜高粱幼苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)，將幼苗隨機(jī)分組，設(shè)置0、25、50、100 mmol/L 4個(gè)NaCl處理梯度，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，于處理后的第2天取葉片提取可溶性總蛋白，用于同工酶電泳檢測(cè)，于處理后第3、6、12、18天稱取成熟葉片0.5 g，用于測(cè)定SOD、POD、CAT、APX活性以及丙二醛含量（鮮質(zhì)量）。

1.2.2 酶液的提取及同工酶電泳 取處理第2天的0.5 g新鮮成熟葉片，加入5 mL冰上預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值7.0），于冰浴中研磨，4 ℃、12 000 g離心20 min，收集上清液，即為酶粗提液?？扇苄钥偟鞍缀康臏y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。同工酶電泳采用北京市六一儀器廠生產(chǎn)的垂直板凝膠電泳儀，電泳時(shí)SOD、POD、CAT采用10%分離膠、5%濃縮膠，APX采用7.5%分離膠、5%濃縮膠，上樣量35 μL，預(yù)電泳10 min，濃縮膠中穩(wěn)定電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后穩(wěn)定電壓為120 V，電流為200 mA。于冰浴中電泳3～4 h，當(dāng)指示染料下行至距膠板末端1～2 cm時(shí)停止電泳。

SOD同工酶采用氮藍(lán)四唑法染色[7]，POD同工酶采用醋酸-聯(lián)苯胺法染色[8]，CAT采用淀粉法染色[9]，APX參照邵巍等的方法染色[10]。根據(jù)染色的酶譜計(jì)算相對(duì)遷移率Rf（Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離）。

1.2.3 酶液的提取及酶活測(cè)定 分別取處理3、6、12、18 d的成熟葉片0.5 g，酶液提取方法及可溶性總蛋白含量測(cè)定方法同“1.2.2”節(jié)，SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[11]，POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[11]。CAT、APX活性的測(cè)定采用吳倩等的方法[12-13]。每個(gè)處理重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用Graph Padprism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脅迫早期過(guò)氧化物同工酶電泳結(jié)果

由圖1的CAT同工酶染色檢測(cè)結(jié)果看出，與對(duì)照相比，當(dāng)受到鹽脅迫時(shí)，CAT出現(xiàn)明顯的2條帶，并且亮度、酶帶寬度明顯增加，這暗示CAT同工酶基因受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物增加。與此同時(shí)，檢測(cè)SOD的同工酶條帶，結(jié)果表明，隨著鹽脅迫濃度的增加，SOD的S1亞基條帶消失，S2、S3亞基條帶亮度減弱，這暗示高濃度的鹽脅迫抑制了SOD基因的表達(dá)。隨著鹽濃度的增加，在短時(shí)間內(nèi)APX的A3條帶亮度也逐漸增加，并且出現(xiàn)1條較為模糊的條帶A2，這也顯示相關(guān)基因受到鹽脅迫誘導(dǎo)。POD染色結(jié)果顯示，在短時(shí)間處理下，POD同工酶出現(xiàn)6條比較明顯的條帶，這6條帶的亮度都隨著脅迫濃度的增加而加深，尤其是P1、P2條帶亮度和寬度增加比較明顯，表明這2個(gè)亞基基因?qū)aCl脅迫更加敏感，能在短時(shí)間內(nèi)受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。

2.2 不同處理濃度和時(shí)間下4種抗氧化酶的活性

2.2.1 不同處理濃度和時(shí)間下SOD活性的變化 SOD是重要的抗氧化酶，能夠清除活性氧從而防止H2O2的生成，其活性的高低能反映植物耐受逆境環(huán)境的能力。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，脅迫初期，低濃度的鹽脅迫在一定程度上能夠刺激SOD活性增強(qiáng)，由圖2可見(jiàn)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增大，SOD處于被抑制狀態(tài)，尤其是第18天，對(duì)SOD的抑制達(dá)到顯著水平（P<0.05），通過(guò)同工酶電泳試驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)論，說(shuō)明在高濃度的鹽脅迫下，SOD并沒(méi)有起到抗氧化保護(hù)作用，可能因?yàn)辂}脅迫產(chǎn)生的過(guò)氧化產(chǎn)物為H2O2。

2.2.2 不同處理濃度和實(shí)踐下POD的活性 POD是植物體內(nèi)清除H2O2的重要抗氧化酶之一，也是植物受到傷害的重要指標(biāo)。從圖3可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度的鹽脅迫都會(huì)使POD的酶活性顯著升高，在處理第3天，100 mmol/L NaCl使POD活性極顯著升高（P<0.01），而在處理第6天，25、50、100 mmol/L NaCl使POD活性極顯著升高（P<0.01或P<0.001），說(shuō)明POD活性的急劇上升，是甜高粱耐受鹽堿脅迫的重要標(biāo)志，POD也是參與清除過(guò)氧化物質(zhì)的重要抗氧化酶之一。

2.2.3 不同處理濃度和時(shí)間下CAT的活性 由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照相比，當(dāng)遭受鹽堿脅迫后的第3天，CAT活性開(kāi)始上升但變化不顯著，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT活性隨鹽濃度的升高不斷上升，處理第6天發(fā)現(xiàn)，不同濃度NaCl使CAT活性與對(duì)照的差異達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），這一顯著上升現(xiàn)象一直持續(xù)到處理的第18天。

2.2.4 不同處理濃度和時(shí)間下APX的活性變化 由圖5可見(jiàn)，在50、100 mmol/L NaCl處理第3天，APX活性與對(duì)照相比 [CM（25]達(dá)到極顯著差異（P<0.01、P<0.001）。 處理第18天，3個(gè)處理都使APX活性顯著升高。由于APX具有清除H2O2的能力，APX活性的極顯著升高說(shuō)明鹽堿脅迫導(dǎo)致甜高粱體內(nèi)產(chǎn)生了較多的H2O2，提示APX對(duì)甜高粱的過(guò)氧化物清除起到重要作用。

2.3 不同處理濃度和天數(shù)下葉片中MDA含量

MDA是植物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量越高表明受氧化損傷的程度越大。圖6結(jié)果顯示，在脅迫第3天，25、50 mmol/L NaCl脅迫并沒(méi)有使甜高粱體內(nèi)的MDA含量上升，相反，100 mmol/L NaCl脅迫處理卻使MDA含量極顯著下降（P<0.01）；在處理的第6天、第12天，MDA含量都沒(méi)有顯著改變，在處理的第18天，100 mmol/L NaCl卻使MDA含量顯著上升（P<0.05）。分析其原因，可能是在脅迫早期，隨著鹽濃度升高，甜高粱體內(nèi)抗氧化酶活性升高，從而使脂質(zhì)過(guò)氧化程度降低，MDA含量也降低，當(dāng)脅迫時(shí)間延長(zhǎng)以及SOD被顯著抑制，導(dǎo)致H2O2不能及時(shí)被清除，因此對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，使MDA含量升高。

3 討論

關(guān)于鹽脅迫對(duì)植物的傷害機(jī)制的研究已有較多報(bào)道，主要表現(xiàn)在形態(tài)、生理生化指標(biāo)的改變等方面[14]。孫方行等對(duì)刺槐進(jìn)行3、17 d鹽脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，MDA含量和細(xì)胞膜透性存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，葉綠素濃度和可溶性蛋白含量也存在極顯著相關(guān)關(guān)系，SOD活性和葉綠素濃度呈負(fù)相關(guān)[15]。吳成龍等對(duì)堿脅迫對(duì)菊芋幼苗生長(zhǎng)及其光合作用、抗氧化作用的影響進(jìn)行研究得出：在0.2%Na2CO3脅迫下，菊芋葉片SOD、POD和CAT活性均比正常生長(zhǎng)條件下的增強(qiáng)[16]。植物耐受鹽堿脅迫的主要過(guò)程就是減輕脂質(zhì)過(guò)氧化作用和增強(qiáng)抗氧化物酶保護(hù)作用，SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，有研究表明，植物的抗逆能力與SOD活性的高低有顯著的相關(guān)性，而在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD同工酶亞基處于被抑制狀態(tài)，活性下降，此結(jié)論與姜慧等關(guān)于鹽脅迫對(duì)甜高粱幼苗抗氧化酶活性影響的研究結(jié)果[17]一致，表明在甜高粱耐受鹽脅迫過(guò)程中SOD并沒(méi)有起到主要的抗氧化保護(hù)作用，因此體內(nèi)的H2O2物質(zhì)可能是氧化損傷的主要物質(zhì)之一。POD是植物體內(nèi)活性較高的酶，一般在幼嫩的組織中活性較低，在老化的組織中活性較高，能夠反映植物生長(zhǎng)發(fā)育的特性、體內(nèi)代謝狀況以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性。在本試驗(yàn)中，POD酶亞基在脅迫早期電泳條帶亮度就已經(jīng)明顯提高，可見(jiàn)其酶活性呈明顯升高趨勢(shì)，說(shuō)明POD在甜高粱耐受鹽脅迫的過(guò)程中起到抗氧化保護(hù)作用。CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，起到清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫的作用，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害。在本試驗(yàn)中，由于CAT酶亞基脅迫早期條帶數(shù)、亮度就增加，整個(gè)脅迫過(guò)程中酶活性都呈增加趨勢(shì)，這使甜高粱體內(nèi)的H2O2得到及時(shí)的清除，此試驗(yàn)結(jié)果與吳倩的研究結(jié)果[12]相似。APX是一種含銅的酶，能催化抗壞血酸（ASA）氧化，具有抗衰老等功能，在植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝中起重要作用。POD、CAT、APX等酶活性的顯著或極顯著上升，對(duì)于清除這些過(guò)氧化物質(zhì)起到重要的作用。因此可見(jiàn)，鹽脅迫改變了甜高粱抗氧化酶系統(tǒng)的活性。