MCT1和LDHB在荷乳腺癌小鼠髓系抑制性細(xì)胞中的表達(dá)及意義

藍(lán)瑞隆，張 娜，陳瑞慶

(1．福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；2.福建省個(gè)體化主動(dòng)免疫治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；3．福建省血液病研究所 福建省血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州 350001)

論著

MCT1和LDHB在荷乳腺癌小鼠髓系抑制性細(xì)胞中的表達(dá)及意義

藍(lán)瑞隆1,2，張 娜3，陳瑞慶1,2

(1．福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；2.福建省個(gè)體化主動(dòng)免疫治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；3．福建省血液病研究所 福建省血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州 350001)

目的比較正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓中髓系抑制性細(xì)胞(MDSCs)的含量，探討其產(chǎn)生免疫抑制功能的可能機(jī)制。方法建立荷乳腺癌小鼠模型，利用BD FACSAria Ⅲ流式分選儀分選正常小鼠組和荷乳腺癌小鼠組骨髓中的MDSCs(CD11b+Gr-1+)，比較其含量；q-PCR法檢測(cè)兩組MDSCs中MCT1及LDHB的mRNA水平。結(jié)果荷乳腺癌小鼠骨髓中MDSCs的比例為(48.92±3.13)%高于正常小鼠(25.13±1.95)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；荷乳腺癌小鼠MDSCs中MCT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.010±0.005)為正常小鼠(0.003±0.001)的3.33倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；荷乳腺癌小鼠MDSCs中LDHB的mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.008±0.002)為正常小鼠(0.004±0.001)的2.00倍，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)論MDSCs在荷乳腺癌小鼠骨髓中的比例顯著高于正常小鼠，其能量代謝關(guān)鍵分子MCT1、LDHB的表達(dá)也顯著高于正常小鼠。MDSCs的能量代謝特點(diǎn)可能正是其發(fā)揮免疫抑制功能的重要基礎(chǔ)。

MDSC； MCT1；LDHB；能量代謝；免疫抑制

髓系抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是骨髓來(lái)源的具有異質(zhì)性的細(xì)胞亞群，是巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或粒細(xì)胞的前體，在腫瘤、感染、炎癥等病理?xiàng)l件下具有負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的功能[1-3]。在腫瘤患者中，MDSCs可在IL-6、GM-CSF和 IL-1β等細(xì)胞因子的作用下，從骨髓遷移并募集至腫瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶。MDSCs主要通過(guò)產(chǎn)生精氨酸酶1(arginase-1，ARG1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等效應(yīng)分子發(fā)揮免疫抑制功能[4-9]，既能抑制天然免疫反應(yīng)，又能抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

能量代謝對(duì)于細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用，各項(xiàng)生物學(xué)功能依賴能量代謝水平的支持。單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(monocarboxylate transporter 1， MCT1) 是一種膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將胞外的乳酸攝入到胞內(nèi)，從而使得機(jī)體局部微環(huán)境的乳酸水平降低；乳酸脫氫酶B(lactate dehydrogenase B， LDHB)催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底氧化分解[10-11]。已有許多報(bào)道證明MDSCs細(xì)胞亞群在許多人類腫瘤微環(huán)境中均大量擴(kuò)增，在許多荷瘤小鼠中也大量存在。本研究從荷乳腺癌小鼠骨髓中分選出MDSCs(CD11b+Gr-1-)，并檢測(cè)其MCT1、LDHB的 mRNA水平，初步探討MDSCs產(chǎn)生免疫抑制功能的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與耗材

q-PCR檢測(cè)試劑盒和RNA提取試劑盒均購(gòu)自Promega； PE-anti-Mouse CD11b Antibody(Cat. # 101207)和FITC-anti-Mouse Gr-1 Antibody (Cat. # 108405)均購(gòu)自Biolegend；BALB/c小鼠購(gòu)自上海萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 方法與步驟

1.2.1 乳腺癌動(dòng)物模型建立：購(gòu)買4～6周齡的雌性BALB/c小鼠，飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1(3×106)接種于腹部皮下脂肪墊，建立小鼠乳腺癌原位模型。約2周后，可見(jiàn)直徑約(13.00±2.00)mm大小的腫瘤。

1.2.2 分選小鼠骨髓中的MDSCs： 頸椎脫臼處死小鼠，取6只荷乳腺癌小鼠和6只正常小鼠后肢股骨和脛骨，去兩端膨大的關(guān)節(jié)頭至露出紅色骨髓，用1 mL注射器吸取生理鹽水沖出骨髓細(xì)胞。按照使用說(shuō)明將PE-anti-Mouse CD11b Antibody和FITC-anti-Mouse Gr-1 Antibody 同時(shí)標(biāo)記骨髓細(xì)胞，4 ℃孵育約40 min后離心棄上清，按約1.0×107/mL密度加入生理鹽水重懸骨髓細(xì)胞，采用BD FACSAria Ⅲ分選出MDSCs(CD11b+Gr-1+)細(xì)胞亞群。

1.2.3 q-PCR檢測(cè)MCT1、 LDHB的mRNA水平：參照試劑盒說(shuō)明書提取分選出的MDSCs總RNA，利用ABI 7500 Real Time PCR System 行q-PCR檢測(cè)。所需引物序列如下：MCT1(101 bp)：F-5'-TGTGACCCACGACATCCAAA-3'，R-5'- TGAACACCCGGTAGGTTTTCC-3'；LDHB(102 bp)為：F-5'-ATTGCGTCCGTTGCAGATG-3'，R-5' -TCCCAGAATGCTGATG-GCA-3'；同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參β-Actin(138 bp)：F-5'-ATGGAATCC- TGTGGCATCCAT-3'，R-5'-TCCTGCATCCTGTCAGCAATG-3'。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s ，35循環(huán)，采用2-ΔCt法計(jì)算各樣本的MCT1和LDHB mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 流式分選結(jié)果

圖1為正常小鼠和和荷乳腺癌小鼠骨髓中MDSCs(CD11b+Gr-1+)的分選結(jié)果示意圖。

荷乳腺癌小鼠骨髓中MDSCs的比例(48.92±3.13)%是正常小鼠(25.13±1.95)%的1.95倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖2。

2.2 骨髓MDSCs中MCT1的mRNA水平

荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中MCT mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(0.010±0.005)是正常小鼠(0.003±0.001)的3.33倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖3。

2.3 骨髓MDSCs中LDHB的 mRNA水平

荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中LDHB mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(0.008±0.002)是正常小鼠(0.004±0.001)的2.00倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖4。

3 討 論

MDSCs是源自骨髓祖細(xì)胞和未成熟髓細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞亞群。正常生理狀態(tài)下，可以分化為成熟的粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮正常的免疫功能[1-3]。在病理狀態(tài)(如腫瘤、感染、炎癥等)下，該群細(xì)胞成熟受阻，停留在各個(gè)不完全分化階段，成為具有免疫抑制功能的MDSCs。已有許多報(bào)道證實(shí)，MDSCs在許多腫瘤(如乳腺癌、卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌等)微環(huán)境中大量存在，和T-reg等組成機(jī)體免疫負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞，這是許多腫瘤預(yù)后不良的重要原因之一。

圖1 流式分選正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCsFig 1 FACS for MDSCs from bone marrow of normal and tumor bearing mice

***與正常組比較，P<0.001圖2 正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓細(xì)胞中MDSCs的含量Fig 2 MDSC ratios from bone marrow of normal and tumor bearing mice

*與正常組比較，P<0.05圖3 正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中MCT mRNA的表達(dá)水平Fig 3 MCT mRNA levels in MDSCs from bone marrow of normal and tumor bearing mice

**與正常組比較，P<0.01圖4 正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中LDHB mRNA的表達(dá)水平Fig 4 LDHB mRNA levels in MDSCs from bone marrow of normal and tumor bearing mice

能量代謝涉及細(xì)胞生命活動(dòng)的各個(gè)方面，深入了解MDSCs的能量代謝特點(diǎn)有助于揭示其如何發(fā)揮免疫抑制功能，但國(guó)內(nèi)外鮮有相關(guān)研究。腫瘤細(xì)胞的快速增殖消耗了大量的葡萄糖，能源物質(zhì)相對(duì)匱乏的腫瘤微環(huán)境對(duì)浸潤(rùn)其中的各種細(xì)胞是不利的；同時(shí)，也導(dǎo)致局部微環(huán)境大量乳酸堆積，這將不利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

前期，課題組成員的研究結(jié)果表明[12]：鼻咽癌病人外周血中的MDSC數(shù)量顯著高于正常人，且其能量代謝的重要分子MCT1也顯著高于正常人。但是該研究的缺陷在于：正常人和鼻咽癌病人的身體狀況較為復(fù)雜，這必定造成較大的異質(zhì)性，且正常人血液MDSCs的比例相對(duì)較低，這都不利于我們后續(xù)探索性實(shí)驗(yàn)的開展。因此，在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在動(dòng)物模型上進(jìn)行探討。本研究結(jié)果表明：荷乳腺癌小鼠MDSCs 比例顯著高于正常小鼠，同時(shí)其MCT1的表達(dá)顯著高于正常小鼠，這與前期[12]在鼻咽癌病人外周血中得到的結(jié)果相似。可以推測(cè)：正是由于MDSCs高表達(dá)MCT1，可將大量的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，腫瘤局部微環(huán)境中大量堆積的乳酸反而成了MDSCs重要的能源物質(zhì)， MDSCs細(xì)胞表面的MCT1分子可能是乳酸的關(guān)鍵“清道夫”[13-14]。當(dāng)然，乳酸被攝入后在胞內(nèi)不斷堆積也不利于MDSCs各項(xiàng)生物學(xué)功能的發(fā)揮，我們的研究表明：荷乳腺癌小鼠MDSCs的LDHB表達(dá)顯著高于正常小鼠，這將很好的緩解了胞內(nèi)的乳酸堆積，LDHB可將胞內(nèi)的乳酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)而被徹底氧化分解，提供各項(xiàng)生命活動(dòng)所需的ATP。在局部腫瘤微環(huán)境中能源物質(zhì)缺乏的情況下，MDSCs或許就是憑借高表達(dá)MCT1攝入大量堆積的乳酸，并由LDHB將后者進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成丙酮酸后最終徹底氧化分解。正因如此，與正常小鼠相比，荷乳腺癌小鼠MDSCs不僅在數(shù)量上占據(jù)巨大優(yōu)勢(shì)，其代謝特點(diǎn)使其能夠利用乳酸作為能源物質(zhì)更好地發(fā)揮免疫抑制作用，而腫瘤微環(huán)境乳酸的降低也將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果提示：從能量代謝的角度靶向消除或抑制MDSCs的免疫抑制功能將是一個(gè)不錯(cuò)的思路。

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ExpressionandsignificanceofMCT1andLDHBinMDSCsfrombonemarrowofbreastcancerbearingmice

LAN Ruilong1,2, ZHANG Na3, CHEN Ruiqing1,2

(1.CentralLaboratoryoftheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China; 2.FujianKeyLaboratoryofIndividualizedActiveImmunotherapy,Fuzhou350005,China; 3.FujianInsituteofHematology,FujianProvincialKeyLaboratoryonHematology,FujianMedicalUniversityUnionHospital,Fuzhou350001,China)

ObjectiveTo test the MDSCs ratios in bone marrow from normal and breast cancer bearing mice, and compare the mRNA levels of the key energy metabolism molecules-MCT1/LDHB and explore the possible mechanism of immunosuppression in MDSCs.MethodsMDSCs (CD11b+Gr-1+) in bone marrow was sorted by BD FACSAriaⅢ. MCT1/LDHB mRNA levels were detected with q-PCR.ResultsThe MDSCs ratio (19.77±4.77)% in breast cancer bearing mice was much higher than that (0.84±0.18)% in normal group (P<0.001).Both MCT1 and LDHB mRNA of MDSCs in tumor bearing group were significantly higher than that in normal group (P<0.05 andP<0.01, respectively).ConclusionsThe energy metabolism could play an role in the immunosuppression of MDSCs.

MDSC; MCT1; LDHB; energy metabolism; immunosuppression

福建省衛(wèi)計(jì)委青年課題(2016-1-60)；2016年福建醫(yī)科大學(xué)啟航基金(2016QH042)

藍(lán)瑞隆(1986-)，男，研究實(shí)習(xí)員。E-mail：lanruilong123@126.com

陳瑞慶，助理研究員。E-mail: crq209ted@163.com

10.11724/jdmu.2017.06.03

R73

A

1671-7295(2017)06-0532-04

藍(lán)瑞隆，張娜，陳瑞慶.MCT1和LDHB在荷乳腺癌小鼠髓系抑制性細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(6)：532-535.

2017-09-01；

2017-11-02)