TGF-β對(duì)胃癌細(xì)胞干性因子Oct4、Nanog表達(dá)的影響及機(jī)制

李欣，庹必光,文國(guó)容，金海，安家興，王乾興，謝睿

(1遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義563000；2貴州省消化病研究所；3遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

TGF-β對(duì)胃癌細(xì)胞干性因子Oct4、Nanog表達(dá)的影響及機(jī)制

李欣1,2，庹必光2，3,文國(guó)容2,3，金海2,3，安家興2,3，王乾興1，謝睿2,3

(1遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義563000；2貴州省消化病研究所；3遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的探討TGF-β對(duì)胃癌細(xì)胞干性因子Oct4、Nanog表達(dá)的影響。方法將培養(yǎng)的胃癌MKN45細(xì)胞分為對(duì)照組、TGF-β(10 ng/mL)組和TGF-β+BAPTA-AM組，對(duì)照組不進(jìn)行任何處理，其余兩組分別采用相應(yīng)試劑刺激24 h。采用qRT-PCR、Western blotting技術(shù)檢測(cè)胃癌相關(guān)干性因子Nanog、Oct4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。高速離子成像系統(tǒng)檢測(cè)加入正常的PSS液(空白對(duì)照組)、加入TGF-β(20 ng/mL)(單獨(dú)TGF-β組)及加入TGF-β+BAPTA-AM (聯(lián)合組)作用后胃癌細(xì)胞MKN45內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，TGF-β組Nanog和Oct4 mRNA及蛋白的表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)，與TGF-β組比較，TGF-β+BAPTA-AM組Nanog和Oct4 mRNA及蛋白的表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)。與空白對(duì)照組比較，TGF-β組細(xì)胞內(nèi)鈣增加(P<0.05)；與單獨(dú)TGF-β組比較，聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)鈣減少(P<0.05)。結(jié)論TGF-β可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度而使胃癌細(xì)胞干性因子Oct4、Nanog的表達(dá)增強(qiáng)。

胃癌；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β； 腫瘤細(xì)胞干性因子；Nanog

胃癌是消化道最常見(jiàn)惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和病死率都極高。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的治療藥物不能殺死腫瘤干細(xì)胞。目前已知促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性功能的基因主要有Oct4、Nanog和CD44等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)是公認(rèn)的調(diào)節(jié)腫瘤干性的細(xì)胞因子[1]。TGF-β在多種消化道腫瘤如食管癌、胃癌、肝癌、大腸癌等的侵襲、轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)腫瘤的細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮了重要作用。研究證實(shí)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)重構(gòu)被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的關(guān)鍵事件。有文獻(xiàn)報(bào)道，在多種腫瘤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，Ca2+參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，而P物質(zhì)可以顯著升高胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而作用于胃癌細(xì)胞，調(diào)控其發(fā)生發(fā)展[2,3]；并且細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)活化和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞密切相關(guān)[4]。但是，目前有關(guān)TGF-β是否可以參與調(diào)控胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣活化，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞干性因子表達(dá)鮮有報(bào)道。2016年8月～2017年7月，本試驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)探討，為胃癌的發(fā)病機(jī)制提供相關(guān)理論基礎(chǔ)和研究線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 材料及其來(lái)源 胃癌MKN45細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。人胃癌細(xì)胞系MKN45為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，用含10%的牛血清、1%雙抗(含青霉素、鏈霉素)的MEM培養(yǎng)基于50 mL培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)用已高壓滅菌過(guò)的PBS洗1～2次，用含0.25%的豬胰蛋白酶、0.02% EDTA、酚紅，不含鈣鎂離子的消化液對(duì)其進(jìn)行消化，按1∶4的比例傳代，每隔2～3 d換液1次，5～7 d傳代1次。37 ℃、5% CO2條件下生長(zhǎng)。試劑與藥品：MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物公司，一抗(β-actin、Nanog、Oct4)和二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(山羊抗兔)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，BAPTA-AM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TGF-β購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)lua-2鈣熒光染料購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司， ECL發(fā)光劑Western blotting Substract Reagent購(gòu)自上海復(fù)泰生物公司。實(shí)驗(yàn)儀器：高速低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorff公司，全波段酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司，熒光定量PCR儀、ChemiDocTMTouch Imaging System 購(gòu)自美國(guó)百樂(lè)公司。

1.2 細(xì)胞分組及處理 MKN45細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TGF-β組和TGF-β+BAPTA-AM組，對(duì)照組不進(jìn)行任何處理,其余兩組分別用TGF-β(10 ng/mL)、 TGF-β(10 ng/mL)+BAPTA-AM(5 μmol/mL)作用24 h。

1.3 MKN45細(xì)胞中干性因子Nanog和Oct4 mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。按照TRAN說(shuō)明書(shū)提取MKN45細(xì)胞總mRNA。采用Easy ScriptR One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)Primer Bank 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工公司合成。Nanog基因上游引物：5′- TCTTCCTAACAAGACAACTTTGG-3′，下游引物：5′-TTGTTCCAGGTCGGCCATCACGC-3′；Oct4基因上游引物：5′-TATTCAGCCAAACGACCATCT-3′，下游引物：5′-TTGTTCCAGGTCGGCC ATCACGC-3′；GAPDH基因上游引物：5′-TATCGTGGAAGGCCTAT-3′，下游引物：5′-CACAGTTTCGGCATTCT-3′。使用TipGreen qPCR SuperMix 擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40～45 個(gè)循環(huán)。每次反應(yīng)過(guò)程結(jié)束均進(jìn)行溶解曲線(xiàn)、溶解峰和擴(kuò)增曲線(xiàn)的分析，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MKN45細(xì)胞中干性因子Nanog和Oct4蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blotting法。收集MKN45細(xì)胞置于1.5 mL EP管中，加入4 ℃已預(yù)冷的RIPA裂解液1 mL，離心(4 ℃，12 000 r/min，30 min),根據(jù)BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。95 ℃，蛋白變性5 min,以十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳80 V分離蛋白30 min，然后110 V繼續(xù)分離蛋白約30 min。采用半干轉(zhuǎn)儀器轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1.5 h，然后孵育一抗(β-actin 1∶3 000，Nanog 1∶1 000，Oct4 1∶1 000 )，4 ℃搖床過(guò)夜。于次日，30 min復(fù)溫后，TBST洗3次，每次10～15 min。二抗山羊抗兔(1∶5 000)常溫?fù)u床孵育1 h后，再次洗膜，同前述。ECL發(fā)光劑按說(shuō)明書(shū)操作，以ChemiDocTMTouch Imaging System 進(jìn)行曝光后β-actin為內(nèi)參，用Image Lab軟件分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白條帶的灰度值,并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 MKN45細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的測(cè)定 采用高速離子成像系統(tǒng)。將消化好的MKN45細(xì)胞以2×104/mL接種密度接種于24 mm×24 mm的載玻片上，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h待貼壁，至生長(zhǎng)狀態(tài)良好。按說(shuō)明書(shū)配制Fura-2鈣熒光染料和PSS液(pH 7.4)。取出培養(yǎng)好的細(xì)胞，以Fura-2鈣熒光染料室溫避光孵育1 h。上機(jī)觀(guān)察：打開(kāi)灌流系統(tǒng)，在0～200 s給予正常的PSS液(空白對(duì)照組)待鈣熒光基線(xiàn)平穩(wěn)后，關(guān)閉灌流系統(tǒng)，給予細(xì)胞TGF-β(20 ng/mL)(單獨(dú)TGF-β組)預(yù)孵100 s后，開(kāi)啟灌流系統(tǒng)，在200～400 s持續(xù)動(dòng)態(tài)刺激，觀(guān)察單獨(dú)TGF-β組刺激后胃癌MKN45細(xì)胞內(nèi)鈣濃度(即細(xì)胞作用強(qiáng)度)的變化。在400～600 s的時(shí)間范圍內(nèi)給予TGF-β和BAPTA-AM(5 μmol/mL)共同刺激胃癌MKN45細(xì)胞(聯(lián)合組)，刺激方法與單獨(dú)TGF-β組方法相同。結(jié)果以GraphPad 5.0 軟件分析對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)刺激組的細(xì)胞作用強(qiáng)度的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 各組干性因子Nanog、Oct4 mRNA及蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組干性因子Nanog、Oct4 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與TGF-β組比較，#P<0.01。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化 空白對(duì)照組胃癌MKN4細(xì)胞無(wú)明顯反應(yīng)，作用強(qiáng)度平均在1.561；單獨(dú)TGF-β組細(xì)胞內(nèi)鈣濃度瞬時(shí)升高，作用強(qiáng)度平均在4.631；聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)鈣無(wú)明顯反應(yīng)，作用強(qiáng)度平均在0.034。與空白對(duì)照組及聯(lián)合組比較，單獨(dú)TGF-β組細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高 (P均<0.05)，其余兩組間比較，P>0.05。

3 討論

胃癌腫瘤干細(xì)胞的存在是胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)鍵。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體，具有無(wú)限自我更新能力和多向分化的潛能。在腫瘤進(jìn)展期，腫瘤干細(xì)胞一旦被激活，則可通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。成熟腫瘤的逆分化是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的又一個(gè)可能的來(lái)源。研究證實(shí)，一些因素可以參與調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的生理功能，例如，腫瘤細(xì)胞微環(huán)境、炎癥因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞內(nèi)外pH、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子等，而細(xì)胞因子中的TGF-β尤為重要[5]。研究證實(shí)，TGF-β在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。TGF-β與其特異性的受體結(jié)合后可以激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子[6]，進(jìn)而促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞的生物學(xué)行為。近年，研究者們發(fā)現(xiàn)在肺癌和食管癌細(xì)胞，TGF-β可以通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及干性相關(guān)因子如Oct4、Nanog、Sox2 和 CD133的表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的成球成瘤能力，進(jìn)而促進(jìn)肺癌和食管癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[7，8]。Cheng等[9]研究顯示，SOC型鈣通道參與了TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞的形成。

Nanog和Oct4是干細(xì)胞核心干性轉(zhuǎn)錄因子[10]，具有自我更新和多能性，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲、腫瘤干性以及腫瘤免疫逃避等方面發(fā)揮了重要作用[11，12]。Ho等[13]研究表明，在乳腺癌、大腸癌等腫瘤細(xì)胞中Nanog的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)黏著斑激酶(FAK)的表達(dá)，而在Nanog的siRNA沉默后可減少FAK的表達(dá)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展，而Nanog的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲程度。Nanog、Oct4、Sox2可作用于腫瘤干細(xì)胞并影響Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中，TGF-β可以誘導(dǎo)胃癌干性因子Nanog、Oct4 mRNA和蛋白的表達(dá)增加。提示TGF-β可以調(diào)控胃癌的干性，并在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使和離子通道，參與調(diào)控了體內(nèi)重要的生命活動(dòng)。細(xì)胞內(nèi)鈣的增高主要有兩種來(lái)源：細(xì)胞外鈣的內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。對(duì)于膜上的鈣通道有多種，如SOC型鈣通道、VGCC鈣通道、磷脂酶C通道等。這些鈣通道具有選擇性和開(kāi)放性的特點(diǎn)，在某些特定的條件下發(fā)揮不同的作用。既往研究報(bào)道，TGF-β通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的鈣依賴(lài)PKC途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞中10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物的減少進(jìn)而參與了促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲[14]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β刺激胃癌細(xì)胞后可以使胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，提示TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞干性因子表達(dá)可以通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)活化來(lái)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，TGF-β促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣的增加從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞干性因子Nanog、Oct4的表達(dá)上調(diào)，這為腫瘤的治療和開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物提供了線(xiàn)索，具有廣闊的前景。但除此之外，是否還有其他作用機(jī)制的參與，目前尚不清楚，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1] Pirozzi G, Tirino V, Camerlingo R, et al. Epithelial to mesenchymal transition by TGF-β1induction increases stemness characteristics in primary non small cell lung cancer cell line[J]. PLoS One, 2011,6(6):e21548.

[2] Mahdi SH, Cheng H, Li J, et al. The effect of TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition on the expression of intracellular calcium-handling proteins in T47D and MCF-7 human breast cancer cells[J]. Arch Biochem Biophys, 2015,583:18-26.

[3] 管臣,張洪偉,王為忠,等.P物質(zhì)對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2008,15(1):8-11.

[4] Wee S, Niklasson M, Marinescu VD, et al. Selective calcium sensitivity in immature glioma cancer stem cells[J]. PLoS One, 2014,9(12):e115698.

[5] Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H. Transforming growth factor β1(TGFβ1) in physiology and pathology[J]. Endokrynol Pol, 2013,64(5):384-396.

[6] Colak S, Ten DP. Targeting TGF-β signaling in cancer[J]. Trends Cancer, 2017,3(1):56-71.

[7] Santaliz-Ruiz LE, Xie X, Old M, et al. Emerging role of nanog in tumorigenesis and cancer stem cells[J]. Int J Cancer, 2014,135(12):2741-2748.

[8] Yue D, Zhang Z, Li J, et al. Transforming growth factor-beta1 promotes the migration and invasion of sphere-forming stem-like cell subpopulations in esophageal cancer[J]. Exp Cell Res, 2015,336(1):141-149.

[9] Cheng H, Wang S, Feng R. STIM1 plays an important role in TGF-β-induced suppression of breast cancer cell proliferation[J]. Oncotarget, 2016,7(13):16866-16878.

[10] Saunders A, Dan L, Faiola F, et al. Context-dependent functions of NANOG phosphorylation in pluripotency and reprogramming[J]. Stem Cell Reports, 2017,8(5):1115-1123.

[11] King HW, Klose RJ. The pioneer factor OCT4 requires the chromatin remodeller BRG1 to support gene regulatory element function in mouse embryonic stem cells[J]. Elife, 2017,13(6):e22631.

[12] Karwackineisius V, Gke J, Osorno R, et al. Reduced Oct4 expression directs a robust pluripotent state with distinct signaling activity and increased enhancer occupancy by Oct4 and Nanog[J]. Cell Stem Cell, 2013,12(5):531.

[13] Ho B, Olson G, Figel S, et al. Nanog increases focal adhesion kinase (FAK) promoter activity and expression and directly binds to FAK protein to be phosphorylated[J]. J Biol Chem, 2012,287(22):18656-18673.

[14] Chow JYC, Dong H, Quach KT, et al. TGF-β mediates PTEN suppression and cell motility through calcium-dependent PKC-α activation in pancreatic cancer cells[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2008,294(4):G899-G905.

EffectsofTGF-βonexpressionofgastriccancerstemgenesOct4andNanog

LIXin1,TUOBiguang,WENGuorong,JINHai,ANJiaxing,WANGQianxing,XIERui

( 1DepartmentofCellBiology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

ObjectiveTo investigate the influence of transforming growth factor-β (TGF-β) on the expression of gastric cancer stem genes Oct4 and Nanog in gastric cancer cells.MethodsThe cultured gastric cancer cells MKN45 were divided into the control group, TGF-β (10 ng/mL) group, and TGF-β+BAPTA-AM group. The control group was not treated and the other two groups were stimulated with the corresponding reagent for 24 h. The mRNA and protein expression levels of Nanog and Oct4 were detected by qRT-PCR and Western blotting. High-speed ion imaging system was used to examine the changes of intracellular Ca2+concentrations in gastric cancer MKN45 cells with normal PSS solution (control group), TGF-β (20 ng/ml) (TGF-β group) and intracellular calcium chelator BAPTA-AM (BAPTA-AM group).ResultsCompared with the control group, the mRNA and protein expression levels of Nanog and Oct4 in the TGF-β group were up-regulated (bothP<0.05); compared with the TGF-β group, the mRNA and protein expression levels of Nanog and Oct4 in the TGF-β+ BAPTA-AM group were down-regulated (bothP<0.05). Compared with the control group, the intracellular calcium increased in the TGF-β group (P<0.05); compared with the TGF-β group, the intracellular calcium decreased in the BAPTA-AM group (P<0.05).ConclusionTGF-β could enhance the expression of cancer stem genes Oct4 and Nanog in gastric cancer cells by increasing the intracellular calcium concentration.

gastric carcinoma; transforming growth factor-β; cytokines of tumor cells; Nanog; Oct4

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.002

R735.2

A

1002-266X(2017)45-0005-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81660412)；遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院博士科研啟動(dòng)基金[院字(2015)08號(hào)]。

李欣(1990-)，女，碩士研究生，主要從事消化系統(tǒng)惡性腫瘤的研究。E-mail：18786221478@163.com

王乾興(1974-)，男，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事惡性腫瘤的研究。E-mail：317002641@qq.com；謝睿(1984-)，女，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事消化系惡性腫瘤的研究。E-mail： xr19841029@aliyun.com

2017-09-10)