川芎、當歸雙提法提取工藝及揮發(fā)油包合工藝研究

王美玲 倪健 郭琳 陳功森 于穎超 游龍?zhí)? 張海英 尹興斌 曲昌海

摘要：目的 優(yōu)選川芎、當歸雙提法提取及揮發(fā)油包合的最佳工藝。方法 以揮發(fā)油提取量、水提液中阿魏酸提取量為指標，采用單因素試驗考察提取工藝；以揮發(fā)油包合率及包合物得率為評價指標，采用飽和水溶液法，進行L9（34）正交試驗，優(yōu)選揮發(fā)油的包合工藝。結(jié)果 川芎、當歸的最佳提取工藝為：飲片不浸泡，加8倍量水，提取8 h。提取工藝驗證試驗顯示，揮發(fā)油平均提取量為1.23 mL，水提液中阿魏酸平均提取量為0.387 9 mg/g。最佳包合工藝為：油（mL）∶β-環(huán)糊精（g）=1∶8，溫度40 ℃，包合3 h。包合工藝驗證試驗顯示，揮發(fā)油包合率、包合物得率平均值分別為74.89%、72.81%。結(jié)論 本試驗優(yōu)選的川芎、當歸雙提法提取工藝及揮發(fā)油包合工藝穩(wěn)定可行，可為制劑生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

關(guān)鍵詞：川芎；當歸；阿魏酸；雙提法；β-環(huán)糊精；包合工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.015

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0068-05

Abstract： Objective To optimize ambi-extracting and inclusion process of volatile oil from Chuanxiong Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix. Methods With yield ratio of volatile oil and ferulic acid content in water extract as evaluation indexes， single factor experiments were used to study the extraction process. With the inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion as evaluation indexes， saturated aqueous solution was used to L9 （34） orthogonal experiments to reach optimum inclusion process. Results The optimum extraction process of Chuanxiong Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix was extracted for 8 hours with 8 folds the amount of water， and without soaking. The validation experiments of extraction of volatile oil and ferulic acid content in water extract were 1.23 mL and 0.387 9 mg/g. The optimum conditions of inclusion process were as follows： volatile oil （mL）： β-CD （g） was 1：8； inclusion temperature was 40 ℃； inclusion time was 3 hours. The validation experiments of inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion were 74.89% and 72.81%. Conclusion Optimum ambi-extracting and inclusion process of volatile oil from Chuanxiong Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix are feasible and stable， witch can provide certain supporting data for preparation production.

Keywords： Chuanxiong Rhizoma； Angelicae Sinensis Radix； ferulic acid； ambi-extracting； β-CD； inclusion process

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效，用于胸痹頭痛、胸脅刺痛、跌仆腫痛、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)痛經(jīng)、癥瘕腹痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛[1]40。當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便功效，用于血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)痛經(jīng)、虛寒腹痛、跌撲損傷、癰疽瘡瘍、腸燥便秘[1]133。兩藥常作為藥對配伍使用，增強活血化瘀、養(yǎng)血和血功效[2]。川芎主要成分有揮發(fā)油類、生物堿類、酚類及有機酸類等[3]。當歸主要成分有揮發(fā)油類、苯酞類、有機酸類、多糖類、黃酮類等[4]。以往文獻報道多以揮發(fā)油提取量作為單一考察指標[4-7]，未綜合考慮水提液中其他有效成分的提取情況。由于水提液中存在一些有效成分，如阿魏酸是川芎和當歸的共有成分且為兩藥的指標性成分，而這類成分熱穩(wěn)定性較差，長時間加熱提取會分解[8]，導(dǎo)致提取量降低，可能影響藥效。基于這一考慮，本試驗采用雙提法，以揮發(fā)油和阿魏酸提取量作為考察指標，研究提取過程中二者的變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，以揮發(fā)油提取量為主要考察因素，兼顧阿魏酸提取量，確定最優(yōu)揮發(fā)油提取工藝，并進一步采用飽和水溶液法對揮發(fā)油進行β-環(huán)糊精（β-CD）包合[9]，優(yōu)化包合工藝，為制劑研究及大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（島津公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京市中興偉業(yè)儀器有限公司），BT125D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司），JY5002電子天平（上海衡平儀器儀表廠），DZ-2BC型真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

川芎飲片（批號501002913）、當歸飲片（批號601003692），北京同仁堂（亳州）飲片公司；阿魏酸對照品（批號110773-201614），中國食品藥品檢定研究院；β-環(huán)糊精（β-CD，批號20160917），分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所；甲醇（色譜純）、甲醇（分析純）、無水乙醇，北京化工廠；娃哈哈純凈水、高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取工藝考察

按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄2204揮發(fā)油測定法（甲法）提取川芎、當歸揮發(fā)油。以揮發(fā)油提取量為指標，采用單因素試驗考察浸泡與否、加水倍量對揮發(fā)油提取工藝的影響；以揮發(fā)油提取量及水提液中阿魏酸含量為指標，采用單因素試驗考察提取時間對提取工藝的影響。川芎、當歸揮發(fā)油為淡黃色透明液體，密閉于4 ℃環(huán)境備用。

2.1.1 浸泡與否

稱取川芎、當歸飲片各150 g，共2份，加入8倍量水，分別浸泡0、8 h，加熱提取，提取14 h的揮發(fā)油提取量見圖1。揮發(fā)油提取量隨提取時間延長而增加，增長趨勢逐漸變緩，提取到14 h時不再增加。浸泡8 h與不浸泡的揮發(fā)油提取總量分別為1.46、1.40 mL，揮發(fā)油含量分別為0.49%、0.47%?？梢姡? h與不浸泡對揮發(fā)油提取量影響不大，故提取工藝選擇不浸泡直接提取。

圖1 不同浸泡條件下?lián)]發(fā)油提取量-時間曲線

2.1.2 加水倍量

稱取川芎、當歸飲片各150 g，共3份，分別加入6、8、10倍量水，提取12 h，記錄不同時間揮發(fā)油提取量，在提取過程中通過控制回流的滴速控制加熱條件的一致性，結(jié)果見圖2。不同加水倍量條件下的揮發(fā)油提取量略有不同?？傮w來看，加8倍量水的揮發(fā)油提取量最大，加10倍量水的揮發(fā)油提取量最小。綜合考慮，提取工藝選擇加8倍量水。

圖2 不同加水倍量條件下12 h揮發(fā)油提取量-時間曲線

2.1.3 阿魏酸含量測定

2.1.3.1 色譜條件

采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-1%冰醋酸水溶液（30∶70），柱溫30 ℃，檢測波長321 nm，流速1.0 mL/min[1]41。色譜圖見圖3。

2.1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取阿魏酸對照品5.32 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密移取1 mL溶液，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.021 3 mg/mL阿魏酸對照品溶液。

2.1.3.3 供試品溶液的制備

將水提液搖勻，取溶液5 mL，冷卻后搖勻，取1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 提取時間

稱取川芎、當歸飲片各150 g，共3份，加8倍量水，提取12 h，每小時記錄揮發(fā)油提取量，并測定該時間點阿魏酸提取量，在提取過程中通過控制回流滴速控制加熱條件的一致性，結(jié)果見圖4。

可以看出，揮發(fā)油提取量隨著提取時間的延長不斷增加，阿魏酸提取量則在2 h左右達到最大值，隨后不斷減少。揮發(fā)油提取量最大值為1.50 mL，阿魏酸提取量最大值為0.572 0 mg/g。由于兩者趨勢不同，在選擇最終工藝時，需結(jié)合其他因素和研究最終確定。本試驗以揮發(fā)油作為主要考慮因素，可以看到，在8 h時揮發(fā)油提取量達到1.25 mL，占揮發(fā)油提取總量的83.33%，之后揮發(fā)油量的增速開始減緩；而該時間點的阿魏酸提取量為0.393 0 mg/g，占最大提取量的68.71%。按揮發(fā)油為主、二者兼顧的原則綜合考慮，提取工藝選擇提取時間為8 h。

2.1.5 提取工藝驗證試驗

按照優(yōu)選的揮發(fā)油提取工藝，即川芎、當歸飲片各150 g，不浸泡，加8倍量水，提取8 h，平行進行3次驗證試驗，結(jié)果見表1。平均揮發(fā)油提取量為1.23 mL，平均阿魏酸提取量為0.387 9 mg/g，RSD分別為2.85%、4.68%，均在5%以內(nèi)，表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 揮發(fā)油包合工藝考察

2.2.1 空白回收率試驗

取1 mL揮發(fā)油于500 mL圓底燒瓶中，加入水200 mL，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄2204揮發(fā)油測定法（甲法）測定，測得揮發(fā)油的空白回收率為73%。

2.2.2 正交試驗設(shè)計

本試驗選擇飽和水溶液法對揮發(fā)油進行包合。在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選擇揮發(fā)油包合率和包合物得率為評價指標，考察油（mL）與β-CD（g）比例、包合溫度、包合時間對包合工藝的影響。因素水平見表2。

2.2.3 包合物的制備

稱取規(guī)定質(zhì)量的β-CD于錐形瓶中，分別加入蒸餾水60、80、100 mL，于設(shè)定溫度的水浴鍋中加熱溶解，制成β-CD飽和溶液，置于磁力攪拌器上恒溫。揮發(fā)油1 mL加無水乙醇制成50%（V/V）無水乙醇溶液，緩慢加入β-CD溶液中，封口，定速攪拌至規(guī)定時間，冷卻至室溫，放入冰箱，冷藏24 h。取出，放至室溫后抽濾，包合物用適量水洗滌，再用10 mL無水乙醇洗滌，濾層及濾紙一起取出，置于30 ℃干燥箱中干燥5 h，即得。

2.2.4 揮發(fā)油包合率及包合物得率的測定

剪9個大小相等的濾紙，稱定質(zhì)量（M1），將抽濾過的包合物及濾紙干燥后稱定質(zhì)量（M2），則包合物質(zhì)量M=M2-M1。稱量得1 mL揮發(fā)油的質(zhì)量為1.10 g，計算包合物得率。包合物得率（%）=包合物質(zhì)量÷（加入β-CD質(zhì)量+1 mL揮發(fā)油質(zhì)量）×100%。分別取以上試驗干燥好的包合物，置于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，連接揮發(fā)油提取裝置，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄2204揮發(fā)油測定法（甲法）提取揮發(fā)油，保持微沸5 h，至揮發(fā)油量不再增加，計算揮發(fā)油包合率。揮發(fā)油包合率（%）=包合物中揮發(fā)油測得值÷加入揮發(fā)油量÷空白回收率×100%。正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4、表5。

從揮發(fā)油包合率直觀分析可以看出，最優(yōu)工藝為A2B2C3，從方差分析結(jié)果可知，A、B因素P>0.05，C因素P<0.05，說明包合時間對試驗結(jié)果有顯著影響，油（mL）與β-CD（g）比例、包合溫度對試驗結(jié)果無顯著影響。從包合物得率直觀分析可以看出，最優(yōu)工藝為A2B3C3，從方差分析結(jié)果可知，A、B、C三因素均無顯著影響。故綜合考慮，最終確定最佳工藝為A2B2C3，即：油（mL）∶β-CD（g）=1∶8，40 ℃包合3 h。

2.2.5 包合工藝驗證試驗

按照優(yōu)選的揮發(fā)油最佳包合工藝進行3批平行驗證試驗，結(jié)果見表6。平均揮發(fā)油包合率為74.89%，平均包合物得率72.81%，與正交試驗表中最佳結(jié)果大致相同，說明該包合工藝能夠較好包合揮發(fā)油。RSD分別為4.60%、3.74%，均在5%以內(nèi)，表明該包合工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本試驗優(yōu)化川芎、當歸揮發(fā)油提取工藝及包合工藝，確定提取工藝為飲片不浸泡、加8倍量水、提取8 h，包合工藝為油（mL）∶β-CD（g）=1∶8、溫度40 ℃、包合3 h。該提取工藝使揮發(fā)油能較充分提取，同時盡可能保留水提液中有效成分。

川芎、當歸水提液及揮發(fā)油的藥理作用十分廣泛。水提液中川芎嗪能改善心肌缺血腦缺血，抑制血管收縮，舒緩血管平滑肌，改善血流變[10-11]；阿魏酸有抗血小板凝聚的作用[12]；當歸多糖通過刺激與造血相關(guān)的細胞、分子等修復(fù)造血功能[12]；川芎揮發(fā)油能明顯降低動物全血黏度、血漿濃度、紅細胞比容和纖維蛋白原濃度[13]；當歸揮發(fā)油能擴張外周及冠狀血管、降低血壓及血管阻力[14]；當歸內(nèi)酯具有改善局灶性腦缺血的作用[15]；當歸、川芎揮發(fā)油中的共有成分藁本內(nèi)酯具有抗動脈粥樣硬化、改善微循環(huán)、舒張血管、抗心肌缺血的作用[16]?？梢姡ㄜ?、當歸二者配伍，共同發(fā)揮活血化瘀、養(yǎng)血和血的作用。在后續(xù)研究中，需要結(jié)合藥效試驗等確定揮發(fā)油提取量和阿魏酸提取量的指標權(quán)重，以便更好地優(yōu)選生產(chǎn)和研究中的工藝。

本試驗所得揮發(fā)油包合率偏低。綜合分析，影響揮發(fā)油包合效果的因素除包合溫度、包合時間、油與β-CD比例外，還有冷卻時間、冷卻溫度、無水乙醇沖洗是否徹底等，后續(xù)將進一步研究其他因素對揮發(fā)油包合率的影響。

川芎、當歸混合揮發(fā)油是輕油重油混合油，整體偏重，測量時難以準確讀數(shù)。本研究對揮發(fā)油提取器進行了改進，使提取器可以同時讀取上層和下層揮發(fā)油體積，使試驗準確度提高。改進之處為：①揮發(fā)油儲蓄管全刻度，使輕油重油在上層或下層均可讀??；②蒸餾水回流管口移至中間位置，使上下層揮發(fā)油均有一定儲蓄體積。提取時輕油會早于重油提出，滴速過大則將冷凝的油敲碎而隨水流回，過小則會延長提取時間，故在提取時須嚴格控制回流滴速。

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