PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取歐李種仁蛋白研究

孫雁霞，羅 倩，時羽杰，李 杰，田計均，唐 媛，鄔曉勇

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取歐李種仁蛋白研究

孫雁霞，羅 倩，時羽杰，李 杰，田計均，唐 媛，鄔曉勇

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

利用聚乙二醇(PEG)4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取歐李種仁蛋白.研究了PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系的體系組成對蛋白分配系數(shù)及回收率的影響，最后確定了最佳的雙水相萃取體系.在18%的(NH4)2SO4與10%的聚乙二醇構(gòu)成的雙水相體系中，蛋白的分配系數(shù)最小為0.495，回收率為92.0%.對體系的最大萃取容量測定結(jié)果表明，雙水相體系易于放大和進(jìn)行連續(xù)性操作，適用于大規(guī)模生產(chǎn)活性蛋白.

雙水相萃??；PEG 4000/(NH4)2SO4體系；歐李；種仁蛋白

0 引 言

歐李為薔薇科櫻桃屬落葉小灌木，為我國特有的果實和藥食兼用樹種[1].歐李種仁也稱郁李仁，其主要成分包括苦杏仁苷、歐李種仁油與歐李種仁蛋白，歐李種仁蛋白組成中谷氨酸含量很高，有改善神經(jīng)系統(tǒng)的功效[2-3].一般蛋白的提取與分離通常采用硫酸銨鹽析法，但蛋白的活性和構(gòu)象在過高濃度的鹽離子中容易遭到破壞.而雙水相方法則是利用高聚物與無機(jī)鹽體系的水溶液所形成的互不相容的兩相，通過構(gòu)建適宜的成相條件，使蛋白質(zhì)等活性生物大分子在兩互不相容的水相中具有不同的分配系數(shù)，從而使蛋白得到分離與純化[4-7].該方法不僅避免了傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取對蛋白造成的破壞，同時也為生物活性物質(zhì)的純化提供了溫和的水相環(huán)境，而且具有分離高效、成本低廉、高回收率和工業(yè)上易于放大的特點.

目前，在蛋白質(zhì)的分離與分析等方面，科研人員已做了大量的工作，蛋白質(zhì)的分離純化方法相對比較完善[4-6]，但針對歐李種仁蛋白質(zhì)的提取工藝研究相對較少.對此，本研究采用雙水相萃取技術(shù)[7]，通過篩選優(yōu)化提取條件，建立了適宜歐李種仁蛋白的雙水相萃取體系.

1 材料、儀器與方法

1.1 材 料

實驗所用的歐李來自于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院.

實驗所用試劑包括：考馬斯亮藍(lán)G-250、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、PEG 4000、(NH4)2SO4、石油醚、乙醇、NaCl、95%乙醇等，購于成都科龍化工有限公司，均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：精密電子天平(上海速展機(jī)電公司)，旋渦混合器(沃信儀器制造有限公司)，Unico紫外可見分光光度計(上海光學(xué)儀器公司).

1.3 方 法

1.3.1 歐李種仁蛋白制備.

成熟的歐李種子，手工去殼后置干燥箱干燥備用.將干燥歐李種仁研磨成粉末，用2倍體積的石油醚脫脂，于通風(fēng)處風(fēng)干后用文獻(xiàn)[4]中的堿提酸沉的方法獲得種仁蛋白，經(jīng)冷凍干燥后備用.

1.3.2 試劑配制.

1)考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的配制.精確稱取0.1 g考馬斯亮藍(lán)G-250，用50 mL 95%的乙醇溶解，之后加入100 mL 85%濃磷酸，然后轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶并用水定容至刻度線，反復(fù)搖勻后靜置24 h，之后過濾置棕色瓶中避光備用.

2)牛血清蛋白原液的配制.精確稱取0.10g牛血清白蛋白，用生理鹽水稀釋并定容至100 mL容量瓶中，混勻，制得濃度為1 mg/mL的牛血清蛋白原液.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白制定標(biāo)準(zhǔn)曲線.

將牛血清蛋白原液稀釋10倍以后，在7支試管中(一支為空白對照)，分別精確吸取稀釋后的牛血清白蛋白原液0.00 mL(空白調(diào)零)，0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL、0.70 mL、0.90 mL、1.00 mL，用生理鹽水全部稀釋至1.0 mL，然后分別加入5.00 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，混合均勻，立即于波長595 nm條件下比色測定.以試管中標(biāo)準(zhǔn)蛋白的總含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并作線性回歸，求線性方程.

1.3.4 雙水相體系相圖制備.

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的(NH4)2SO4溶液并測定其密度，將此溶液裝入滴定管備用.

精確稱取0.2 g PEG 4000溶解于0.8 g蒸餾水中，用滴定管緩慢滴加(NH4)2SO4溶液并不斷振蕩使其混合均勻，觀察溶液的澄清程度，直至溶液開始出現(xiàn)渾濁為止.記錄(NH4)2SO4溶液的加量(mL)，并根據(jù)密度值求出質(zhì)量(g).然后再加入固定體積(0.5 mL)的蒸餾水，溶液澄清，繼續(xù)重復(fù)上述操作，直至再次達(dá)到渾濁.如此反復(fù)操作10次并計算每次達(dá)到渾濁時PEG 4000和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/g).以PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，即可得到一條PEG4000和(NH4)2SO4的雙水相相圖.

1.3.5 雙水相體系制備.

1)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為18%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 4000組成雙水相體系，加入1 mL牛血清白蛋白原液，pH調(diào)至中性，置于4 ℃萃取，待完全分層后，測定各雙水相體系蛋白質(zhì)的上下相的分配系數(shù)、相比以及下相萃取率.加樣情況見表1，選擇分配系數(shù)最小的作為最適PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

表1 PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系A(chǔ)組成

2)PEG4 000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為10%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4組成雙水相體系，加入牛血清白蛋白原液，pH調(diào)至中性，置于4 ℃萃取，待完全分層后，測定各雙水相體系蛋白質(zhì)的上、下相的分配系數(shù)、相比以及下相萃取率.加樣情況見表2，選擇分配系數(shù)最小的組作為最適的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù).

表2 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系B組成

3)雙水相體系蛋白質(zhì)的分配系數(shù)、回收率及相比計算公式為，

分配系數(shù)，K=C上/C下

相比，R=V上/V下

回收率(%)，Y上=C上V上/(C上V上+C下V下)

Y下=C下V下/(C上V上+C下V下)

式中，C上、C下分別代表上、下相蛋白質(zhì)濃度；V上、V下分別代表上、下相的體積.

1.3.6 雙水相體系中蛋白質(zhì)最大萃取容量測定.

分別以“1.3.5”項下確定的最佳的PEG 4000和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)組成雙水相體系，加入稀釋后的歐李種仁蛋白溶液，不斷反復(fù)操作，直至溶液由渾濁變澄清記錄滴加蛋白溶液的量，并計算出下相中蛋白的含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照“1.3.3”項下的方法，在波長595 nm條件下測得各梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的吸光度值.據(jù)吸光度值制作出牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.回歸方程為，y=5.8767x+0.0992，R2=0.9991，表明蛋白濃度在0.01～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)蛋白質(zhì)的測定.

圖1牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 PEG/(NH4)2SO4雙水相相圖

精確稱取(NH4)2SO4固體30 g加入70 g蒸餾水溶解，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的(NH4)2SO4溶液.測定其密度為1.1266 g/mL.通過反復(fù)操作，記錄加入(NH4)2SO4溶液的體積(mL)，計算出純(NH4)2SO4的累計量(g)，PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)，結(jié)果如表3所示.

表3 雙水相相圖制作數(shù)據(jù)記錄表

通過表3中PEG 4000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)制作出雙水相相圖如圖2所示.

圖2 PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相相圖

2.3 水相中分配系數(shù)、相比計算及最佳條件確定

(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為18%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 4000組成雙水相體系，在595 nm處測得溶液的吸光度，結(jié)果如表4所示.

表4 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系A(chǔ)數(shù)據(jù)

PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為10%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4組成雙水相體系，通過分光光度計在595 nm處測得溶液的吸光度值，結(jié)果如表5所示.

表5 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系B數(shù)據(jù)

注：項目1的“/"表示加入蛋白后破壞了雙水相體系兩相的組成使其無法分層，故未統(tǒng)計數(shù)據(jù).

通過表4中溶液上、下相的體積(mL)和溶液的吸光度(A)計算出雙水相體系A(chǔ)中蛋白在兩相中的分配系數(shù)、相比、回收率的數(shù)據(jù)，結(jié)果如表6所示.

表6 雙水相體系A(chǔ)中蛋白質(zhì)K、R、Y的數(shù)據(jù)

通過表5中溶液上、下相的體積(mL)和吸光度(A)計算出雙水相體系B中蛋白在兩相中的的分配系數(shù)、相比、回收率的數(shù)據(jù)，結(jié)果如表7所示.

表7 雙水相體系B蛋白質(zhì)K、R、Y的數(shù)據(jù)

2.3.1 PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對蛋白萃取的影響.

隨著PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加(見表6)，分配系數(shù)K先下降后上升且變化較大，Y下先增大后減小，并在PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，K和Y下均達(dá)到最佳值.在總體趨勢中，相比R先下降后上升.由于在PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%時，K最小，為0.496，Y下為91.0%，因此，最佳提取條件的PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%.

2.3.2 (NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取的影響.

當(dāng)固定PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)量時(見表7)，分配系數(shù)K隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降，當(dāng)(NH4)2SO4濃度超過18%時，分配系數(shù)K又逐漸上升.總趨勢相比R先下降后上升，Y下先升高后降低.(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時，分配系數(shù)K最小，為0.495，而Y下最大達(dá)92.0%，由此可知，最適萃取條件的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%.

2.3.3 雙相體系最佳條件確定.

通過上述數(shù)據(jù)的分析，確定該雙相體系下最佳條件為：(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%.

2.4 雙水相體系最大萃取容量確定

在確定了最佳雙水相體系的組成后，利用(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%組成雙水相體系.測定體系的總體積為50 mL，通過滴加稀釋的歐李蛋白溶液，記錄滴加蛋白溶液的最大量為18.9 mL.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得在本雙水相體系下蛋白質(zhì)的最大容量為1.739 mg.根據(jù)表6和表7中Y下的值估算出下相中蛋白的量為1.600 mg.因此，通過實驗確定的最佳雙水相萃取體系的蛋白萃取率為92.0%.

3 結(jié) 論

據(jù)雙水相分配理論，(NH4)2SO4可影響體系上、下相的電位差，進(jìn)而影響蛋白的分配系數(shù)和萃取率.而高濃度的(NH4)2SO4導(dǎo)致蛋白發(fā)生鹽析，進(jìn)而使蛋白萃取率下降，同時還會擾亂雙水相系統(tǒng)，改變體系中成相物質(zhì)的組成和相比[6-7].本實驗利用聚乙二醇(PEG)4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取歐李種仁蛋白,在18%的(NH4)2SO4與10%的聚乙二醇構(gòu)成的雙水相體系中，蛋白的分配系數(shù)最小為0.495，回收率為92.0%.對體系的最大萃取容量測定結(jié)果表明，雙水相體系易于放大和進(jìn)行連續(xù)性操作，適用于大規(guī)模生產(chǎn)活性蛋白.

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StudyonExtractionofSeedKernelProteinfromPrunusHumilisbyPEG4000/(NH4)2SO4AqueousTwo-phaseSystem

SUNYanxia,LUOQian,SHIYujie,LIJie,TIANJijun,TANGYuan，WUXiaoyong

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The seed kernel protein was extracted from Prunus humilis PEG4000/(NH4)2SO4aqueous two-phase system.The paper studied the effects of composing mechanism the PEG4000/(NH4)2SO4aqueous two-phase system on the recovery rate and the protein distribution coefficients,and then the best aqueous two-phase extraction system was determined.The minimum protein distribution coefficient was 0.495 and the maximum protein recovery rate was 92.0% in the aqueous two-phase system which was constituted by 18%(NH4)2SO4and 10% PEG4000 constituted by polyethylene glycol.The results obtained from the test of the maximum extraction capacity of the system showed that the aqueous two-phase system was suitable for large-scale active protein extraction and easy to be zoomed and continuously operated.

aqueous two-phase extraction;PEG4000/(NH4)2SO4system;Cerasus humilis;seed kernel protein

TQ464.7

A

1004-5422(2017)04-0338-04

2017-09-26.

食品加工與應(yīng)用四川省高校重點實驗室科研基金(14-S03)、 成都大學(xué)藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室開放基金(10Y201409)資助項目.

孫雁霞(1976 — )，女，博士，副教授，從事植物生物技術(shù)研究.