ⅢA-N2期非小細(xì)胞肺癌組織TYMS基因mRNA表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性研究

李 喆，楊 揚(yáng)，劉延風(fēng)，許瑞彬，戎鐵華，張?zhí)m軍△

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，陜西延安 716000；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心胸科/華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510060)

論著·臨床研究

ⅢA-N2期非小細(xì)胞肺癌組織TYMS基因mRNA表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性研究

李 喆1，楊 揚(yáng)1，劉延風(fēng)1，許瑞彬1，戎鐵華2，張?zhí)m軍2△

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，陜西延安 716000；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心胸科/華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510060)

目的探討ⅢA-N2期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織胸苷酸合成酶(TYMS)基因mRNA表達(dá)與表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的相關(guān)性。方法分別用分支DNA-液相芯片法及突變富集-液相芯片法檢測(cè)30例病理分期為ⅢA-N2期的NSCLC組織TYMS mRNA表達(dá)及EGFR基因19號(hào)及21號(hào)外顯子突變狀況，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行整理分析。結(jié)果30例患者中，TYMS mRNA低表達(dá)14例(46.7%)，中偏低表達(dá)7例(23.3%)，中表達(dá)7例(23.3%)，中偏高表達(dá)0例，高表達(dá)2例(6.7%)；12例檢出EGFR基因突變，突變率為40.0%，其中6例為19外顯子缺失突變，6例為21外顯子置換突變。TYMS mRNA表達(dá)水平與EGFR突變相關(guān)，EGFR突變多發(fā)生在TYMS mRNA較低表達(dá)水平的患者腫瘤組織中(Z=-2.604,P=0.009)。結(jié)論NSCLC組織中TYMS mRNA表達(dá)與EGFR基因突變相關(guān)，可為今后臨床中針對(duì)不同條件的患者相關(guān)藥物的選用提供參考。

癌，非小細(xì)胞肺；胸苷酸合成酶；受體，表皮生長因子；基因表達(dá)；基因突變

肺癌目前已成為惡性腫瘤相關(guān)死亡的首要原因，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)約占總發(fā)病率的80%[1-3]。即使采取積極的治療，NSCLC患者的5年生存率仍然很低。隨著全球范圍內(nèi)腫瘤學(xué)研究者的不斷努力，目前對(duì)NSCLC的治療逐漸從傳統(tǒng)治療向個(gè)體化、精準(zhǔn)醫(yī)療轉(zhuǎn)變，在基因?qū)用嬲页鏊幬镒饔冒悬c(diǎn)，提高藥物療效。胸苷酸合成酶(TYMS)是催化體內(nèi)胸苷酸合成所必需的酶，是腫瘤生長的重要因子，為葉酸類似物氨甲蝶呤和培美曲塞的治療靶點(diǎn)。培美曲塞目前已成為NSCLC中非鱗癌患者的一線用藥，其療效與TYMS基因mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[4-6]。以表皮生長因子受體(EGFR)基因突變?yōu)榘悬c(diǎn)的絡(luò)氨酸激酶受體抑制劑(TKIs)目前也被納入一線治療方案以治療存在EGFR基因突變的NSCLC患者。培美曲塞和EGFR-TKIs均以NSCLC患者為治療對(duì)象，雖然前者不推薦鱗癌患者使用，但二者在患者選擇上存在很大的交集。本研究旨在分析培美曲塞與EGFR-TKIs所針對(duì)的基因靶點(diǎn)是否存在一定的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集中山大學(xué)腫瘤防治中心及延安大學(xué)附屬醫(yī)院2015年6月至2016年6月收治的手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)且分期為ⅢA-N2期的30例患者NSCLC組織標(biāo)本及完整的病例資料。所有患者均行肺癌根治術(shù)(原發(fā)瘤體肺葉完整切除+縱隔淋巴結(jié)清掃)，術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療(包括化療、靶向治療及放療)。30例患者中男18例，女12例；年齡44～69歲，平均(55.87±1.39)歲；16例(53.3%)患者有吸煙史，

圖1 TYMS mRNA表達(dá)區(qū)分圖

14例(46.7%)患者無吸煙史；按照世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型：鱗癌8例(26.7%)，腺癌17例(56.7%)，其他病理類型5例(16.7%)；病理分期：高度分化(G1期)2例(6.7%)，中度分化(G2期)7例(23.3%)，低分化(G3期)17例(56.7%)，未分化(G4期)4例(13.3%)。

1.2方法 分別用分支DNA-液相芯片法及突變富集-液相芯片法檢測(cè)NSCLC組織TYMS mRNA表達(dá)及EGFR基因19號(hào)及21號(hào)外顯子突變狀況，由廣州益善生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.1TYMS mRNA表達(dá)的檢測(cè) 甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織標(biāo)本按照以下步驟處理。將樣品于均質(zhì)溶液中65 ℃處理2 h，反應(yīng)后的混合物離心，去除殘留的石蠟和碎片，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，96孔板每孔加入40 μL樣品混合液，再加入18.5 μL無RNA酶的去離子水、33.3 μL裂解液、2 μL阻斷劑、1 μL磁珠和5 μL特異結(jié)合目標(biāo)基因的探針。將96孔板密封后54 ℃ 750 r/min搖床孵育18 h，再用96孔過濾板過濾混合物。真空狀態(tài)下，用250 μL洗滌緩沖液(0.1×SSC和0.03%鋰十二烷基硫酸鈉)洗滌3次，去除未結(jié)合的RNA和其他雜質(zhì)，再通過相關(guān)步驟檢測(cè)結(jié)合的目標(biāo)mRNA。用Luminex 200系統(tǒng)分析樣品的熒光值，代入建立的特定人群檢測(cè)數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為百分比，特定人群數(shù)據(jù)庫中mRNA表達(dá)水平在人群中25%、75%的位置為兩條主要分界線，以此區(qū)分低和中、中和高表達(dá)，其中中表達(dá)又以40%、60%細(xì)分為中偏低、中及中偏高表達(dá)，最后分為低表達(dá)、中偏低表達(dá)、中表達(dá)、中偏高表達(dá)和高表達(dá)。

1.2.2EGFR基因突變的檢測(cè) 首先用DNA提取試劑盒提取組織標(biāo)本DNA，通過多重PCR獲得各基因外顯子上含有常見等位基因型的基因片段；再將PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸外切酶酶切及堿性磷酸酶水解，去除多余的引物和dNTP；產(chǎn)物再以等位基因特異性引物延伸(ASPE)特異地識(shí)別各等位基因，并形成延伸產(chǎn)物；ASPE引物上的Tag序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結(jié)合(雜交反應(yīng))，37 ℃雜交30 min后加入25 μL 鏈霉素親和素-藻紅蛋白(SA-PE)工作液，繼續(xù)37 ℃反應(yīng)10 min，用Luminex 200系統(tǒng)分析樣品的熒光值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，二分類變量資料的分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；有序多分類資料比較采用Kruskal WallisH檢驗(yàn)；采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)有序多分類資料與二分類變量間的關(guān)系進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TYMS mRNA表達(dá)與EGFR基因突變情況 TYMS mRNA表達(dá)區(qū)分圖見圖1，圖中每個(gè)圓圈代表一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。30例患者NSCLC組織TYMS mRNA低表達(dá)者14例(46.7%)，中偏低表達(dá)者7例(23.3%)，中表達(dá)者7例(23.3%)，中偏高表達(dá)者0例，高表達(dá)者2例(6.7%)。30例患者NSCLC組織EGFR突變率為40.0%(12/30)，其中6例(20.0%)為19外顯子缺失突變，6例(20.0%)為21外顯子置換突變。

2.2TYMS mRNA表達(dá)、EGFR基因突變與患者臨床病理特征的關(guān)系 30例患者NSCLC組織標(biāo)本TYMS mRNA表達(dá)及EGFR基因突變與各臨床病理特征無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 TYMS mRNA表達(dá)、EGFR基因突變與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3TYMS mRNA表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性 12例EGFR基因突變者TYMS mRNA表達(dá)水平中位數(shù)及范圍為1(1～3)，18例野生型EGFR基因患者TYMS mRNA表達(dá)水平中位數(shù)及范圍為2(1～5)，TYMS mRNA表達(dá)水平與EGFR基因突變明顯相關(guān)，EGFR突變多發(fā)生在TYMS mRNA較低表達(dá)水平者腫瘤組織中(Z=-2.604，P=0.009)。

3 討 論

基于患者的臨床、病理特征選擇NSCLC化療方案只有少數(shù)患者獲益，其有效率僅20%～40%，平均生存時(shí)間為8～10個(gè)月，5年生存率低于15%，此外部分患者有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，個(gè)體化、精準(zhǔn)醫(yī)療逐漸被廣大學(xué)者提倡，從基因?qū)用鎸で蟾嗨幬镒饔冒悬c(diǎn)，選擇精確、不良反應(yīng)小的藥物，使更多的患者受益，增加患者生存率。

目前NSCLC患者以腺癌最為常見，而EGFR基因突變通常發(fā)生在亞裔、女性、不吸煙及腺癌患者中[1，7]，這些患者往往能從EGFR-TKIs治療中獲益。培美曲塞目前作為非鱗癌患者化療的一線用藥，主要針對(duì)腺癌患者，部分研究發(fā)現(xiàn)其靶點(diǎn)基因TYMS mRNA在男性、吸煙及非腺癌患者中高表達(dá)[8-10]。培美曲塞與EGFR-TKIs針對(duì)的患者存在很大的交集，其作用的靶點(diǎn)基因是否存在一定的相關(guān)性尚不明確。本研究結(jié)果顯示，培美曲塞所作用的靶點(diǎn)基因TYMS mRNA表達(dá)水平與EGFR基因突變存在明顯的相關(guān)性，EGFR基因突變多發(fā)生在TYMS mRNA較低表達(dá)水平的患者腫瘤組織中(P=0.009)。

著名的國際Ⅲ期注冊(cè)臨床研究LUX-Lung 3比較了EGFR-TKIs藥物阿法替尼與化療藥物培美曲塞聯(lián)合順鉑治療伴EGFR突變的Ⅲb期或Ⅳ期肺腺癌患者的療效，主要終點(diǎn)為無進(jìn)展生存期(PFS)，結(jié)果顯示：阿法替尼組患者較培美曲塞聯(lián)合順鉑組的PFS顯著延長(11.1個(gè)月vs. 6.9個(gè)月，HR=0.58，P=0.000 4)。值得重視的是，在伴有EGFR突變型(19位點(diǎn)缺失和L858R突變占所有EGFR突變的90%)的患者中，接受阿法替尼治療后中位PFS超過1年(13.6個(gè)月)，而對(duì)照組僅 6.9個(gè)月(P<0.01)[11]。雖然該項(xiàng)臨床研究顯示EGFR基因突變的肺腺癌患者用阿法替尼較化療延長了中位PFS，但后續(xù)的試驗(yàn)及薈萃分析顯示與化療藥物比較，一線應(yīng)用EGFR-TKIs藥物并不能延長EGFR基因突變的NSCLC患者的總生存期[12]。上述臨床試驗(yàn)僅篩選了EGFR基因突變陽性的患者，并未檢測(cè)及篩選針對(duì)鉑類藥物的ERCC1 mRNA及針對(duì)培美曲塞的TYMS mRNA表達(dá)。肺癌化療療效受許多耐藥機(jī)制的影響，為多基因、多步驟綜合作用的結(jié)果。臨床數(shù)據(jù)及本研究結(jié)果顯示，TYMS基因mRNA低表達(dá)及EGFR基因突變?cè)贜SCLC患者中存在很大的交集，所以在今后的臨床試驗(yàn)及臨床用藥中是否應(yīng)該予以考慮值得思考。

本研究TYMS mRNA表達(dá)及EGFR基因突變與臨床病理特征之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性，可能與樣本量較小有關(guān)。但研究發(fā)現(xiàn)TYMS mRNA表達(dá)水平與EGFR基因突變存在明顯的相關(guān)性，EGFR基因突變多發(fā)生在TYMS mRNA較低表達(dá)水平的患者腫瘤組織中。這種腫瘤多基因間的相關(guān)性，提示今后在臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)、臨床藥物選擇中應(yīng)該全方面考慮，探討出更合理的方案，達(dá)到個(gè)體化、精確化用藥。

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StudyoncorrelationbetweenTYMSgenemRNAexpressionandEGFRgenemutationinstageⅢA-N2non-small-celllungcancertissue

LiZhe1，YangYang1，LiuYanfeng1，XuRuibin1，RongTiehua2，ZhangLanjun2△

(1.DepartmentofThoracicSurgery,AffiliatedHospital,Yan′anUniversity,Yan′an,Shaanxi716000,China2.DepartmentofThoracicSurgery/StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthChina,CenterofTumorPreventionandTreatment,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,Guangdong510060,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between TYMS gene mRNA expression level and EGFR mutation in stage ⅢA-N2 non-small-cell lung cancer tissue (NSCLC).MethodsThe branched DNA-liquidchip technology (bDNA-LCT) and mutant-enriched liquidchip (MEL) technology were used to detect the TYMS mRNA expression and EGFR mutations at exon 19 and 21 in NSCLC tissues from 30 patients with stages ⅢA-N2 NSCLC,and the results were analyzed.ResultsAmong 30 cases,low TYMS mRNA expression was in 14 cases (46.7%),middle to low TYMS mRNA expression in 7 cases (23.3%),middle mRNA expression in 7 cases (23.3%),middle to high TYMS mRNA expression in 0 case and high TYMS mRNA expression in 2 cases (6.7%);12 cases of EGFR mutation were detected out with the mutation rate of 40.0%,including 6 cases of exon 19 deletion and 6 cases of exon 21 missense mutation.The TYMS mRNA expression level was correlated with the EGFR mutation.The EGFR mutation commonly occurred in the tumor tissue of the patients with TYMS mRNA low expression (Z=-2.604,P=0.009).ConclusionThe TYMS mRNA expression in NSCLC tissue is correlated with the EGFR gene mutation,which can provide references for the drug selection aiming at the patients with different conditions.

carcinoma，non-small-cell lung；thymidylate synthetase；receptor，epidermal growth factor；gene expression；gene mutation

李喆(1983-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事胸部腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究?！?/p>

，E-mail:zhlanj@mail.sysu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.025

R734.2

A

1671-8348(2017)35-4977-03

2017-07-23

2017-09-30)